Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere la struttura tridimensionale del complesso esosomiale utilizzando il metodo dell'inclinazione conica casuale. Ciò si ottiene depositando prima un sottile strato di film di carbonio sulla griglia di carbonio sacro per creare il substrato di supporto per il complesso proteico e la colorazione come secondo passaggio. Il campione e la macchia vengono applicati sulla griglia, che seppellisce il campione in sali di metallo pesante.

La microscopia elettronica viene quindi eseguita per ottenere coppie di micrografie inclinabili del campione. Infine, si ottengono risultati che mostrano la struttura tridimensionale del complesso esosomiale sulla base dell'analisi delle immagini utilizzando il metodo dell'inclinazione conica casuale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché a volte una buona preparazione del campione per il metodo di inclinazione conica casuale è difficile, così come la procedura per l'elaborazione delle immagini che segue View.

La dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione del grado e del campione sono difficili da apprendere senza un'illustrazione della valutazione del campione. Il principio del metodo dell'inclinazione conica casuale richiede l'acquisizione di una coppia di micrografie della stessa regione di un campione all'interno del microscopio elettronico. Viene scattata una foto del campione in una posizione non inclinata e l'altra foto viene scattata del campione inclinato con un angolo compreso tra 50 e 70 gradi Utilizzando il computer, la coppia di micrografi digitalizzati viene affiancata e in questa illustrazione vengono selezionate immagini delle stesse particelle.

Queste immagini sono contrassegnate da numeri in coordinate tridimensionali. Le immagini delle particelle non inclinate e dei loro partner inclinati sono correlate tra loro dalla direzione dell'asse di inclinazione e dall'angolo di inclinazione. L'allineamento delle immagini delle particelle non inclinate porta le immagini delle particelle inclinate alle loro corrispondenti posizioni aMule utilizzando immagini multiple di particelle inclinate che riempiono lo spazio azimutale, la struttura tridimensionale della molecola può essere ricostruita utilizzando un algoritmo di retroproiezione per fabbricare prima le griglie, preparare una soluzione VAR allo 0,5% aggiungendo 0,45 grammi di resina formale polivinilica, e 90 millilitri di cloroformio in un bicchiere di vetro da 100 millilitri.

In una cappa aspirante, coprire il becher con un foglio di alluminio e sciogliere la resina di forma var. Con gli otto di una piccola ancoretta e un'agitazione magnetica, la resina impiega circa 15 minuti per dissolversi. Nel frattempo, pulire i vetrini per microscopia pre-puliti in metanolo e con salviette Kim.

Dopo che la resina del modulo var è completamente dissolta. Nel cloroformio, aggiungere un millilitro di glicerolo al 50% sulla superficie della soluzione. La regolazione del volume del glicerolo aggiunto influisce sulla densità dei fori nel carbonio sacro.

Inserire la punta di un ultrasonico nella soluzione. A circa un pollice di profondità, usa la massima potenza per sonicare per un minuto, il che creerà un'emulsione di goccioline di glicerolo sotto forma della nostra soluzione. Una sonicazione più lunga causerà buchi di dimensioni inferiori nel carbonio sacro.

La soluzione diventa lattiginosa dopo questo passaggio. Subito dopo l'immersione di sonicazione, il vetro pulito scivola verticalmente nell'emulsione. Per un secondo, estrarli e tamponare il fondo dei vetrini con carta da filtro per formare una sottile pellicola di plastica sulla superficie dei vetrini.

Dopo che il cloroformio è evaporato, controllare la densità e le dimensioni dei fori nel film al microscopio ottico. La condizione di preparazione qui descritta dovrebbe produrre da 10 a 20 fori in ogni quadrato di una griglia a 400 maglie con diametri compresi tra tre e quattro micrometri. Una volta che i vetrini sono asciutti, tagliare il bordo della pellicola di plastica sulla superficie del vetrino.

Far galleggiare la pellicola sulla superficie dell'acqua distillata immergendo verticalmente il vetrino nell'acqua. La sottile pellicola sulla superficie dell'acqua può essere osservata con un angolo di striscio contro il riflesso della luce. Posizionare 400 griglie di rame a maglie sulla pellicola, una per una con la superficie liscia della griglia rivolta verso il basso.

Raccogli la pellicola di plastica con le griglie su di essa usando un pezzo di carta. Capovolgi la carta e lasciala asciugare. In una capsula di Petri, immergere la carta nel metanolo per rimuovere il glicerolo residuo nei fori e lasciare asciugare la carta all'aria.

Utilizzare un evaporatore di carbonio per rivestire le griglie con uno strato di carbonio a uno spessore di circa 20 nanometri. Utilizzo del tempo di evaporazione per controllare lo spessore desiderato. Lo spessore può essere determinato dal colore grigio del carbonio rispetto al colore grigio di uno strato di carbonio di spessore noto.

Immergere le griglie stratificate di carbonio con cloroformio in una capsula di Petri di vetro per mezz'ora per rimuovere la forma var var rimozione, seguita dall'asciugatura delle griglie si ottiene in griglie di carbonio sacro fatte in casa. Successivamente, fai evaporare un sottile strato di carbonio con uno spessore di circa cinque nanometri su una superficie di mica appena tagliata. Quindi metti con cura le griglie di carbone sacro su un pezzo di carta da filtro sotto l'acqua distillata.

In un apparecchio fatto in casa, fai galleggiare il carbone sottile dalla superficie della mica sulla superficie dell'acqua e depositalo lentamente sulle griglie di carbonio sacro. Raccogli la carta da filtro con le griglie e lasciala asciugare. In una cappa aspirante, iniziare la colorazione negativa del complesso esosomiale preparando una soluzione fresca di formiato di orinatoio al 2%.

Come descritto nella procedura scritta, coprire il tubo della soluzione con un foglio di alluminio Per evitare l'esposizione alla luce, la soluzione deve essere utilizzata allo stesso modo. Il bagliore diurno scarica un carbonio sottile su una griglia interamente di carbonio utilizzando un apparato di scarica del bagliore. Quindi, posizionare un pezzo di profumo pulito sul banco, pipettare tre goccioline da 50 microlitri di soluzione di colorante di formiato per orinatoio sopra il perfil, diluire il complesso esosomiale a una concentrazione di circa 50 nanomolari Utilizzando la pipetta tampone di diluizione, quattro microlitri della proteina diluita fino a quando il bagliore non si scarica sulla griglia.

Lasciare che il campione rimanga sulla griglia per un minuto, quindi tamponare la soluzione residua con un pezzo di carta da filtro utilizzando una pinzetta. Capovolgere immediatamente la griglia sopra la prima goccia di macchia e risciacquare la griglia muovendola avanti e indietro più volte per circa 10 secondi. Ripetere questo processo per ciascuna delle tre goccioline di macchia dopo l'ultimo risciacquo, lasciare che la macchia rimanga sulla griglia per un altro minuto.

Quindi tampona la macchia con un pezzo di carta da filtro. Mantenere un sottile strato di soluzione colorante sulla superficie della griglia e lasciare asciugare la griglia in una cappa aspirante. Posizionare la griglia del campione nel supporto del campione e quindi inserire il supporto in un microscopio elettronico FEI TE nine 12.

Controlla la griglia del campione a basso ingrandimento per trovare i migliori quadrati colorati. Un buon quadrato sembra avere una dozzina di fori con dimensioni di circa uno o due micrometri e aree macchiate scure al loro interno. Attiva la modalità a bassa dose dell'interfaccia utente FEI e allinea la messa a fuoco di ricerca e la posizione di esposizione in modalità a bassa dose.

Imposta la ricerca in modalità frazione con una lunghezza della fotocamera di 1,5 metri. Impostare la messa a fuoco su un ingrandimento di 150 K e impostare l'esposizione su un ingrandimento di 50 K con un tempo di esposizione misurato di un secondo. Normalmente, per eseguire l'allineamento viene utilizzata una funzione riconoscibile sulla griglia, sia in modalità di ricerca che in modalità di esposizione.

Trova i fori con una buona colorazione in modalità di ricerca e salva le posizioni. Scatta una foto CCD della piazza. Inclinare il campione a 55 gradi e scattare un'altra foto.

Confronta le due immagini e identifica i fori appaiati nelle due micrografie. Inclina il palco all'indietro a zero gradi. Utilizzare il kit a bassa dose per scattare foto di ogni foro identificato nella modalità di ricerca ad alto ingrandimento con una sfocatura di circa meno 0,7 micrometri.

Dopo aver scattato le foto di tutti i fori, inclinare il tavolino di 55 gradi utilizzando lo stesso ingrandimento. Effettuare micrografie del campione inclinato con una sfocatura di circa meno 1,2 micrometri. Identificare la coppia di micrografie di inclinazione corrispondente in base ai modelli nelle micrografie a basso ingrandimento utilizzando il modello irregolare delle griglie di carbonio sacro fatte in casa.

Per aiutare la correlazione, scegliere coppie di inclinazione del micrografo con particelle a distribuzione uniforme e senza aloni attorno alle particelle. Quelle micrografie con evidenti aloni di macchie intorno a loro dovrebbero essere scartate per elaborare i dati. Iniziare con l'impostazione del programma Nella procedura.

L'elaborazione delle immagini sarà dimostrata utilizzando il processo 2D nel pacchetto Eman. Per modificare il formato dell'immagine, il pacchetto iMagic five per eseguire l'allineamento 2D e il pacchetto spider. Per eseguire la ricostruzione e il perfezionamento 3D, converti l'immagine digitale DM three Gatan in formato immagine ragno.

Utilizzando il comando Elabora 2D, selezionare le coppie di particelle. Utilizzando il programma web distribuito nel pacchetto del programma spider, il programma salva automaticamente le coordinate delle particelle in tutte le particelle selezionate utilizzando lo script spider. Lo script salva le pile di particelle inclinate e non inclinate.

Converti le particelle inclinate ONU nel formato IMAG five. Utilizzando il programma EM two EM band pass, filtra e maschera le particelle inclinate dell'ONU utilizzando il comando di preparazione InCorp in IMAG five e centra le particelle mascherate del bande pass utilizzando il comando center. In imag five, allinea e classifica le particelle in modo iterativo in classi omogenee utilizzando uno script batch che esegue automaticamente i programmi IMAG five.

Quindi, utilizzare il comando MSA names in class in IMAG five per generare la tabella di ricerca delle particelle di una classe, generare un file di tracciato per i valori di traslazione e rotazione dell'allineamento per ciascuna particella utilizzando il comando header. In iMagic five, converti le particelle allineate in formato spider utilizzando il programma EM two EM. Quindi cambia la tabella di ricerca delle classi in file di documento spider.

I valori di traslazione e rotazione dell'allineamento per ogni particella vengono anche convertiti in un filtro passa-banda del documento a ragno, maschera e centra le particelle inclinate proprio come per le particelle non inclinate in IMAG cinque, generano un nuovo set di dati per le particelle inclinate al centro. Crea file di documenti angolari dai documenti di allineamento multi-riferimento generati da IMAG five e dai file DCB generati dal programma web. Usa lo script di retroproiezione in spider per ottenere un modello iniziale per ogni media di classe.

Infine, eseguire il perfezionamento della proiezione del volume iniziale utilizzando lo script spider su tutte le particelle non inclinate per ottenere il volume finale utilizzando RCT. Sono state ottenute circa 50 ricostruzioni dell'esosoma. I volumi sono generati da particelle inclinate corrispondenti a ciascuna particella nelle 50 classi di particelle non inclinate.

Utilizzando la retroproiezione implementata nel pacchetto spider, è stato quindi eseguito il raffinamento della corrispondenza della proiezione Utilizzando questi volumi come modelli iniziali e il volume 3D visualizzato dell'esosoma è stato generato a circa 18 ang di risoluzione extra, possiamo quindi immergerci nei modelli atomici di diverse parti del complesso nella mappa 3D. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare RCT per ottenere ricostruzioni tridimensionali dalla generazione di una buona griglia narrativa di campioni a micrografie peer-to-peer e, infine, per ottenere la ricostruzione utilizzando tecniche di analisi delle immagini. Oltre al protocollo che abbiamo descritto qui, ci sono diversi metodi per ottenere le ricostruzioni finali nell'analisi delle immagini.

Il passaggio più critico per ottenere una ricostruzione corretta e affidabile è lavorare con un campione ben preparato.