Name: Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante lapoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Scopri come monitorare i livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi utilizzando il sensore geneticamente codificato ratiometric pericam-mt. Questo metodo permette l'imaging in tempo reale delle dinamiche del calcio nelle cellule vive.

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Vorremmo ringraziare Atsushi Miyawaki per averci fornito il raziometrico-pericam-mt costruire espressione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione GM081685 dal National Institutes of Health (DB).

1. Pericam-mt Transfection e preparazione delle cellule. <ol><li> Piastra di cellule HeLa la notte prima di transfezione su vetrini sterili di vetro posta in una standard a 6 e piastra di coltura. </li><li> Preparare DNA / Lipofectamine 2000 complessi come suggerito dal produttore (Invitrogen). Noi usiamo 4 microgrammi di raziometrici-pericam-mt vettore di espressione e 10 L del 2000 Lipofectamine diluito in 0,5 ml di Opti-MEM per ogni bene. Le cellule devono essere confluenti ~ 70% prima della trasfezione. </li><li> Sostituire HeLa cultura dei media (Dulbecco modificato aquile medio, 10% FBS, penicillina / streptomicina) in ogni pozzetto con 1.5 mL degli stessi media senza antibiotici. </li><li> Aggiungere il DNA / Lipofectamine complessi in ciascun pozzetto di essere transfettate. Mescolare delicatamente con dondolo e incubare per 4 ore in una cella cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Sostituire antibiotico-media liberi, con terreni di coltura con gli antibiotici. Consentono alle cellule di esprimere pericam raziometriche per 1-2 giorni prima di imaging. </li></ol> 2. Microscopio installazione e acquisizione immagini <ol><li> Posizionare un vetrino con cellule HeLa in una camera per immagini con una soluzione di imaging: 107mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11,5 mm di glucosio, 0,1% di albumina di siero bovino, e HEPES 20 mM 7.2. Il nostro laboratorio utilizza la camera di cellule Attofluor da Invitrogen. Montare la camera di imaging in una fase microscopio invertito. </li><li> Trova una zona di interesse contenente una o più cellule che esprimono pericam raziometrico con un 40x (o superiore) obiettivo ad immersione olio. Abbiamo scoperto che pericam raziometrico è meno resistente di photobleaching a 380 nm, e quindi usiamo questa lunghezza d'onda per identificare le cellule adatte. Per le immagini acquisite in Figura 1, un obiettivo Nikon Superfluor 40X con apertura 1,3 numerica è stata utilizzata. Obiettivi ingrandimento superiore Sarebbe anche opportuno (60-100x). I filtri utilizzati sono stati di eccitazione Chroma Tecnologia filtri D380/30x (380 + / - 30 nm) e D495/10 (495 + / - 5 nm), è stata beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ed emissioni filtro è stato HQ535/50m (535 + / - 25 nm). Il nostro microscopio utilizzato per acquisire le immagini in figura 1 è costituito da un microscopio invertito Nikon TE2000 dotato di un Roper Scientific Coolsnap HQ raffreddato CCD, Ludl MAC6000 rapido ruota portafiltri e cambio, e un MetaFluor acquisizione dati e software di analisi. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi standard a grande campo microscopio con i filtri appropriati e software in grado di catturare ed elaborare le immagini raziometrico. </li><li> Impostare il software per l'eccitazione doppia utilizzando il 495 e 380 nm filtri. Calcio legame pericam raziometrici aumenta assorbanza a 495 nm, quindi il rapporto dovrebbe essere impostato per essere nm/380 495 nm. Raziometrico pericam ha un calcio senza picco di eccitazione a 415 nm 4. In questo protocollo si consiglia utilizzando un filtro da 380 nm solo perché è onnipresente nei laboratori più calcio di imaging. Se un filtro a 410 nm è disponibile, è preferibile il filtro 380 nm. </li><li> Acquisire immagini in sequenza alternativamente emozionante a 495 e 380 nm. Acquisire immagini al basale dei livelli di calcio per almeno 30 s prima di applicare agonista tramite un apparato di perfusione. Segnano il tempo più di ogni agonista. Tempi di esposizione e gli intervalli di acquisizione deve essere ottimizzata per evitare photobleaching pur consentendo sufficiente esempio temporale resolution.For, per semi-rapida dinamica di calcio monitorati in risposta alla stimolazione con agonisti, immagini sono state acquisite ogni due secondi in 1B Figure e C. Molto più veloce tasso di acquisizione Sono possibili anche 6. A lungo termine dopo la somministrazione di imaging staurosporina è stata acquisita con un intervallo più lungo (30 anni) tra le acquisizioni (Figure 1 D ed E). </li></ol> 3. Image Processing and Analysis <ol><li> Una volta che l'esperimento è completo, le immagini ottenute possono essere analizzati in linea. Definire le aree di interesse (ROI) in cui si desidera monitorare i cambiamenti dei livelli di calcio. Utilizzare un ROI selezionate all'interno di una zona vuota del campo per sottrarre sfondo, se necessario. Va notato che i mitocondri sono molto mobili e dinamiche, e gli eventi in un mitocondrio estrapolando solo per lunghi periodi non è sempre possibile. Così, considerando l'elevata motilità di questo organello in alcuni tipi di cellule, la selezione di ROI deve essere attentamente monitorato. Inoltre, come evidenziato in Figura 1, i mitocondri eterogeneo risposta a vari stimoli. E 'quindi importante analizzare e monitorare i dati offline RO1 posizionamento su un fotogramma per fotogramma. Una descrizione dettagliata di misurare calcio mitocondriale altamente mobili mitocondri è stata descritta in altri 7. </li><li> Misure di rapporto ottenuto dal ROI possono essere importati in Excel o simili graphingsoftware. I dati possono essere presentati come una traccia che rappresenta i cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale in una singola cella o mitocondrio singola, o una media di flsegnali uorescence dal ROI diversi. Abbiamo anche usato questa tecnica per misurare i livelli medi di calcio mitocondriale in una popolazione di linfociti in fase di apoptosi indotta da Fas ligando 8. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) la localizzazione subcellulare di raziometrici-pericam-mt. Questa prima immagine mostra dal vivo di cellule HeLa che esprimono raziometrico-pericam-mt. La seconda immagine mostra colorazione fluorescente con mitocondrio selettivi CMXRos MitoTracker colorante rosso. La fluorescenza giallo nell'immagine fusa dimostra co-localizzazione di raziometrici-pericam-mt e fluorescenza MitoTracker. (B) Una serie di pseudocolori rapporto (495:380 nm) immagini di 4 cellule HeLa che esprimono mt-raziometrico pericam trattati con 10 mM ATP . (C) Quantificazione dei cambiamenti nei livelli di calcio mitocondriale nella regione di interesse (ROI) di cui (B) trattati con 10 mM ATP. (D) Serie di rapporto pseudocolori (495:380 nm) le immagini di una cellula HeLa che esprimono mt -raziometrico pericam trattati con 0,5 staurosporina micron. L'eterogeneità nella risposta di calcio nei mitocondri individuale è evidente, così come notevole frammentazione dei mitocondri di 60 minuti. Alcuni hanno mitocondri aumenta oscillatorio di calcio (punta di freccia bianca), mentre altri non mostrano variazioni significative nel livello di calcio (testa freccia gialla). (E) Quantificazione di aumenti dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula HeLa dopo l'induzione di apoptosi con 0,5 mM staurosporina.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
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<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui vi presentiamo un metodo molto semplice per misurare il calcio mitocondriale mitocondriali utilizzando mirate pericam raziometrico. Come mostrato nella Figura 1A, utilizzando le normali ottiche widefield senza deconvoluzione è possibile visualizzare facilmente i singoli mitocondri nelle cellule HeLa con accettabile rapporto segnale-rumore. Questo perché le cellule HeLa, come la maggior parte delle cellule in coltura, appiattirsi in modo significativo quando aderente ovviando alla necessità di microscopia confocale o altre apparecchiature specializzate. Abbiamo trovato risultati simili nelle cellule Jurkat aderito a vetrini rivestiti di poli-lisina 8. In contrasto con le metodologie con coloranti, è anche possibile monitorare in maniera non invasiva i livelli di calcio mitocondriale per ore sulla base di indicatori di calcio geneticamente codificato come raziometrico pericam (Figura 1E). Ciò è particolarmente importante quando si analizza il calcio mitocondriale durante la morte delle cellule. Inoltre, è anche possibile visualizzare fissione / frammentazione dei mitocondri durante il processo apoptotico. Come mostrato in Figure 1D ed E, il trattamento staurosporina provoca un lento aumento di calcio in sottopopolazioni selezionate di mitocondri con un picco di 20 minuti. I livelli di calcio scendere di nuovo in concomitanza con la frammentazione mitocondriale prima di andare di nuovo 2 ore dopo il trattamento. Ciò è coerente con le onde lente di calcio citosolico indotti dal trattamento staurosporina misurata utilizzando Fura-2 9. Quindi, importanti informazioni cinetiche possono essere ottenute, che non è possibile con i metodi impiegando misure statiche. Anche se abbiamo presentato i rapporti e le concentrazioni di calcio nella Figura 1, è possibile calibrare il sensore in situ per calcolare i livelli di calcio in assoluto 4, 10. Un avvertimento importante da considerare è che pericam raziometrico è sensibile al pH 4, 10. Poiché entrambi i livelli di pH citosolico e mitocondriale può cambiare radicalmente durante l&#39;apoptosi 11, questa è una considerazione importante. Titolazione di pH in mitocondri isolati pericam esprimendo dimostrare che l&#39;aumento [H +] aumenta le emissioni di pericam quando eccitato a 495 nm, con scarso effetto sulla emissione stimolata di eccitazione a 410 nm, una proprietà che è stata sfruttata per misurare simultaneamente sia di calcio mitocondriale e pH 12. Così, selettivamente monitoraggio delle emissioni con 410 nm di eccitazione fornisce un mezzo per non ratiometrically calcio monitorare mitocondriale con preoccupazione per la riduzione del pH. Infine, il protocollo presentato qui richiede solo l&#39;accesso ad un microscopio standard epifluorescente con filtri ampiamente disponibili, rendendo questa tecnica accessibile alla maggior parte dei laboratori.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertito ad ampio campo per l'immagine del calcio</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>Qualsiasi microscopio invertito ad ampio campo dotato di filtri di eccitazione a 380 nm/495 nm e di filtri appropriati a lungo passaggio e di emissione può essere facilmente adattato per utilizzare questo protocollo.</td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Camera per cellule Attofluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>Qualsiasi camera per imaging per microscopio invertito che permetta la perfusione sarebbe adeguata.</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>La maggior parte dei reagenti/protocolli di trasfezione sarebbe appropriata per questi studi</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio intracellulare in risposta a vari stimoli regola molti processi cellulari quali la proliferazione, la differenziazione e l&#39;apoptosi 1. Durante l&#39;apoptosi, l&#39;accumulo di calcio nei mitocondri promuove il rilascio di fattori pro-apoptotici dai mitocondri nel citosol 2. E &#39;quindi di interesse per misurare direttamente il calcio mitocondriale nelle cellule viventi in situ durante l&#39;apoptosi. Imaging ad alta risoluzione a fluorescenza di cellule caricate con coloranti di calcio a doppia eccitazione raziometrici e non raziometrico sintetico indicatore è stato dimostrato di essere uno strumento affidabile e versatile per studiare vari aspetti della segnalazione calcio intracellulare. Misurazione dei flussi di calcio citosolico utilizzando queste tecniche è relativamente semplice. Tuttavia, misurare i livelli di calcio nelle cellule intatte intramitocondriale utilizzando indicatori sintetici come il calcio Rhod-2 e Rhod-FF è più impegnativo. Indicatori sintetici mirati per i mitocondri sono spuntate le risposte ad un aumento ripetitive di calcio mitocondriale, e disturbare morfologia mitocondriale 3. Inoltre, gli indicatori sintetici tendono a fuoriuscire dei mitocondri per diverse ore il che li rende inadatti per esperimenti a lungo termine. Così, gli indicatori di calcio geneticamente codificato basato sulla proteina fluorescente verde (GFP) 4 o 5 aequorina mirati per i mitocondri hanno notevolmente facilitato la misurazione delle dinamiche di calcio mitocondriale. Qui, descriviamo un metodo semplice per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale in risposta a stimoli diversi. Il metodo si basa sulla microscopia a fluorescenza di &#39;raziometrici-pericam&#39;, che è più mirato ai mitocondri. Raziometrico pericam è un indicatore di calcio basato su una fusione di permutati circolarmente proteina fluorescente gialla e calmodulina 4. Legame del calcio a pericam raziometrici provoca uno spostamento del suo picco di eccitazione da 415 nm a 494 nm, mentre lo spettro di emissione, con un picco intorno a 515 nm, rimane invariato. Raziometrico pericam lega un singolo ione di calcio con una costante di dissociazione in vitro di ~ 1.7 microM 4. Queste proprietà di pericam raziometrici permettono la quantificazione di cambiamenti rapidi e di lungo periodo della concentrazione di calcio mitocondriale. Inoltre, si descrive l&#39;adattamento di questa metodologia ad un tenore di ampio campo ottico di immagini di calcio con set di filtri comunemente disponibili. Usando due agonisti distinti, il purinergici agonista ATP e che induce l&#39;apoptosi staurosporina droga, ci dimostrano che questo metodo è appropriato per monitorare i cambiamenti nella concentrazione di calcio mitocondriale con una risoluzione temporale di secondi a ore. Inoltre, abbiamo anche dimostrato che pericam raziometrico è anche utile per misurare fissione mitocondriale / frammentazione durante l&#39;apoptosi. Così, pericam raziometrico è particolarmente adatto per continuo a lungo termine di misura delle dinamiche di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi.

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l&#39;indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Le variazioni dinamiche della concentrazione di calcio intracellulare in risposta a diversi stimoli regolano numerosi processi cellulari, come la proliferazione, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare le variazioni nella concentrazione di calcio mitocondriale in cellule vive. Questo viene ottenuto trasfettando prima le cellule con la proteina indicatore di calcio peram a rapporto metrico, indirizzata alla matrice mitocondriale, uno o due giorni dopo la trasfezione. Il microscopio a fluorescenza e il software vengono configurati per l'acquisizione di immagini in tempo reale su cellule vive.Le immagini di cellule esprimenti un indicatore raziometrico vengono quindi acquisite dopo l'aggiunta di un agonista che mobilita il calcio. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analisi quantitativa delle immagini acquisite. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni dinamiche della concentrazione mitocondriale di calcio mediante microscopia a fluorescenza di cellule vive che esprimono una proteina indicatrice raziometrica del calcio.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione dei livelli di calcio mediante indicatori sintetici del calcio, è che il peram metrico è codificato geneticamente e può quindi essere indirizzato ai mitocondri o a qualsiasi altro organulo di interesse. Salve, sono la dottoressa Ascar, ricercatrice postdottorato nel laboratorio del dottor Benning, e oggi illustrerò la procedura. Per iniziare il protocollo, il giorno precedente la trasfezione si piastrano le cellule HeLa su coprivetri sterili posizionati in una piastra da coltura standard a sei pozzetti, a una densità tale da raggiungere circa il 70% di confluenza al momento della trasfezione il giorno successivo. Il giorno seguente, si preparano i complessi di DNA con Lipofectamine 2000 seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando quattro microgrammi del vettore di espressione mitocondriale del peram metrico e 10 microlitri di Lipofectamine 2000 diluiti in 0,5 millilitri di OPTI-MEM per ciascun pozzetto da trasfettare.Successivamente, sostituire il terreno di coltura D-M-E-M-F-B-S HELOC in ogni pozzetto con 1,5 millilitri dello stesso terreno senza antibiotici. Aggiungere la soluzione LIPECTOMY alla soluzione di DNA e mescolare delicatamente dopo la formazione dei complessi. Aggiungere la soluzione di DNA Lipectomy goccia a goccia in ogni pozzetto da trasfettare, mescolando delicatamente oscillando la piastra, e incubare per quattro ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, al termine dell'incubazione.Sostituire il mezzo con D-M-E-M-F-B-S contenente antibiotici. Lasciare che le cellule esprimano metric peram per uno o due giorni prima dell'acquisizione delle immagini utilizzando pinzette. Posizionare delicatamente un coprioggetto con cellule HELOC in una camera di acquisizione adeguata contenente soluzione per imaging.Montare la camera di imaging sul palco del microscopio invertito. Successivamente, utilizzare un obiettivo ad immersione in olio 40x o superiore e una lunghezza d'onda di 380 nanometri. Per individuare un'area di interesse contenente una o più cellule che esprimono peram metrico, qui si utilizza 380 nanometri per identificare le cellule come metriche in rapporto.Peram è meno resistente al fotoblecamento a questa lunghezza d'onda. Una volta identificata un'area di interesse, configurare il software per l'eccitazione duale a 495 e 380 nanometri. Successivamente, acquisire le immagini in modo sequenziale eccitando alternativamente a 495 e 380 nanometri.Acquisire immagini dei livelli di calcio basali per almeno 30 secondi prima dell'applicazione dell'agonista. Successivamente, applicare l'agonista mobilizzatore del calcio tramite un apparato di perfusione, annotando il tempo di aggiunta; i tempi di esposizione all'agonista e gli intervalli di acquisizione devono essere ottimizzati per prevenire il fotoblecamento, pur mantenendo una risoluzione temporale sufficiente. Al termine dell'esperimento, le immagini possono essere analizzate in modalità offline.Per iniziare l'analisi, selezionare una regione di interesse all'interno di un'area vuota del campo per sottrarre la fluorescenza di fondo, se necessario. Successivamente, esportare le misurazioni del rapporto 4 95 3 80 dalla regione di interesse in Excel o in un software simile per la creazione di grafici. Questo pannello di immagini mostra la localizzazione subcellulare del peram metrico e dei mitocondri.A sinistra è mostrata un'immagine di cellule vive di cellule HeLa che esprimono Peram a rapporto metrico. Al centro è visibile la colorazione fluorescente dei mitocondri con il colorante selettivo MitoTracker Red CMXRos. Infine, a destra, l'immagine sovrapposta mostrata qui è una serie di immagini a rapporto pseudocolore 495/380 nanometri di quattro cellule HeLa che esprimono Peram a rapporto metrico nei mitocondri, trattate con 10 micromolare di ATP; la quantificazione delle variazioni nei livelli di calcio mitocondriale di quelle quattro cellule precedenti è mostrata in questa immagine di una cellula HeLa che esprime Peram a rapporto metrico nei mitocondri.È evidente un'eterogeneità della risposta al calcio nei singoli mitocondri, nonché una significativa frammentazione dei mitocondri, già a 60 minuti di trattamento con 0,5 micromolare di storporina. Alcuni mitocondri mostrano aumenti oscillatori del calcio, indicati dalla freccia bianca, mentre altri non mostrano variazioni significative nei livelli di calcio, indicati dalla freccia gialla. Questo grafico mostra la variazione dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula HELO dopo l'induzione dell'apoptosi per 120 minuti con 0,5 micromolare di storporina.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare i cambiamenti dinamici nei livelli di calcio mitocondriale in risposta a vari tli utilizzando la proteina mediata dal calcio R geometric peram, che è indirizzata in modo selettivo alla matrice mitocondriale.

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Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

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L'omeostasi del calcio del reticolo endoplasmatico è interrotta in diverse patologie.  Un reporter della proteina di monitoraggio del calcio ER secreta (SERCaMP) può essere utilizzato per rilevare le interruzioni nella riserva di calcio ER.   Questo protocollo descrive l'uso di una Gaussia luciferasi SERCaMP per esaminare l'omeostasi del calcio ER in vitro e in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

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Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'applicazione della rodamina 123 per identificare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e studiare CLIC4 HN4 di atterramento-indotta delle cellule apoptosi in vitro. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la modifica in tempo reale di MMP è stata registrata.

Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Scopri come monitorare i livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi utilizzando il sensore geneticamente codificato ratiometric pericam-mt. Questo metodo permette l'imaging in tempo reale delle dinamiche del calcio nelle cellule vive.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante lapoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato (Video) | JoVE Journal

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

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