Name: Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Impara la ricostruzione 3D del complesso esosoma di Saccharomyces cerevisiae mediante microscopia elettronica a contrasto negativo e metodo di inclinazione conica casuale. Questo protocollo guida nella preparazione dei campioni e nell'analisi delle immagini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare i membri di Nogales laboratorio alla UC-Berkeley, contribuendo a stabilire i protocolli iniziali ed i membri di Wang laboratorio presso la Yale University nel loro aiuto per stabilire i protocolli pieno. Riconosciamo anche il personale di crio-EM struttura e High-Performance Center di calcolo a Yale School of Medicine per il loro sostegno. HW è una famiglia Smith affidatario.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo vi presentiamo un protocollo dettagliato di preparazione del campione e la ricostruzione tridimensionale del complesso exosome tramite microscopia elettronica a colorazione negativa. Utilizzando questo metodo, abbiamo ottenuto la ricostruzione 3D utilizzando il metodo casuale conica tilt senza alcuna conoscenza della struttura. Metodo casuale inclinazione conica non richiede necessariamente un campione omogeneo, ma il passo successivo affinamento proiezione di corrispondenza avrebbe bisogno di un camp...

<table><tbody><tr><td>Resina di polivinilformale</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Formiato di uranile</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini microscopici Superfrost</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>Griglia da 400 mesh regolare</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Carbonizzatore automatico Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico Tecnai-12</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo per scarica a bagliore</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Dispositivo per deposizione catodica SCD 005</td></tr></tbody></table>

singola particella microscopia elettronica ricostruzione del complesso exosome utilizzo del metodo casuale tilt conico

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Singolo microscopia elettronica di particelle (EM) la ricostruzione è recentemente diventato uno strumento popolare per ottenere il tridimensionale (3D) struttura di complessi macromolecolari di grandi dimensioni. Rispetto alla cristallografia a raggi X, presenta alcuni vantaggi unici. In primo luogo, singola particella EM ricostruzione non ha bisogno di cristallizzare il campione, che è il collo di bottiglia in cristallografia a raggi X, soprattutto per i grandi complessi macromolecolari. In secondo luogo, non ha bisogno di grandi quantità di campioni di proteine. Rispetto ai milligrammi di proteine ​​necessarie per la cristallizzazione, singola particella ricostruzione EM deve solo alcuni micro-litri di soluzione proteica al nano-molare concentrazioni, utilizzando il metodo di colorazione negativa EM. Tuttavia, nonostante un paio di assemblee macromolecolari con simmetria alto, singola particella EM è limitata ad una risoluzione relativamente bassa (inferiore a 1 nm risoluzione) per molti esemplari specialmente quelli privi di simmetria. Questa tecnica è inoltre limitato dalle dimensioni delle molecole in fase di studio, cioè 100 kDa per i campioni negativamente colorati e 300 kDa per frozen-idratata esemplari in generale. Per un nuovo campione di struttura sconosciuta, si usano generalmente una soluzione di metalli pesanti di inserire le molecole di colorazione negativa. Il campione viene poi esaminato al microscopio elettronico a trasmissione di prendere due-dimensionali (2D) micrografie delle molecole. Idealmente, le molecole di proteine ​​hanno una struttura omogenea 3D, ma presentano diversi orientamenti nelle micrografie. Queste micrografie sono digitalizzati ed elaborati in computer come &quot;particelle singolo&quot;. Utilizzando bidimensionale allineamento e tecniche di classificazione, le molecole omogeneo le stesse idee sono raggruppati in classi. Loro medie potenziare il segnale di forme 2D della molecola. Dopo aver assegnato le particelle con il corretto orientamento relativo (angoli di Eulero), saremo in grado di ricostruire le immagini delle particelle 2D in un volume virtuale in 3D. Nella ricostruzione di singole particelle 3D, un passo essenziale è quello di assegnare correttamente il corretto orientamento di ogni singola particella. Ci sono diversi metodi per assegnare la visualizzazione per ogni particella, compresa la ricostituzione angolare 1 e casuale conica tilt (RCT) metodo 2. In questo protocollo, si descrive la nostra pratica a ottenere la ricostruzione 3D del complesso lievito exosome con colorazione negativa EM e RCT. Va notato che il nostro protocollo di microscopia elettronica e l&#39;elaborazione delle immagini segue il principio di base della RCT, ma non è l&#39;unico modo per eseguire il metodo. Abbiamo prima descritto come incorporare il campione in uno strato di uranile-formiato con uno spessore paragonabile alle dimensioni delle proteine, utilizzando una griglia di carbonio bucata coperta da uno strato continuo di pellicola sottile di carbonio. Poi il campione viene inserito in un microscopio elettronico a trasmissione per raccogliere Untilted (0-laurea) e inclinata (55 gradi) paia di micrografie che verranno utilizzati in seguito per l&#39;elaborazione e ottenere un primo modello 3D del exosome lievito. A tal fine, noi dobbiamo fare RCT e poi affinare il modello iniziale 3D utilizzando la proiezione di corrispondenza metodo raffinatezza 3.

Questo articolo descrive un metodo standard per ottenere un modello tridimensionale (3D) ricostruzione delle macromolecole biologiche mediante microscopia elettronica a colorazione negativa (EM). In questo protocollo, viene spiegato come ottenere la struttura 3D del complesso exosome Saccharomyces cerevisiae a media risoluzione con il metodo casuale conica ricostruzione tilt (RCT).

Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

La ricostruzione tramite microscopia elettronica (EM) a particella singola è diventata recentemente uno strumento diffuso per ottenere la struttura tridimensionale (3D) di grandi...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere la struttura tridimensionale del complesso dell'esosoma utilizzando il metodo dell'inclinazione conica casuale. Questo risultato si ottiene innanzitutto depositando uno strato sottile di film di carbonio sulla griglia di carbonio forata per creare il substrato di supporto per il complesso proteico e, in un secondo passaggio, per il colorante. Il campione e il colorante vengono applicati sulla griglia, il che provoca l'inclusione del campione in sali di metalli pesanti.Successivamente si esegue la microscopia elettronica per ottenere coppie di micrografie inclinate del campione. Infine, si ottengono risultati che mostrano la struttura tridimensionale del complesso dell'esosoma basata sull'analisi delle immagini mediante il metodo dell'inclinazione conica casuale. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché a volte la preparazione adeguata del campione per il metodo dell'inclinazione conica casuale è complessa, così come la procedura di elaborazione delle immagini che segue View.La dimostrazione di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di valutazione del grado e di pr

single-particle-electron-microscopy-reconstruction-exosome-complex

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive la tecnica per preparare una sezione sottile di esosomi incorporati. Queste sezioni possono essere ulteriormente colorate e visualizzate utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, o TEM, per studiare le caratteristiche strutturali degli esosomi.

Sezionamento, colorazione e imaging TEM di esosomi incorporati: un protocollo per visualizzare le caratteristiche strutturali degli esosomi utilizzando TEM

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Questo documento presenta un protocollo per l'elaborazione di immagini cryo-EM utilizzando la suite software SPHIRE. Il presente protocollo può essere applicato per quasi tutti i progetti di singoli particelle EM che mirano ad una risoluzione quasi atomica.

Analisi di particelle singole ad alta risoluzione da immagini elettroniche a cryo-microscopia usando SPHIRE

Questo protocollo descrive le varie tecniche necessarie per microscopia elettronica di trasmissione tra cui macchiatura negativa, sezionamento ultrasottile per struttura dettagliata e immuno-oro etichettatura per determinare le posizioni di specifiche proteine in esosomi.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

L'analisi a singola particella in microscopia crioelettronica è una delle principali tecniche utilizzate per determinare la struttura degli insiemi biologici ad alta risoluzione. Scipion fornisce gli strumenti per creare l'intera pipeline per elaborare le informazioni acquisite dal microscopio e ottenere una ricostruzione 3D del campione biologico.

Crio-EM e analisi a singola particella con Scipion

La determinazione della struttura dei complessi macromolecolari utilizzando il crioEM è diventata di routine per alcune classi di proteine e complessi. Qui, questa pipeline è riassunta (preparazione del campione, screening, acquisizione ed elaborazione dei dati) e i lettori sono indirizzati verso ulteriori risorse dettagliate e variabili che possono essere modificate nel caso di campioni più impegnativi.

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) viene utilizzata per bypassare il limite di diffrazione tipico della microscopia ottica e per visualizzare gli esosomi su scala nanometrica. Può essere impiegato sia in due che in tre dimensioni per caratterizzare gli esosomi.

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Questo articolo descrive come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione crio-EM, ovvero cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3, per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati a particella singola per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.

Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l'analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell'ultrastruttura del filamento di settino.

Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine

Il presente protocollo descrive uno schema generalizzato e facile da implementare per la raccolta di dati a singola particella inclinata in esperimenti crio-EM. Tale procedura è particolarmente utile per ottenere una mappa EM di alta qualità per campioni che soffrono di distorsione di orientamento preferenziale a causa dell'aderenza all'interfaccia aria-acqua.

Raccolta dati Cryo-EM a singola particella con inclinazione dello stadio utilizzando Leginon

Impara la ricostruzione 3D del complesso esosoma di Saccharomyces cerevisiae mediante microscopia elettronica a contrasto negativo e metodo di inclinazione conica casuale. Questo protocollo guida nella preparazione dei campioni e nell'analisi delle immagini.

Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

Esplora altri video