Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale
6 luglio 2011
Questo protocollo descrive come il tessuto cerebrale resina incorporati possono essere preparati e ripreso nelle tre dimensioni del fascio di ioni focalizzato, microscopio elettronico a scansione.
Lo scopo di questa procedura è quello di raccogliere immagini seriali attraverso una specifica regione del tessuto cerebrale utilizzando il fascio ionico focalizzato e il microscopio elettronico a scansione. Ciò si ottiene sezionando prima il cervello in fette che vengono colorate e poi incorporate nella resina. Il secondo passo consiste nel tagliare la regione di interesse dalla sezione del cervello incorporata e montarla su un blocco di resina vuoto.
Il terzo passo consiste nel tagliare il blocco di resina con un ultra microtomo e utilizzare il fascio ionico del microscopio per isolare solo la regione da visualizzare. Il passaggio finale consiste nell'acquisire un'immagine in serie di una faccia del blocco di resina utilizzando il fascio ionico per rimuovere ripetutamente gli strati sottili prima di scattare ogni immagine. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano immagini seriali attraverso una regione di interesse.
La serie di immagini viene raccolta automaticamente e il set di dati ha in genere voxel isotropi in modo che le strutture dell'immagine possano essere visualizzate da qualsiasi angolazione nello stack. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia elettronica a trasmissione a sezione seriale, è ma è in grado di raggiungere una risoluzione Z molto più elevata. Rispetto alla tomografia elettronica, è in grado di visualizzare volumi molto più grandi con una risoluzione ottimale per i campioni inclusi in resina.
La procedura inizia sezionando il cervello fisso da un ratto perfuso anestetizzato. Incorporare il cervello in caldo 5%aeros in uno stampo di plastica, orientare il cervello all'angolazione corretta prima dell'aros set solido montare il blocco aeros con il cervello all'interno su un supporto per campioni usando una fetta di vibrato. Le sezioni coronali da 80 micron tagliano tutte le sezioni necessarie per includere la regione di interesse.
Quindi posizionare i campioni in fiale isolanti di vetro da 20 millilitri. Posizionare fino a 10 sezioni per fiala. Sciacquare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno in tampone di coperto K 0,1 molare.
Quindi colorare i campioni con cianuro di potassio all'1,5% e tetrossido di osmio all'1% in tampone K coate 0,1 molare per 30 minuti. Continuare a colorare i campioni con tetrossido di osmio all'1% in tampone di rivestimento K molare 0,1 per 30 minuti. Successivamente, risciacquare una volta con acqua distillata doppia per tre minuti, quindi colorare con acetato all'1% in acqua distillata doppia per 30 minuti.
Quindi, sciacquare le sezioni per cinque minuti in acqua distillata doppia, quindi disidratarle in una serie di alcol graduale, lasciando due minuti per ogni cambio. Il passo successivo consiste nell'incorporare le sezioni in concentrazioni crescenti di resina Duran mescolata con alcol, lasciando passare 30 minuti tra un cambio e l'altro. Inizia con 50-50 etanolo in resina, poi da 30 a 70, poi da 10 a 90, infine nelle sezioni al 100% di resina per 30 minuti.
Quindi sostituisci il terreno con resina duran fresca al 100%. Agitare lentamente per un'ora sul miscelatore a rulli. Dopo l'inclusione, utilizzare un bastoncino da cocktail in legno per posizionare le sezioni su vetrini da microscopio che sono stati precedentemente rivestiti con agenti separatori per stampi.
Metti il maggior numero possibile di sezioni sugli scivoli, ma fai attenzione a non sovraffollare gli scivoli. Assicurarsi che un'etichetta identificativa sia posizionata anche tra i vetrini del microscopio. Mettere i vetrini in forno a 65 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, rimuovere i campioni dal forno. Spingere delicatamente una lama di rasoio tra i vetrini del microscopio e rimuovere lo strato di resina contenente i campioni tra i vetrini, tenendo lo strato di resina con le dita. Lavare delicatamente il campione sotto l'acqua corrente.
Per rimuovere eventuali agenti separatori dello stampo, posizionare il campione sotto un microscopio da dissezione con illuminazione trasmessa utilizzando un obiettivo a bassa potenza. Contrassegna la regione di interesse con un ago sottile. Usa una lama di rasoio per tagliare un piccolo quadrato di tre millimetri per tre millimetri attorno alla regione di interesse.
Usa la colla acrilica per attaccare il piccolo blocco di resina alla parte superiore di un blocco di resina vuoto. Quindi, bloccare il blocco nel supporto dell'ultra microtomo. Guardando attraverso lo stereomicroscopio collegato, usa una lama di rasoio per tagliare intorno alla regione di interesse fino a quando non rimane solo una piccola piramide di materiale.
Taglia il bordo del blocco vicino alla regione di interesse ad angolo rispetto alla superficie superiore del blocco usando un coltello da vetro fissato all'ultra microtomo. Tagliare ulteriormente il blocco in modo che la regione di interesse possa essere localizzata con precisione rispetto alle dimensioni della superficie del blocco. Rimuovere il blocco dall'ultra microtomo e posizionarlo sotto un microscopio a luce trasmessa.
Fotografa la regione di interesse. Usa una sega da gioielliere per tagliare il blocco rifilato dal tronchetto di resina rimanente con vernice al carbonio. Incollare il blocco di sblocco SA su un supporto per campioni SEM e orientarlo in modo che il lato da riprendere sia rivolto verso il bordo più esterno.
Dopo che la colla si è asciugata, trasferire il preparato in un sistema di evaporazione a mezzaluna e sottovuoto e rivestire il blocco con un sottile strato d'oro superiore a 20 nanometri. Il blocco di tessuto incorporato nella resina è ora pronto per essere visualizzato nel microscopio elettronico a scansione a fascio ionico focalizzato. Inserire il campione nel suo supporto nel microscopio a basso ingrandimento e, utilizzando l'imaging elettronico secondario, orientare il blocco in modo che la regione di interesse e il lato del blocco da riprendere siano rivolti.
L'operatore orienta il blocco in modo che la faccia da fotografare sia parallela alla trave di fresatura. Ciò si traduce in un fascio di elettroni orientato a 54 gradi rispetto a questa faccia utilizzando una corrente del fascio ionico da 13 a 27 nano ampere. A 30 kilovolt.
Rimuovere una stretta banda di resina dalla parte anteriore della regione da riprendere. Quindi, passare alla modalità di imaging retrodiffuso per visualizzare la faccia fresata che sovrasta la regione di interesse. Utilizzando l'immagine di riferimento al microscopio ottico scattata in precedenza e l'immagine della faccia fresata, individuare la regione esatta sul blocco da fresare e visualizzare l'immagine utilizzando il sistema di iniezione di gas del microscopio.
Depositare uno strato protettivo di circa un micron di spessore di carbonio o metallo sulla superficie del blocco sopra la regione di interesse utilizzando una corrente di 700 picoampere. Infine, fresa la regione del blocco all'interno della quale verranno scattate le immagini finali. Lasciare che la trave di fresatura esegua la fresatura completa della faccia dell'immagine fino a quando non sono visibili artefatti di fresatura sulla faccia.
Selezionare i parametri del microscopio per l'imaging seriale del viso. I parametri tipici sono tensioni comprese tra 1,2 e due kilovolt con dimensioni dei pixel comprese tra quattro e 20 nanometri. Il tempo di permanenza dei pixel dovrebbe essere di circa 10 microsecondi in modo che il tempo totale per fresare la faccia e acquisire un'immagine sia inferiore a due minuti.
Lasciare riposare il microscopio per almeno due ore per eventuali sbalzi termici. Per dissipare avviare il processo di fresatura e imaging per acquisire immagini seriali attraverso la regione di interesse. Questa figura mostra l'immagine retrodiffusa a contrasto inverso della faccia del blocco che mostra l'ultra struttura all'interno di una regione del cervello dell'involucro.
Tutte le membrane sono visibili così come le grandi strutture macromolecolari. Questa cifra è composta da un totale di 1.600 immagini raccolte a una spaziatura di cinque nanometri, risultando in una pila di immagini con voxel isotropi. Questo stack può essere riprodotto su qualsiasi piano con la stessa risoluzione.
Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il tessuto cerebrale per l'imaging seriale con il microscopio elettronico a scansione a fascio focalizzato.
Panoramica
Questo protocollo descrive la preparazione e l'acquisizione di immagini di tessuto cerebrale inclusi in resina in tre dimensioni mediante microscopio elettronico a scansione con fascio di ioni focalizzato. Il metodo consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di specifiche regioni cerebrali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di imaging
- Istologia
Sfondo
- La microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato offre vantaggi rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
- Fornisce una risoluzione Z più elevata e consente di analizzare volumi maggiori di campioni inclusi in resina.
- Questa tecnica è particolarmente utile per lo studio dell'architettura del tessuto cerebrale.
- L'imaging seriale permette un'analisi completa della regione di interesse.
Scopo dello studio
- Raccogliere immagini seriali del tessuto cerebrale per un'analisi strutturale dettagliata.
- Illustrare un metodo che migliora la risoluzione dell'imaging e la capacità di acquisizione volumetrica.
- Facilitare lo studio di regioni cerebrali specifiche in un contesto tridimensionale.
Metodi Utilizzati
- Dissezione e inclusione del tessuto cerebrale in resina.
- Taglio in serie e colorazione di fette cerebrali.
- Levigatura e montaggio del blocco di resina per l'acquisizione delle immagini.
- Acquisizione delle immagini mediante microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato.
Risultati principali
- Corretta acquisizione di immagini seriali attraverso la regione di interesse.
- Acquisizione di immagini ad alta risoluzione con voxel isotropi.
- Dimostrata capacità di visualizzare le strutture da più angolazioni.
- I risultati mostrano un miglioramento significativo rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'analisi mediante imaging di tessuto cerebrale inclusi in resina.
- La microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato è efficace per studi strutturali dettagliati.
- Questa tecnica può migliorare la nostra comprensione dell'organizzazione del tessuto cerebrale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato (FIB/SEM) consente l'acquisizione tridimensionale ad alta risoluzione di tessuto cerebrale con voxel isotropi piccoli fino a 4 nm, permettendo un'analisi ultrastrutturale dettagliata. Questa capacità migliora la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci in neuroscienze, fornendo informazioni meccanicistiche sull'architettura cellulare e sulla patologia. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici consentendo una visualizzazione multiangolare delle strutture tissutali senza artefatti da sezionamento.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la visualizzazione dettagliata dell'ultrastruttura cellulare e dei complessi macromolecolari.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico rivelando i bersagli strutturali nel loro contesto tissutale nativo.
- Valore predittivo: Migliora la fiducia nel bersaglio permettendo l'analisi del tessuto da qualsiasi angolazione all'interno dello stack di immagini.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce set di dati immagini standardizzati e riproducibili adatti ad analisi morfometriche quantitative.
- Scalabilità: Consente l'acquisizione di volumi più grandi rispetto alla tomografia elettronica, mantenendo la risoluzione ottimale per campioni inclusi in resina.
- Riutilizzo della piattaforma: Genera serie di immagini che possono essere ri-analizzate per multipli bersagli o vie metaboliche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la fedeltà strutturale dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica grazie a una risoluzione isotropa del voxel.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce le relazioni struttura-funzione nei tessuti cerebrali per guidare la selezione degli obiettivi.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati strutturali ad alta fedeltà su sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
FIB/SEM si integra nel percorso della scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'imaging preclinico, consentendo analisi strutturali che guidano l'identificazione dei composti promettenti e gli studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione di strutture subcellulari in volumi di tessuto integro.
- Screening: Fornisce set di dati tridimensionali quantitativi e isotropi, che permettono confronti affidabili di fenotipi strutturali tra diverse condizioni.
- Analisi: Consente l'imaging seriale con risoluzione su scala nanometrica, permettendo misurazioni morfometriche precise e analisi statistiche dell'architettura tissutale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati strutturali ottenuti nella fase di scoperta a modelli preclinici attraverso un imaging coerente e ad alta risoluzione del tessuto cerebrale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile per studi longitudinali sull'interazione con i bersagli terapeutici e sulla risposta del tessuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi su tessuti cerebrali.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione attraverso flussi di lavoro automatizzati per la sezione seriale e l'acquisizione di immagini.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'acquisizione di immagini su larga scala ad alta risoluzione, riducendo la necessità di tecniche complementari multiple.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione corretta per il rischio fornendo dati strutturali dettagliati sull'interazione con l'obiettivo e sulla patologia tissutale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, inclusione in resina e tecniche di microscopia elettronica.
- Presuppone l'accesso a microscopi elettronici a scansione con fascio di ioni focalizzato dotati di sistemi di iniezione di gas e di rivestimento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione del campione, di colorazione e di inclusione.
- Comporta la necessità di adattamenti quando il metodo viene applicato a diverse regioni cerebrali o modelli di malattia.
- Comprende limitazioni pratiche, come tempi di elaborazione prolungati e la necessità di un rivestimento conduttivo prima dell'acquisizione delle immagini.
