Name: Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-20T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a fabbricare elettrodi di aspirazione extracellulari per registrazioni elettrofisiologiche su midollo spinale di roditori neonati in vitro. Questo metodo utilizza tubi di plastica PE 90 e una lampada ad alcool per creare strumenti accessibili e funzionali per la ricerca neuroscientifica.

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Samuel L. Pfaff è docente nei Laboratori di espressione genica presso il Salk Institute for Biological Studies e un investigatore della Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dal Christopher e Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan in Risorse Multimediale presso il Salk Institute ha fornito assistenza con la fotografia e montaggio.

Le registrazioni elettrofisiologiche di isolati midollo spinale può rivelare cambiamenti genetici e di sviluppo di circuiti neurali 1. Abbiamo già dimostrato un metodo per analizzare i cavi del mouse neonatale vertebrale 2. Qui vi presentiamo un metodo per preparare elettrodi aspirazione utile nella registrazione locomozione fittizia nel midollo spinale isolato 3. La punta di un elettrodo di tubi di plastica può essere attratto da una punta molto sottile a mano utilizzando una lampada a bassa temperatura alcool 3-5. Il tubo di plastica (PE90, Clay Adams Intramedic TM) si tiene sopra la fiamma per ammorbidire il tubo in una forma malleabile. Come il tubo comincia a sciogliersi e diventa sempre più trasparente non viene rimossa dalla fonte di calore e le estremità sono leggermente separati. I tempi di rimuovere il tubo dal fuoco è importante per assicurare la plastica non collassa o dividere durante la fase di elaborazione. La parte sottile del tubo viene tagliato con una lametta in base al diametro desiderato interno, come dettato dalla età del campione o il livello segmentale del midollo. Per facilità di mettere un o-ring sul tubo, taglio a 45 ° è fatta alla fine di spessore del tubo con una lametta. Una ghiera e o-ring sono installati alla fine di spessore per fissare la punta dell'elettrodo al barile dell'elettrodo. Per consentire elettrodi specificamente formato ed evitare le difficoltà di mano tirando punte degli elettrodi, gli elettrodi può essere costruito utilizzando un tubo inserito in un piccolo tubo più spesso (PE90). Le lunghezze dei tubi sono specifici per le esigenze del sistema di registrazione e sono variabili. Vi presentiamo le misurazioni utilizzate nei nostri esperimenti 1-3,5. Una lunghezza 1 centimetro di tubo in PTFE fine (Zeus, parti piccole) e una lunghezza di 10 cm di PE90 tubi sono tagliati con una lama di rasoio. Le estremità del tubo piccoli dovrebbero essere esaminate per essere sicuri che non siano schiacciati o chiuse. Essi possono essere aperti con un pin di insetti (Strumenti di scienze arti). Una goccia di colla (JB Weld) è posizionato sul punto medio del tubo in PTFE. Il tubo in PTFE e l'adesivo sono disegnati nel tubo di aspirazione con PE90 bocca sul tubo PE90. Un taglio a 45 ° è fatta alla fine di spessore del tubo e una ghiera e o-ring sono attaccati, come precedente. Il connettore BNC e puntale sono svitato da un elettrodo di aspirazione commerciale. Il connettore BNC è imbevuta di xilene per un'ora per rimuovere il sigillo di cera. Il connettore è poi risciacquato in acqua ed essiccati. Una porta lato inferiore angolata deve essere effettuata sul lato della canna. Una barra di metallo viene riscaldata utilizzando un becco Bunsen e pressati nel foro esistente sul lato del barilotto con un angolo basso. Una lunghezza 15cm di filo d'argento 0,010 pollici (AM Systems) viene tagliata e imbevuta di candeggina per quindici minuti. Questo è fatto per creare un rivestimento d'argento cloruro che aiuta nella conduzione del segnale 6. Il filo è risciacquata con acqua, secchi, e poi saldato sul connettore BNC. Il filo connettore BNC e l'argento sono inseriti nella canna di aspirazione elettrodo con abbastanza spazio per il connettore BNC di rimanere al fianco della canna. Tubo di aspirazione è inserita nella porta laterale 2-3cm. Sigillante siliconico viene iniettato nel cilindro di circa 2-3cm. Il connettore BNC è avvitato al barile dell'elettrodo spingendo il sigillante in avanti. La punta dell'elettrodo è ormai avvitata nella parte anteriore dell'elettrodo. Tubo restringente può anche essere aggiunto per rafforzare la linea di aspirazione dalla porta laterale. Gli elettrodi sono montati su micromanipolatori che sono collegati a supporti magnetici, e posto vicino al piatto di registrazione. BNC cavi coassiali sono collegate ad un headstage che è collegato ad un amplificatore. L'amplificatore è collegato ad un adattatore (Polyview) che è collegato ad una scheda analogica a digitale (National Instruments) in un computer PC con software di acquisizione dati (Polyview). Durante la registrazione di dati elettrofisiologici, è necessario eliminare tutte le interferenze esterne. Il piatto di registrazione, amplificatore e stadio testa sono collocati su un tavolo d'aria all'interno di una gabbia di Faraday per evitare interferenze elettriche e meccaniche, rispettivamente. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un elettrodo di aspirazione disponibili in commercio possono essere modificati con l'aggiunta di un filo d'argento pesante calibro e una punta di plastica che viene disegnato a mano su una lampada ad alcool, o costruito con tubi di plastica in commercio di dimensioni specifiche. Inoltre, il sigillante paraffina viene sostituito con più durevole mastice sigillante siliconico. <img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Una schematica degli elettrodi di aspirazione in relazione al tavolo d'aria (per l'isolamento meccanico), gabbia di Faraday (elettrici isolativia), amplificatore e il computer. Va notato che c'è una massa di riferimento per il piatto di registrazione e un secondo motivo che fa riferimento alla tabella aria e gabbia di Faraday.

<ol><li>Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+rhythmic+locomotor+burst+patterns+using+a+continuous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform.</a> Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Gallarda, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, 233-236 (2008).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+motor+projection+patterns+in+the+chick+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of motor projection patterns in the chick hind limb.</a> J Physiol. 284, 391-414 (1978).</li>
<li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Chanin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+chloride+by+use+of+the+silver-silver+chloride+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode.</a> Science. 119, 323-324 (1954).</li>
<li>Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+controlling+vertebrate+locomotion%3A+moving+in+a+new+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction.</a> Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sviluppo del sistema nervoso possono essere studiate usando cavi isolati spinale di roditori. In presenza di neurotrasmettitori, locomozione fittizia possono essere generati dal midollo spinale sotto forma di attività elettrica fantasia 1,3. Queste esplosioni ritmiche sono prodotti a 0,2-0,5 Hz e sono modellati in alternanza destra-sinistra e flessori-estensori. A diversi stadi di sviluppo, la robustezza ed i modelli di questa attività varia a 1. Mutazioni genetiche possono anche disturbare il mode...

<table><tbody><tr><td>Tubazione in PTFE Sub Lite Wall (piccola tubazione)</td><td>Zeus</td><td>36AWG</td><td>0,005&amp;#8221; ID x 0,003&amp;#8221; spessore parete (parti piccole). Disponibile anche da 0,003&amp;#8221; a 0,006&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Grande tubazione (0,86 mm (0,34&amp;#8221;))</td><td>BD Biosciences</td><td>427420</td><td>0,86 mm (0,34&amp;#8221;) O.D. 1,27 mm (0,050&amp;#8221;)</td></tr><tr><td>Corpo dell'elettrodo</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo</td><td>JB Weld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adesivo: sigillante al silicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stagno e saldatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filo d'argento: 0,010&amp;#8221;</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntine per insetti: Austerlitz 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige International</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Minischeda (testa di lettura)</td><td>Grass Technologies</td><td>F-15EB/B1</td><td></td></tr><tr><td>Unità adattatrice Polyview</td><td>Grass Technologies</td><td>PVA 8</td><td></td></tr><tr><td>Sistema amplificatore fisiologico portatile bipolare</td><td>Grass Technologies</td><td>15LT</td><td></td></tr><tr><td>SCHEDA ANALOGICO-DIGITALE</td><td>National Instruments</td><td>6035E</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrazioni; Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spinal cord elettrofisiologia ii: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Sviluppo della circuiteria neurale e locomozione possono essere studiate usando neonatale roditori midollo spinale centrale pattern generator (CPG) comportamento. Dimostriamo un metodo per fabbricare elettrodi di aspirazione che sono utilizzati per esaminare l&#39;attività CPG, o locomozione fittizia, in cordoni roditori sezionato spinale. I cavi roditori spinale sono posti in artificiale liquido cerebrospinale e le radici ventrali sono trascinati nella elettrodo di aspirazione. L&#39;elettrodo è costruito modificando un elettrodo di aspirazione disponibile in commercio. Un filo d&#39;argento pesante viene usato al posto del filo standard assegnato da l&#39;elettrodo disponibili in commercio. La punta di vetro sull&#39;elettrodo commerciale viene sostituito con una punta di plastica per una maggiore durata. Prepariamo mano elettrodi disegnate e elettrodi in dimensioni specifiche di tubi, permettendo coerenza e riproducibilità. I dati vengono raccolti con un amplificatore e acquisizione di software neurogram. Le registrazioni vengono effettuate su un tavolo d&#39;aria all&#39;interno di una gabbia di Faraday per evitare interferenze meccaniche ed elettriche, rispettivamente.

Una dimostrazione della fabbricazione e l&#39;uso di un elettrodo extracellulare di aspirazione utilizzata per misurare le registrazioni elettrofisiologiche delle corde roditori neonatale vertebrale<em&gt; In vitro</em

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Lo sviluppo dei circuiti neurali e della locomozione può essere studiato analizzando il comportamento del generatore centrale di pattern (CPG) del midollo spinale di roditori neonati. Dimostriamo...

Ciao. Mi chiamo Resh Gary Dory e sono un assistente di ricerca nel laboratorio del professor Faf presso l'Istituto Salk per Studi Biologici. Oggi vi mostrerò come realizzare elettrodi di suzione extracellulari utilizzando due metodi. Questi elettrodi possono essere utilizzati per effettuare registrazioni elettrofisiologiche del midollo spinale in vitro.Utilizzare una lampada ad alcol come fonte di calore per fondere il tubo di plastica PE 90 alla larghezza desiderata. Tenere il tubo sopra la fiamma accesa e rimuoverlo quando inizia a fondere, quindi tirare delicatamente le estremità allontanandole, avendo cura di non spezzare la parte centrale. Questo processo viene mostrato nuovamente.Rimuovere il tubo mentre si ammorbidisce e fonde, tirando delicatamente le estremità in direzioni opposte. Tagliare il tubo con una lametta affilata in corrispondenza del punto che corrisponde all'incirca alla larghezza del campione da misurare all'estremità più spessa del tubo. Eseguire un taglio con un angolo di 45 gradi.Ora è necessario installare un dado feral e una guarnizione O-ring sull'estremità più spessa. Inserire questa estremità del tubo attraverso l'apertura esagonale del dado feral. Successivamente, inserire l'estremità del tubo nella guarnizione di gomma O-ring.Questo dispositivo verrà avvitato sulla parte anteriore dell'elettrodo. Tagliare un tratto di tubo Zeus di un centimetro di lunghezza con una lametta affilata ed esaminare le estremità per verificare che il taglio sia pulito e il lume aperto. Tagliare un pezzo di tubo PE 90 lungo 10 centimetri utilizzando una lametta affilata. Applicare una goccia di collante JB Weld al punto medio del tubicino mediante aspirazione orale.Inserire il tubo piccolo e la saldatura all'interno del foro del tubo grande e lasciare polimerizzare tutta la notte. Anche se non mostrato, eseguire un taglio a 45 gradi all'estremità più spessa di questo tubo e montare su tale estremità un manicotto e una guarnizione ad anello. Nello stesso modo illustrato in precedenza.Smontare un elettrodo di aspirazione standard svitando il feral dall'estremità anteriore dell'elettrodo e il connettore BNC da quello posteriore. Ora deve essere realizzato un foro laterale inclinato verso il basso sul lato del corpo dell'elettrodo. Riscaldare un pezzo di metallo utilizzando un becco di Bunsen.Premere il metallo riscaldato nel foro esistente sul lato del barile con un angolo basso. Rimuovere il filo argentato dal connettore BNC tirando sul filo nel punto in cui si unisce al connettore. Immergere il connettore BNC nel xilene per un'ora per rimuovere la cera.Dopo aver rimosso la cera, sciacquare il connettore in acqua e asciugare con carta da cucina. Tagliare un pezzo di filo d'argento lungo 15 centimetri. Immergere il filo nella candeggina per 15 minuti.Quindi risciacquare e asciugare con salviette di carta. Saldatare il filo d'argento al connettore BNC. Inserire il filo d'argento nell'estremit&agrave; posteriore del barile dell'elettrodo di aspirazione, lasciando spazio sufficiente affinch&eacute; il connettore BNC rimanga di lato.Inserire il tubo di aspirazione nel foro laterale per circa tre centimetri. Iniettare il sigillante in silicone nell'apertura posteriore dell'elettrodo di aspirazione, evitando che fuoriesca dal foro laterale coprendolo con un dito. Iniettare il sigillante per circa due o tre centimetri all'interno del corpo dell'elettrodo.Una volta fallito, avvitare saldamente il connettore BNC al suo posto, in modo da spingere in avanti il sigillante. Lasciare polimerizzare il sigillante per tutta la notte. Avvitare il feraglio del tubicino, realizzato con il metodo della punta tirata o della punta tagliata, sulla parte anteriore del raddrizzatore dell'elettrodo.Il tubicino faciliterà il passaggio del filo d'argento attraverso l'elettrodo, che ora è completo. Il sistema di registrazione viene posizionato all'interno di una gabbia di Faraday per ridurre le interferenze esterne. Il nostro sistema è stato inoltre posizionato su un tavolo antivibrazioni ad aria per eliminare le interferenze meccaniche.Gli elettrodi sono montati su micromanipolatori con supporto magnetico e posizionati vicino alla piastra di registrazione. I cavi coassiali BNC sono collegati a una testa di registrazione, che a sua volta è collegata a un amplificatore. L'amplificatore è collegato a un adattatore poly view, il quale è collegato al computer.Questo apparato è mostrato in primo piano. I cavi coassiali BNC sono collegati a uno stadio testa. Lo stadio testa è collegato all'amplificatore.L'uscita dell'amplificatore esce dalla gabbia di Faraday ed è collegata a un adattatore polivista. L'adattatore polivista è collegato al computer che ha il software di registrazione appropriato installato. L'intera configurazione deve essere correttamente messa a terra.Un collegamento a terra esterno viene stabilito collegando la gabbia di Faraday e il tavolo pneumatico a massa. Un collegamento a terra interno viene stabilito cablando la piastra di dissezione allo stadio della testa. È inoltre necessario collegare a massa le porte della gabbia al corpo principale.Con l'adeguata configurazione, i dati possono ora essere raccolti. Grazie per aver guardato questo video e per aver contribuito a fornire un aiuto per i vostri futuri esperimenti.

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