Name: Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri la microscopia elettronica a scansione con fascio ionico concentrato per l'imaging tridimensionale del tessuto cerebrale incluso in resina. Questo metodo offre alta risoluzione per studi neuroscientifici dettagliati.

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1. Esempio di fissazione e di inclusione in resina <ol><li> I campioni di tessuto fresco e le cellule sono fissati per almeno 2 ore nel 2% paraformaldeide e glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato 0,1 M a pH di 7,4. La dimensione del campione non deve superare i 0,150 millimetri di spessore per consentire la penetrazione adeguata o fissativo, e non deve essere lasciato in correzione per più di 12 ore. </li><li> Mettere i campioni in fiale da 20 ml scintillazione vetro e sciacquarli per tre volte, 5 minuti ciascuno, in tampone 0,1 M cacodilato. </li><li> Macchia con 1,5% (w / v) di tetrossido di osmio ferrocianuro di potassio e 1% (w / v) in tampone 0,1 M cacodilato (0,1 M, pH 7,4) per 30 minuti. </li><li> Macchia con tetrossido di osmio 1,0% (w / v) in tampone 0,1 M cacodilato per 30 minuti. </li><li> Sciacquare subito con acqua bidistillata per 3 minuti. </li><li> Macchia con 1% (w / v) di acetato di uranile in camera doppia acqua distillata per 30 minuti. </li><li> Sciacquare sezioni per 5 minuti in acqua bidistillata, disidratano e poi in serie alcool classificato, 2 minuti a ogni cambio (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Incorpora in concentrazioni crescenti di resina Durcupan mescolata con l'etanolo, 30 minuti ogni cambiamento, partendo da 50% Durcupan in etanolo, seguito da: 70%, 90%, 95%, e poi 100%. </li><li> Sostituire con Durcupan fresco e agitare lentamente per 4 ore. </li><li> Sezioni luogo, utilizzando stuzzicadenti di legno, su vetro microscopi vetrini rivestiti con l'agente di separazione dello stampo, e mettere in forno a 65 ° C per 24 ore. </li></ol> 2. Preparazione del campione per il FIB / SEM <ol start="11"><li> Separare lo strato di resina, contenenti i campioni, da tra i due vetrini e microscopio lavare accuratamente per rimuovere qualsiasi forma di separazione agente. </li><li> Utilizzando un microscopio a luce trasmessa con gli obiettivi di bassa potenza, o dissezione microscopio con illuminazione trasmessa, per identificare la regione di interesse all'interno della fetta di resina. </li><li> Tagliare un piccolo (3 mm x 3 mm) quadrati attorno alla regione di interesse con una lama di rasoio e questo bastone alla cima del blocco di resina bianca con colla acrilica (Figura 1). Attendere 5 minuti per la colla per indurire, e poi procedere con il passo successivo. </li><li> Bloccare il blocco nel supporto del ulramicrotome e, utilizzando lo stereomicroscopio collegato, ritagliare intorno alla regione di interesse con una lama di rasoio fino a solo una piccola piramide di resti materiali. </li><li> Ulteriori tagliare il blocco, con un coltello di vetro fisso nella ultramicrotomo, in modo che la regione di interesse può essere localizzato con precisione rispetto alle dimensioni della superficie del blocco (Figura 1). Tagliare un bordo del blocco, vicino alla regione di interesse, in modo che un passo perpendicolare viene tagliato attraverso il campione (Figura 1 e 2). Questa fase costituisce il volto di imaging (Figura 2). </li><li> Rimuovere il blocco dal ultramicrotomo e fotografare la regione di interesse all'interno del blocco, utilizzando un microscopio a luce trasmessa. </li><li> Tagliare il blocco tagliato fuori il mozzicone resina rimanenti. Questo viene fatto utilizzando visto una gioielleria ed assicura che solo un piccolo blocco è collocato all'interno del FIB / SEM. L'altezza totale di questo blocco non deve essere superiore a 5 mm. </li><li> Incollare il blocco di uno stub in alluminio con pasta di carbonio garantire che il lato da acquisire è sul bordo più esterno (Figura 1). </li><li> Dopo che la colla si è asciugata, rivestire il blocco con un sottile strato di oro (&gt; 20 nm; sistema di aspirazione Cressington evaporazione). </li></ol> 3. Imaging nella FIB / SEM <ol start="20"><li> Con un ingrandimento basso, e con elettroni secondari di imaging (5 kV, 0,5 nAmp), orientare il blocco in modo che la regione di interesse e scelto il lato del blocco di essere ripreso sia rivolto verso l'operatore (Figura 2 c, d). </li><li> Orientare il blocco in modo che la faccia ad essere ripreso è parallelo al fascio di fresatura. Ciò significa che il fascio di elettroni è orientato a 54 ° a questa faccia (Figura 2 b). </li><li> L'utilizzo di un fascio di ioni di corrente 13-27 nAmps a 30 kV rimuovere una stretta banda di resina dalla parte anteriore della regione da acquisire. </li><li> Passa alla modalità di imaging retrodiffusi per vedere il volto fresato che sovrasta la regione di interesse. </li><li> Utilizzando la microscopia a luce immagine di riferimento (presa a passo 16) e l'immagine del volto fresato individuare l'area esatta sul blocco da fresare e ripreso (Figura 2). </li><li> Depositare uno strato protettivo (circa 1 micron di spessore) di carbonio (o metallo), utilizzando il sistema di iniezione di gas del microscopio, sulla superficie del blocco, al di sopra della regione di interesse (Figura 2). </li><li> Utilizzando una corrente di 700 picoAmps, mulino finemente la regione del blocco all'interno del quale le immagini finale sarà presa. </li><li> Lascia il raggio di fresatura a questo mulino completamente volto immagine fino a quando non gli artefatti di fresatura può essere visto sul viso. Un mulino completa del viso è controllato da osservare i cambiamenti in ogni immagine successiva attraverso l'intero campo visivo. Fresatura inadeguato può anche visto come striature bianche o 'tende' apparire Vertically nell'immagine. </li><li> Lasciare il microscopio per almeno 2 ore per tutte le modifiche termica da smaltire. Questo riduce il rischio che la faccia blocco andrà alla deriva durante l'imaging, con conseguente immagini disallineate. </li><li> Selezionare i parametri microscopio per l'imaging del viso in serie. Assicurarsi che il fascio di elettroni ha una tensione che è abbastanza basso per l'immagine solo una profondità di materiale a fronte del blocco. Questo dovrebbe anche essere molto meno profonda di quanto lo spessore della faccia da rimuovere. I parametri tipici per l'imaging sono tensioni tra 1,2-2,0 kV con dimensioni in pixel di tra 4 - 20 nm. Il pixel sosta bisogno di tempo per essere mantenuta intorno al 10 μsecs in modo che il tempo totale per macinare il viso e acquisire una sola immagine viene mantenuta sotto i 2 minuti (Figura 3). </li></ol> 4. Segreti del successo Passo 1) Assicurarsi che i campioni non sono più spessi 150 micron. Ciò consentirà un'adeguata penetrazione delle macchie diverse e resina nel materiale. Ciò può essere ottenuto sezionando i campioni con un vibratome subito dopo la fissazione. Questo spessore è appropriato per il tessuto cerebrale. Altri tessuti devono essere testati per garantire adeguato di fissazione e colorazione. Fase 3) I campioni devono essere liberamente distribuiti in tutta la soluzione, e non raggruppate in una parte del flaconcino mentre questo fissativo secondario è introdotto. Questo garantirà la massima penetrazione del campione e di ridurre il campione diventa distorto durante questo processo di fissazione. Questo risultato è ottenuto rimestando delicatamente i campioni all'interno della fiala immediatamente dopo la soluzione è aggiunto. Punto 15) Assicurarsi che la regione di interesse si trova immediatamente sotto (&lt;30 micron) la superficie del blocco. Ciò consentirà di ridurre la quantità di fresatura dal fascio di ioni durante la fase di acquisizione delle immagini. Punto 22) Il tempo di scansione del fascio di ioni deve essere adequte per assicurare che il volto di imaging intero è completamente fresato. Fresatura inadeguata verrà mostrato come striature bianche, o 'tende' che appaiono in verticale lungo il viso di imaging. Punto 26) La faccia finale fresato deve essere più grande il volto che è immaginato. Questo perché la resina fresato viene espulso dal blocco e redeposits sulla superficie del blocco nelle immediate vicinanze. Questo rideposizione può sconfinare in campo dell'imaging di vista, ed è evitata mediante fresatura una zona molto più ampia di quella immaginata. Per una finestra di imaging che è di 20 micron di larghezza, il volto blocco fresato è maggiore di 30 micron di larghezza. Punto 29) E 'fondamentale che i parametri di fascio di elettroni sono tali che l'immagine è generata da elettroni che emergono da solo il nanometri prime della superficie del blocco. Questo è un acheved riducendo al minimo la tensione al di sotto del 2 kV e assicurando che nessun elettrone penetrare troppo in là. Questo è anche aiutato con una tensione di griglia sul rivelatore in modo che solo l'elettrone con le più alte energie contribuire all'immagine finale. Tipicamente, una tensione di 1,3 kV griglia viene utilizzato per una tensione di imaging di 1,5 kV. 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparazione del blocco di resina. A) in resina incorporata sezione coronale (80 micron di spessore) con un cervello di ratto adulto visualizzati in un steromicroscope. L'immagine mostra chiaramente le differenti regioni del cervello che può essere tagliato dalla sezione (b) utilizzando un bisturi. Qui, un 1 mm quadrati dalla corteccia viene rimossa e (c) attaccato ad un blocco di resina bianca. D) Il blocco di resina viene poi tagliato con un coltello di vetro montato in un ultramicrotomo, e una volta che il blocco è stato ridotto a lasciare solo il regione di interesse (e), un passo è tagliata perpendicolarmente alla superficie anteriore del materiale incorporato. f) Tutta questa regione assettato è poi tagliato dal resto della resina e montato su un perno in alluminio pronto per il rivestimento di metallo e di imaging nella microscopio elettronico a scansione. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Preparazione del viso blocco per FIB / SEM imaging. A) e b) mostrano le illustrazioni del blocco e il bordo che viene macinato per creare il volto di imaging (indicata con il nero doppia freccia). La posizione del fascio di ioni (bianco) viene mostrata in parallelo alla faccia di imaging, e il fascio di elettroni (grigio) è indicata colpire la faccia a 54 ° rispetto al fascio di ioni. C) mostra una visione del blocco prese con il fascio di elettroni e ripreso con gli elettroni secondari. Lungo questo lato del blocco di una regione più scura (indicata con la scatola bianca punteggiata) mostra una parte del viso che è stato di circa lavorato (mostrato con doppia testatandr freccia nera) per rivelare il campione di fondo. d) Quando questa regione è ripreso solo con gli elettroni retrodiffusi il tessuto incorporato può essere visto. Qui, l'intera larghezza della sezione di tessuto incorporato è indicato con una doppia freccia a due punte bianche. Barra di scala in c) è di 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imaging il volume del tessuto cerebrale con voxel isotropico. A) l'immagine invertita retrodiffusi contrasto del blocco che mostra il volto ultrastruttura all'interno di una regione del cervello di ratto. Tutte le membrane sono visibili così come le strutture macromolecolari di grandi dimensioni. B) Un totale di 1600 immagini sono state raccolte in 5 spaziatura nm con un conseguente serie di immagini con voxel isotropico. C) Questa pila può essere ripreso in qualsiasi aereo con la stessa risoluzione. Questa immagine mostra singola connessione sinaptica che è ripreso nel piano xy e il piano yz.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La tecnica della FIB / SEM funziona in modo ottimale quando la regione di interesse non è troppo grande. Il limite massimo per un volume ripreso dipende dal fascio di ioni e la zona che può costantemente mulino ripetutamente nell&#39;arco di molte ore. Finora questo è stato fatto con aree di circa 60 x 60 micron, tuttavia, questa immagine intera area non è possibile con una risoluzione di immagine adatta, soprattutto per il fattore tempo nella raccolta di una grande immagine. A titolo di esempio, un 4 immagine kx 4 k pixel con un tempo di permanenza a 10 microsecondi sarebbe prendere 2 minuti e 40 secondi di acquisire, e per un campo di vista di 60 micron questo sarebbe solo dare una dimensione del pixel di 15 nm. Per l&#39;imaging l&#39;ultrastruttura di cellule e tessuti, una dimensione del pixel più piccolo è più adatto, di solito tra i 4 ei 10 nm / pixel. Per una superficie di 60 x 60 micron l&#39;immagine sarebbe stata acquisita in 10 ore, anche se il microscopio fosse questa possibilità. Per queste ragioni, il microscopio è uno strumento ideale per i volumi di immagini nell&#39;ordine di 10 x 10 x 10 micron, o regioni significativa di cellule intere. Questo può essere fatto facilmente in un periodo di 48 ore su campioni che sono ben in contrasto con questa procedura. Finora il protocollo è stato utilizzato principalmente con tessuto cerebrale, così come vari tipi di colture di cellule di mammifero aderire a lamelle. Tuttavia, la procedura di fissazione e la colorazione può essere utilizzato con molti altri tipi di materiale biologico, anche materiale vegetale per produrre ugualmente pile immagine ben contrastata. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di volumi di immagine con voxel isotropico. Pile immagine di questo tipo permettono di analisi del volume 3d con immagini scattate in qualsiasi aereo nello stack. Il vantaggio di questo è di permettere all&#39;osservatore di caratteristiche dell&#39;immagine nella serie di immagini da qualsiasi direzione e fornendo un maggiore dettaglio immagine (Figura 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Collante cianoacrilato </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan resina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscopio (Zeiss, nVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetro istologia diapositive </td><td> Menzel-Glaser, Germania </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Vetro coltellinaio: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Scintillazione fiale di vetro (20 ml) </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Gioielleria sega </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Mould distaccante </td><td> Glorex, Svizzera </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Osmio tetrossido </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sali di fosfato di tampone fosfato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td> 71642 e 71496 </td></tr><tr><td> Sodio cacodilato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater con target d&#39;oro </td><td> Cressington, Stati Uniti </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotomo: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di uranile </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

ion beam concentrato di fresatura e microscopia elettronica a scansione di tessuto cerebrale

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Questo protocollo descrive come campioni biologici, come il tessuto cerebrale, è possibile creare immagini in tre dimensioni con il fascio di ioni focalizzati / microscopio elettronico a scansione (FIB / SEM). I campioni sono fissati con aldeidi, macchiata da metalli pesanti utilizzando tetrossido di osmio e acetato di uranile. Essi vengono poi disidratate con alcool e infiltrati con resina, che viene poi fissata. Utilizzando un microscopio ottico e ultramicrotomo con coltelli in vetro, un piccolo blocco contenente l&#39;interesse regione vicino alla superficie è fatto. Il blocco viene poi inserito all&#39;interno della FIB / SEM, e il fascio di ioni utilizzato per circa mulino una parete verticale lungo un lato del blocco, nei pressi di questa regione. Utilizzando elettroni retrodiffusi per l&#39;immagine delle strutture sottostanti, un volto più piccolo viene poi macinato con un fascio di ioni più fine e la superficie esaminata più da vicino per determinare l&#39;area esatta del faccia a essere ripreso e fresati. I parametri del microscopio sono quindi impostare in modo che il volto è ripetutamente fresato e ripreso in modo che le immagini seriali sono raccolti attraverso un volume del blocco. La serie di immagini in genere contengono voxel isotropico di dimensioni più piccole uno nm 4 in ogni direzione. Questa qualità delle immagini in qualsiasi piano di imaging permette all&#39;utente di analizzare ultrastruttura cellulare in qualsiasi angolo di visione all&#39;interno della serie di immagini.

Questo protocollo descrive come il tessuto cerebrale resina incorporati possono essere preparati e ripreso nelle tre dimensioni del fascio di ioni focalizzato, microscopio elettronico a scansione.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

Questo protocollo descrive come campioni biologici, come il tessuto cerebrale, possano essere acquisiti in immagini tridimensionali utilizzando il fascio ionico focalizzato/microscopio elettronico a scansione...

Lo scopo di questa procedura è acquisire immagini seriali attraverso una specifica regione del tessuto cerebrale utilizzando un microscopio elettronico a scansione con fascio ionico focalizzato. Questo viene realizzato innanzitutto sezionando il cervello in fette che vengono colorate e quindi incorporate in resina. Il secondo passaggio consiste nel tagliare la regione di interesse dalla sezione cerebrale inclusa e montarla su un blocco di resina vuoto.Il terzo passaggio consiste nel sagomare il blocco di resina con un ultramicrotomo e utilizzare il fascio ionico del microscopio per isolare esclusivamente la regione da immaginare. L'ultimo passaggio prevede l'acquisizione seriale di immagini di una faccia del blocco di resina, utilizzando il fascio ionico per rimuovere ripetutamente strati sottili prima di ogni acquisizione. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano immagini seriali attraverso una regione di interesse.La serie di immagini viene acquisita automaticamente e il set di dati è tipicamente composto da voxel isotropi, in modo che le strutture dell'immagine possano essere visualizzate da qualsiasi angolazione all'interno dello stack. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia elettronica a trasmissione con sezioni seriali, è la capacità di raggiungere una risoluzione in Z molto più elevata. Rispetto alla tomografia elettronica, inoltre, consente di acquisire volumi molto più grandi a una risoluzione ottimale per campioni inclusi in resina.La procedura inizia con la dissezione del cervello fissato di un ratto anestetizzato e perfuso. Immergere il cervello in agar al 5% caldo in uno stampo di plastica, orientare il cervello all'angolo corretto prima che l'agar si solidifichi, quindi montare il blocco di agar con il cervello al suo interno su un supporto per campioni utilizzando un vibratomo. Tagliare sezioni coronali di 80 micron, ottenendo tante sezioni quante sono necessarie per includere la regione di interesse.Successivamente, posizionare i campioni in vial di vetro da 20 millilitri. Collocare fino a 10 sezioni per vial. Lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuna in tampone K coate 0,1 molare.Quindi colorare i campioni con cianuro di potassio al 1,5% e tetrossido di osmio all'1% in tampone K coate 0,1 molare per 30 minuti. Proseguire la colorazione dei campioni con tetrossido di osmio all'1% in tampone K coate 0,1 molare per 30 minuti. Successivamente, risciacquare una volta con acqua doppio-distillata per tre minuti, quindi colorare con acetato di al all'1% in acqua doppio-distillata per 30 minuti.Successivamente, lavare i preparati per cinque minuti in acqua doppio distillata, quindi disidratarli mediante una serie alcolica crescente, lasciando due minuti per ogni passaggio. Il passaggio successivo consiste nell'infiltrare i preparati in concentrazioni crescenti di resina Duran mescolata con alcol, lasciando 30 minuti tra ogni cambio. Iniziare con un rapporto 50 a 50 tra etanolo e resina, poi 30 a 70, quindi 10 a 90, infine immergere i preparati in resina al 100% per 30 minuti.Quindi sostituire il mezzo con resina Duran fresca al 100%. Agitare lentamente per un'ora sul miscelatore a rulli. Dopo l'inclusione, utilizzare uno stecchino di legno per posizionare le sezioni su vetrini di vetro precedentemente ricoperti con agenti distaccanti per stampi.Posizionare il maggior numero possibile di sezioni sui vetrini, avendo cura di non affollare eccessivamente i vetrini. Assicurarsi che un'etichetta identificativa sia posizionata anche tra i vetrini del microscopio. Collocare i vetrini in un forno a 65 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo, rimuovere i campioni dal forno. Spingere delicatamente una lametta da rasoio tra le lamelle di vetro del microscopio ed estrarre lo strato di resina contenente i campioni da tra le lamelle, tenendo lo strato di resina con le dita. Lavare delicatamente il campione sotto acqua corrente.Per rimuovere eventuali agenti di distacco del calibro, posizionare il campione sotto un microscopio stereoscopico con illuminazione trasmessa utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Delimitare la regione di interesse con un ago sottile. Utilizzare una lametta per tagliare un piccolo quadrato di tre millimetri per tre millimetri intorno alla regione di interesse.Utilizzare una colla acrilica per attaccare il blocchetto di resina piccolo alla sommità di un blocchetto di resina vuoto. Successivamente, fissare il blocchetto nel portacampione dell'ultramicrotomo. Guardando attraverso il microscopio stereoscopico collegato, utilizzare una lametta per tagliare intorno alla regione di interesse fino a quando rimane solo una piccola piramide di materiale.Tagliare il bordo del blocco vicino alla regione di interesse con un angolo rispetto alla superficie superiore del blocco, utilizzando un coltello di vetro fissato al microtomo ultramacrino. Procedere ulteriormente a rifinire il blocco in modo che la regione di interesse possa essere localizzata con precisione rispetto alle dimensioni della superficie del blocco. Rimuovere il blocco dal microtomo ultramacrino e posizionarlo sotto un microscopio a luce trasmessa.Fotografare la regione di interesse. Utilizzare una sega da gioielliere per tagliare il blocco rifinito staccandolo dal moncone residuo di resina con vernice conduttiva al carbonio. Fissare il blocco SA su un portacampioni per microscopia elettronica a scansione (SEM) e orientarlo in modo che il lato da analizzare sia rivolto verso il bordo più esterno.Dopo che la colla si &egrave; asciugata, trasferire il preparato su un sistema a evaporazione sotto vuoto e ricoprire il blocco con uno strato sottile di oro di spessore superiore a 20 nanometri. Il blocco di tessuto inclusi in resina &egrave; ora pronto per essere analizzato al microscopio elettronico a scansione con fascio ionico focalizzato. Inserire il campione nel suo portacampione all'interno del microscopio a basso ingrandimento e, utilizzando l'immagine ad elettroni secondari, orientare il blocco in modo che la regione di interesse e il lato del blocco da analizzare siano rivolti verso l'obiettivo.L'operatore orienta il blocco in modo che la faccia da immagini sia parallela al fascio di fresatura. Ciò determina che il fascio di elettroni sia orientato a 54 gradi rispetto a questa faccia, utilizzando una corrente del fascio ionico compresa tra 13 e 27 nanoampere a 30 chilovolt.Rimuovere una sottile striscia di resina dalla parte anteriore della regione da immaginiare. Successivamente, passare alla modalità di imaging a retrodiffusione per visualizzare la superficie fresata che si trova sopra la regione di interesse. Utilizzando l'immagine di riferimento ottenuta in microscopia ottica in precedenza e l'immagine della superficie fresata, individuare esattamente la regione sul blocco da fresare e immaginare mediante il sistema di iniezione di gas del microscopio.Deposita uno strato protettivo di carbonio o metallo dello spessore di circa un micron sulla superficie del blocco, nella zona di interesse, utilizzando una corrente di 700 picoampere. Infine, esegui la fresatura della regione del blocco all'interno della quale verranno acquisite le immagini finali. Lascia che il fascio di fresatura rimuova completamente questa superficie di imaging fino a quando sulla faccia non siano visibili artefatti di fresatura.Selezionare i parametri del microscopio per l'acquisizione sequenziale dell'immagine della faccia. I parametri tipici prevedono tensioni comprese tra 1,2 e due kilovolt e dimensioni dei pixel comprese tra quattro e 20 nanometri. Il tempo di permanenza del pixel deve essere di circa 10 microsecondi, in modo che il tempo totale necessario per fresare la faccia e acquisire un'immagine sia inferiore a due minuti.Lasciare riposare il microscopio per almeno due ore per consentire l'assorbimento di eventuali variazioni termiche. Per dissipare, avviare il processo di fresatura e di acquisizione delle immagini per ottenere immagini seriali della regione di interesse. Questa figura mostra l'immagine retrodiffusa a contrasto inverso della faccia del blocco, che evidenzia l'ultrastruttura all'interno di una regione del cervello avvolto.Tutte le membrane sono visibili, così come le grandi strutture macromolecolari. Questa figura è composta da un totale di 1.600 immagini raccolte con un intervallo di cinque nanometri, risultando in una serie di immagini con voxel isotropi. Questa serie può essere visualizzata in qualsiasi piano con la stessa risoluzione.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare il tessuto cerebrale per l'imaging seriale mediante microscopio elettronico a scansione con fascio focalizzato.

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Neuroscienze

Prendi una sezione fissa di tessuto cerebrale corticale di topo che mostra assoni e dendriti neuronali. I dendriti possiedono sporgenze, note come spine dendritiche, che formano sinapsi con gli assoni. Incubare il tessuto con osmio-ferrocianuro, che si lega ai lipidi, seguito da un'altra applicazione di osmio, che migliora il contrasto strutturale per l'imaging. Colorare con un composto di metalli pesanti che si lega alle macromolecole e migliora il contrasto. Disidratare utilizzando...

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Qui presentiamo un protocollo per combinare in modo efficiente la faccia a blocchi seriali e la microscopia elettronica a scansione del fascio ionico focalizzato per indirizzare un'area di interesse. Ciò consente una ricerca efficiente, in tre dimensioni e l'individuazione di eventi rari in un ampio campo visivo.

Studi mirati utilizzando la faccia a blocchi seriali e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato

Abbiamo dimostrato che l'incisione della nano-architettura nei dispositivi intracorticali di microelettrodi può ridurre la risposta infiammatoria e ha il potenziale per migliorare le registrazioni elettrofisiologiche. I metodi descritti qui delineano un approccio per incidere le nano-architetture nella superficie di microelettrodi intracorticali in silicio a stilo non funzionali e funzionali.

Focalizzata la litografia del fascio ionico per esacire di nano-architetture nei microelettrodi

Qui, presentiamo una pipeline per la fresatura di fasci ionici focalizzati correlativi 3D sulla guida della preparazione di campioni cellulari per la tomografia crioelettronica. La posizione 3D delle proteine di interesse marcate con fluorescenza viene prima determinata mediante microscopia a criofluorescenza e quindi mirata per la fresatura. Il protocollo è adatto per cellule di mammiferi, lieviti e batteri.

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Questo flusso di lavoro consente la produzione di lamelle mirate a strutture biologiche marcate in fluorescenza che sono piccole (&lt;1 μm di estensione assiale) e rare (1 copia per cellula) utilizzando una piattaforma di imaging criogenica tri-coincidente. Questa piattaforma integra la microscopia a fluorescenza, la fresatura a fascio ionico focalizzato e la microscopia elettronica a scansione in un'unica posizione focale e consente la microscopia a fluorescenza simultanea durante la fresatura.

Flusso di lavoro con un microscopio criogenico a fluorescenza coincidente, a fascio di elettroni e ioni per la fresatura mirata delle cellule

Abbiamo introdotto una tecnica di imaging innovativa chiamata Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), che consente l'imaging imparziale di tutte le cellule nei campioni cerebrali alla mesoscala e può essere integrata senza soluzione di continuità nel flusso di lavoro di imaging della microscopia elettronica a scansione seriale su nastro sullo stesso campione.

Un metodo di imaging ottico compatibile con microscopia elettronica a scansione per la mappatura mesoscopica del cervello di tutte le cellule

Scopri la microscopia elettronica a scansione con fascio ionico concentrato per l'imaging tridimensionale del tessuto cerebrale incluso in resina. Questo metodo offre alta risoluzione per studi neuroscientifici dettagliati.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

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