Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale
6 luglio 2011
Questo protocollo descrive come il tessuto cerebrale resina incorporati possono essere preparati e ripreso nelle tre dimensioni del fascio di ioni focalizzato, microscopio elettronico a scansione.
Lo scopo di questa procedura è acquisire immagini seriali attraverso una specifica regione del tessuto cerebrale utilizzando un microscopio a ioni focalizzati e a scansione elettronica. Questo viene realizzato innanzitutto sezionando il cervello in fette che vengono colorate e quindi incorporate in resina. Il secondo passaggio consiste nel tagliare la regione di interesse dalla sezione cerebrale inclusa e montarla su un blocco di resina vuoto.
Il terzo passaggio consiste nel sagomare il blocco di resina con un ultramicrotomo e utilizzare il fascio ionico del microscopio per isolare esclusivamente la regione da immaginare. L'ultimo passaggio prevede l'acquisizione seriale di immagini di una faccia del blocco di resina, utilizzando il fascio ionico per rimuovere ripetutamente strati sottili prima di ogni acquisizione. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano immagini seriali attraverso una regione di interesse.
La serie di immagini viene acquisita automaticamente e il set di dati è tipicamente composto da voxel isotropi, in modo che le strutture dell'immagine possano essere visualizzate da qualsiasi angolazione all'interno dello stack. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia elettronica a trasmissione con sezioni seriali, è la capacità di raggiungere una risoluzione Z molto più elevata. Rispetto alla tomografia elettronica, inoltre, consente di acquisire immagini di volumi molto più grandi a una risoluzione ottimale per campioni inclusi in resina.
La procedura inizia con la dissezione del cervello fissato di un ratto anestetizzato e perfuso. Immergere il cervello in agar al 5% caldo in uno stampo di plastica, orientare il cervello all'angolo corretto prima che l'agar si solidifichi, quindi montare il blocco di agar con il cervello al suo interno su un porta-campione utilizzando un vibratomo. Tagliare sezioni coronali di 80 micron, ottenendo tante sezioni quante sono necessarie per includere la regione di interesse.
Successivamente, posizionare i campioni in vial di vetro da 20 millilitri. Collocare fino a 10 sezioni per vial. Lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuna in tampone K coate 0,1 molare.
Quindi colorare i campioni con cianuro di potassio al 1,5% e tetrossido di osmio all'1% in tampone K coate 0,1 molare per 30 minuti. Continuare la colorazione dei campioni con tetrossido di osmio all'1% in tampone K coate 0,1 molare per 30 minuti. Successivamente, sciacquare una volta con acqua doppia distillata per tre minuti, quindi colorare con acetato di al all'1% in acqua doppia distillata per 30 minuti.
Successivamente, risciacquare le sezioni per cinque minuti in acqua distillata doppia, quindi disidratarle in una serie alcolica a concentrazioni crescenti, prevedendo due minuti per ogni passaggio. Il passo successivo consiste nell'infiltrare le sezioni in concentrazioni crescenti di resina Duran mescolata con alcol, lasciando 30 minuti tra un passaggio e l'altro. Iniziare con un rapporto 50 a 50 tra etanolo e resina, poi 30 a 70, quindi 10 a 90, infine immergere le sezioni in resina al 100% per 30 minuti.
Quindi sostituire il mezzo con resina duran fresca al 100%. Agitare lentamente per un'ora sul miscelatore a rulli. Dopo l'inclusione, utilizzare uno stecchino di legno per posizionare le sezioni su vetrini di vetro precedentemente ricoperti con agenti distaccanti per stampi.
Posizionare il maggior numero possibile di sezioni sui vetrini, avendo cura di non affollare eccessivamente i vetrini. Assicurarsi che un'etichetta identificativa sia posizionata anche tra i vetrini del microscopio. Collocare i vetrini in un forno a 65 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, rimuovere i campioni dal forno. Spingere delicatamente una lametta da rasoio tra le lamelle di vetro del microscopio ed estrarre lo strato di resina contenente i campioni da tra le lamelle, tenendo lo strato di resina con le dita. Lavare delicatamente il campione sotto acqua corrente.
Per rimuovere eventuali agenti di distacco del calibro, posizionare il campione sotto un microscopio stereoscopico con illuminazione trasmessa utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Delimitare la regione di interesse con un ago sottile. Utilizzare una lametta per tagliare un piccolo quadrato di tre millimetri per tre millimetri intorno alla regione di interesse.
Utilizzare una colla acrilica per attaccare il blocchetto di resina piccolo alla sommità di un blocchetto di resina vuoto. Successivamente, fissare il blocchetto nel portacampione dell'ultramicrotomo. Guardando attraverso il microscopio stereoscopico collegato, utilizzare una lametta per tagliare intorno alla regione di interesse fino a quando rimane solo una piccola piramide di materiale.
Tagliare il bordo del blocco vicino alla regione di interesse con un angolo rispetto alla superficie superiore del blocco, utilizzando un coltello di vetro fissato al microtomo ultramacrino. Proseguire con l'ulteriore sagomatura del blocco in modo che la regione di interesse possa essere localizzata con precisione rispetto alle dimensioni della superficie del blocco. Rimuovere il blocco dal microtomo ultramacrino e posizionarlo sotto un microscopio a luce trasmessa.
Fotografare la regione di interesse. Utilizzare una sega da gioielliere per tagliare il blocco rifinito staccandolo dal moncone residuo di resina con vernice conduttiva al carbonio. Fissare il blocco SA su un portacampioni per microscopia elettronica a scansione (SEM) e orientarlo in modo che il lato da analizzare sia rivolto verso il bordo più esterno.
Dopo che la colla si è asciugata, trasferire il preparato su un sistema a evaporazione sotto vuoto e ricoprire il blocco con uno strato sottile di oro di spessore superiore a 20 nanometri. Il blocco di tessuto inclusi in resina è ora pronto per essere analizzato al microscopio elettronico a scansione con fascio ionico focalizzato. Inserire il campione nel suo portacampione all'interno del microscopio a basso ingrandimento e, utilizzando l'immagine a elettroni secondari, orientare il blocco in modo che la regione di interesse e il lato del blocco da analizzare siano rivolti verso l'esterno.
L'operatore orienta il blocco in modo che la faccia da immagini sia parallela al fascio di fresatura. Ciò determina un orientamento del fascio di elettroni a 54 gradi rispetto a questa faccia, utilizzando una corrente di fascio ionico compresa tra 13 e 27 nanoampere a 30 chilovolt.
Rimuovere una sottile striscia di resina dalla parte anteriore della regione da immaginiare. Successivamente, passare alla modalità di imaging a retrodiffusione per visualizzare la superficie fresata che sovrasta la regione di interesse. Utilizzando l'immagine di riferimento ottenuta in microscopia ottica in precedenza e l'immagine della superficie fresata, individuare con precisione la regione sul blocco da fresare e immaginare mediante il sistema di iniezione di gas del microscopio.
Deposita uno strato protettivo di carbonio o metallo dello spessore di circa un micron sulla superficie del blocco sopra la regione di interesse utilizzando una corrente di 700 picoampere. Infine, esegui la fresatura della regione del blocco all'interno della quale verranno acquisite le immagini finali. Lascia che il fascio di fresatura fresi completamente questa superficie di imaging fino a quando sulla faccia non siano visibili artefatti di fresatura.
Selezionare i parametri del microscopio per l'acquisizione sequenziale dell'immagine della faccia. I parametri tipici prevedono tensioni comprese tra 1,2 e due kilovolt e dimensioni dei pixel comprese tra quattro e 20 nanometri. Il tempo di permanenza del pixel dovrebbe essere di circa 10 microsecondi, in modo che il tempo totale necessario per fresare la faccia e acquisire un'immagine sia inferiore a due minuti.
Lasciare riposare il microscopio per almeno due ore per consentire il rilascio di eventuali variazioni termiche. Avviare quindi il processo di ablazione e di acquisizione immagini per ottenere immagini seriali della regione di interesse. Questa figura mostra un'immagine retrodiffusa a contrasto inverso della superficie del blocco, che evidenzia l'ultrastruttura all'interno di una regione del cervello avvolto.
Tutte le membrane sono visibili, così come le grandi strutture macromolecolari. Questa figura è composta da un totale di 1.600 immagini raccolte con un intervallo di cinque nanometri, risultando in una serie di immagini con voxel isotropi. Questa serie può essere visualizzata in qualsiasi piano con la stessa risoluzione.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il tessuto cerebrale per l'imaging seriale con il microscopio elettronico a scansione a fascio focalizzato.
Panoramica
Questo protocollo descrive la preparazione e l'acquisizione di immagini di tessuto cerebrale inclusi in resina in tre dimensioni mediante microscopio elettronico a scansione con fascio di ioni focalizzato. Il metodo consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di specifiche regioni cerebrali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di imaging
- Istologia
Sfondo
- La microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato offre vantaggi rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
- Fornisce una risoluzione Z più elevata e consente di analizzare volumi maggiori di campioni inclusi in resina.
- Questa tecnica è particolarmente utile per lo studio dell'architettura del tessuto cerebrale.
- L'imaging seriale permette un'analisi completa della regione di interesse.
Scopo dello studio
- Raccogliere immagini seriali del tessuto cerebrale per un'analisi strutturale dettagliata.
- Illustrare un metodo che migliora la risoluzione dell'imaging e la capacità di acquisizione volumetrica.
- Facilitare lo studio di regioni cerebrali specifiche in un contesto tridimensionale.
Metodi Utilizzati
- Dissezione e inclusione del tessuto cerebrale in resina.
- Taglio in serie e colorazione di fette cerebrali.
- Levigatura e montaggio del blocco di resina per l'acquisizione delle immagini.
- Acquisizione delle immagini mediante microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato.
Risultati principali
- Corretta acquisizione di immagini seriali attraverso la regione di interesse.
- Acquisizione di immagini ad alta risoluzione con voxel isotropi.
- Dimostrata capacità di visualizzare le strutture da più angolazioni.
- I risultati mostrano un miglioramento significativo rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'analisi mediante imaging di tessuto cerebrale inclusi in resina.
- La microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato è efficace per studi strutturali dettagliati.
- Questa tecnica può migliorare la nostra comprensione dell'organizzazione del tessuto cerebrale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia elettronica a scansione con fascio ionico focalizzato (FIB/SEM) consente l'acquisizione tridimensionale ad alta risoluzione di tessuto cerebrale con voxel isotropi piccoli fino a 4 nm, permettendo un'analisi ultrastrutturale dettagliata. Questa capacità migliora la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci in neuroscienze, fornendo informazioni meccanicistiche sull'architettura cellulare e sulla patologia. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici consentendo una visualizzazione multiangolare delle strutture tissutali senza artefatti da sezionamento.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la visualizzazione dettagliata dell'ultrastruttura cellulare e dei complessi macromolecolari.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico rivelando i bersagli strutturali nel loro contesto tissutale nativo.
- Valore predittivo: Migliora la fiducia nel bersaglio permettendo l'analisi del tessuto da qualsiasi angolazione all'interno dello stack di immagini.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce set di dati immagini standardizzati e riproducibili adatti ad analisi morfometriche quantitative.
- Scalabilità: Consente l'acquisizione di volumi più grandi rispetto alla tomografia elettronica, mantenendo la risoluzione ottimale per campioni inclusi in resina.
- Riutilizzo della piattaforma: Genera serie di immagini che possono essere ri-analizzate per multipli bersagli o vie metaboliche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la fedeltà strutturale dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica grazie a una risoluzione isotropa del voxel.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce le relazioni struttura-funzione nei tessuti cerebrali per guidare la selezione degli obiettivi.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati strutturali ad alta fedeltà su sistemi rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
FIB/SEM si integra nel percorso della scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'imaging preclinico, consentendo analisi strutturali che guidano l'identificazione dei composti promettenti e gli studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione di strutture subcellulari in volumi di tessuto integro.
- Screening: Fornisce set di dati tridimensionali quantitativi e isotropi, che permettono confronti affidabili di fenotipi strutturali tra diverse condizioni.
- Analisi: Consente l'imaging seriale con risoluzione su scala nanometrica, permettendo misurazioni morfometriche precise e analisi statistiche dell'architettura tissutale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati strutturali ottenuti nella fase di scoperta a modelli preclinici attraverso un imaging coerente e ad alta risoluzione del tessuto cerebrale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile per studi longitudinali sull'interazione con i bersagli terapeutici e sulla risposta del tessuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi su tessuti cerebrali.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione attraverso flussi di lavoro automatizzati per la sezione seriale e l'acquisizione di immagini.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'acquisizione di immagini su larga scala ad alta risoluzione, riducendo la necessità di tecniche complementari multiple.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione corretta per il rischio fornendo dati strutturali dettagliati sull'interazione con l'obiettivo e sulla patologia tissutale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, inclusione in resina e tecniche di microscopia elettronica.
- Presuppone l'accesso a microscopi elettronici a scansione con fascio di ioni focalizzato dotati di sistemi di iniezione di gas e di rivestimento.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione del campione, di colorazione e di inclusione.
- Comporta la necessità di adattamenti quando il metodo viene applicato a diverse regioni cerebrali o modelli di malattia.
- Comprende limitazioni pratiche, come tempi di elaborazione prolungati e la necessità di un rivestimento conduttivo prima dell'acquisizione delle immagini.
