Cellule patterning su elettrodi Tin otticamente trasparente di ossido di indio

Ciao, sono Isha. Sono una studentessa laureata del secondo anno nel laboratorio della dottoressa Zen. Siamo qui presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università della California di Davis.

Oggi vi mostrerò il controllo di Ian su elettrodi microfabbricati in ossido di indio trasparenti all'ottica nell'ingegneria tissutale. Nell'ambito degli sforzi di rigenerazione, si è cercato di imitare il microambiente dell'organo. Per creare questo microambiente in vitro, è essenziale isolare le cellule spazialmente e temporalmente su un substrato. Siamo interessati alla progettazione di superfici su cui possiamo controllare la posizione di diversi tipi cellulari epatici.

Nell'esperimento di oggi, utilizzeremo la modifica superficiale, la microfabbricazione e l'elettrochimica per creare una superficie che possa passare da uno stato non adesivo a uno stato adesivo per le cellule. Il primo passo è la fotolitografia. Di seguito è riportato un diagramma di flusso che illustra come verrà eseguito tale processo.

Il blu rappresenta la luce del vetro, il verde è l'ossido di indio 10 che viene depositato sulla superficie della luce in vetro. Per prima cosa, applicheremo per spin coating il fotoresist rosso mostrato qui sopra sul vetro con rivestimento di ossido di indio 10. Successivamente, esporremo il campione a una maschera fotolitografica sotto luce ultravioletta e le regioni esposte verranno sviluppate in una soluzione sviluppatrice.

Le regioni di ITO non protette dal photoresist verranno rimosse durante l'incisione del ITO. Successivamente, tutto il photoresist residuo verrà rimosso in acetone per formare i nostri elettrodi di ITO. Di seguito è riportato lo schema di flusso dei rimanenti tre passaggi.

Per prima cosa, andremo a modificare l'intera superficie con peg cylin. Questo renderà la superficie non adesiva, impedendo il legame di cellule o proteine. Successivamente, utilizzeremo l'elettrochimica per assorbire in modo specifico il peg cylin solo sui due elettrodi che abbiamo realizzato in precedenza.

E infine, andremo a incubare i fibroblasti sulla superficie, dove si legheranno selettivamente solo alle regioni a striscia. A questo punto siamo pronti per iniziare il nostro esperimento. Il primo passaggio prevede la fotolitografia, che verrà eseguita in una stanza pulita.

Procediamo dunque ed entriamo nella stanza pulita. Ora siamo all'interno della nostra stanza pulita. Prima di iniziare il nostro esperimento, sottoporremo i nostri campioni rivestiti con ossido di indio e stagno, o ITO, a un trattamento termico a 200 °C nel forno.

In questo modo possiamo disidratare tutte le nostre superfici. E dopo averle riscaldate a 200 °C, le posizioneremo sulla spin coater per applicare effettivamente il photoresist. Quindi, dopo aver disidratato il nostro substrato di ITO, lo prenderemo e lo posizioneremo sul portacampioni della spin coater.

Questo mandrino è appena sufficiente a contenere un quarto di un vetrino. Successivamente, applicheremo il vuoto. Dopodiché, applicheremo un rivestimento fotosensibile a contrasto positivo sul substrato.

Dopo l'applicazione del photoresist, procediamo semplicemente con l'inizio. Ciò comporta due passaggi. Il primo è la distribuzione, e il secondo è il rivestimento per centrifugazione nel passaggio di distribuzione.

Il mandrino ruota a 800 giri/min e ciò distribuisce uniformemente il photoresist su tutta la superficie. Tuttavia, il passaggio successivo è quello di centrifugazione, che avviene a 4.000 giri/min e, a 4.000 giri/min, si forma uno strato molto sottile. Con sottile intendo circa un micrometro.

Se si suddivide la parola "photoresist", si ottiene "photo" e "resist". Questa sostanza viene attivata dalla luce. Per questo motivo lavoriamo in camera bianca e utilizziamo luce filtrata, in modo che il nostro photoresist non venga attivato accidentalmente dalla luce; inoltre, è resistente agli agenti chimici, una proprietà che sfrutteremo successivamente durante il processo di incisione.

Ora abbiamo terminato la centrifugazione del fotoresist sulla superficie e procederemo semplicemente a rimuoverlo per passare al passaggio successivo. Dopo aver cotto il campione per un minuto e 45 secondi, lo preleveremo dalla piastra riscaldata e lo sposteremo sul nostro allineatore a maschera Canon. Qui prendiamo la maschera necessaria e la posizioniamo sopra il nostro substrato in modo da ottenere una stampa a contatto tra il substrato rivestito di fotoresist e la maschera; quindi posizioniamo una wafer di vetro da quattro pollici sopra di essa per aggiungere peso.

E una volta terminato ciò, rimettiamo semplicemente lo scatto al suo posto e quindi esponiamo il campione alla luce UV. Al termine dell'esposizione, spostiamo il coperchio in senso inverso. Rimuoviamo la nostra wafer di vetro, togliamo la maschera e poi estraiamo il substrato per portarlo alla successiva fase di sviluppo.

Dopo aver esposto il campione, lo si posiziona in una soluzione sviluppatrice. Quando il campione è stato esposto alla luce UV, si sono formati ioni idrogeno, che si sono neutralizzati con la base presente nella soluzione sviluppatrice e sono stati effettivamente rimossi dalla superficie. A questo punto, è necessario assicurarsi che, durante la manipolazione del campione, si agiti costantemente il substrato.

E quando si fa ciò, si può osservare che nel giro di circa un minuto o un minuto e mezzo, le regioni esposte vengono effettivamente sviluppate e rimosse dalla superficie. Tuttavia, per completare lo sviluppo, lasciamo l'oggetto nella soluzione sviluppatrice per circa cinque minuti. Al termine dello sviluppo, lo estraiamo, lo laviamo con acqua deionizzata e quindi lo asciughiamo utilizzando una pistola a azoto.

Dopo aver essiccato il campione, lo preleveremo per visualizzarlo al microscopio. Qui stiamo osservando il campione al microscopio, appena estratto dopo averlo sviluppato per cinque minuti.

Si possono osservare due regioni: una regione più scura coperta da photoresist e una regione più chiara in cui il photoresist è stato rimosso. Rispetto alla maschera utilizzata in precedenza, le regioni più scure sulla maschera corrispondono alle regioni più scure che vediamo attualmente al microscopio, mentre le regioni chiare che osserviamo qui erano trasparenti sulla maschera. Uno dei disegni mostrati comprende semplici serie di diverse dimensioni, che vanno da 500 a 50 micron, mentre l'altro disegno è costituito da cerchi da 1000 micron semplicemente interconnessi.

Qui abbiamo un design diverso realizzato utilizzando la stessa procedura. Abbiamo elettrodi singolarmente indirizzabili. Con questo intendo dire che diverse regioni dell'ITO sono interconnesse e possono essere attivate in modo differente.

Ad esempio, qui le regioni circolari centrali sono collegate a un pad elettrico qui, mentre le regioni rettangolari più esterne sono collegate a un pad elettrico diverso. In questo modo possiamo stimolare queste due superfici diverse in diversi momenti temporali. Dopo aver esaminato i nostri campioni, il passo successivo a cui procediamo è l'incisione del campione.

Tutte le regioni non protette dalle foto verranno erose mediante un'incisione al ITO. Prima di procedere, dobbiamo assicurarci di indossare abbigliamento adeguato poiché l'incisione al ITO contiene acidi. Ora, dopo essermi messo la tuta protettiva contro gli acidi e aver indossato lo schermo facciale, verserò un po' di soluzione per l'incisione al ITO in un becher di vetro.

La morditura per ITO è composta dal 20% di acido cloridrico, dal 5% di acido nitrico e il resto è acqua deionizzata. Successivamente, prendere il campione e posizionarlo nella soluzione mordente. In precedenza, osservando al microscopio, abbiamo notato che alcune zone non erano protette dai photoresist.

Gli acidi utilizzati per la corrosione dell'ITO hanno attaccato quelle regioni provocando la rimozione dell'ITO da tali aree. Mentre l'ITO si degrada lentamente a partire dalla superficie, cambia colore. Qui si può osservare che è passato da una tonalità bluastra, che aveva inizialmente, a una tonalità violacea, e ora sta evolvendo verso una tonalità gialla.

Il cambiamento di colore indica che l'ITO sta venendo eroso. Ora siamo a 15 minuti. Tutto l'ITO è stato completamente rimosso.

E quello che vedete ora sono foto di regioni ITO protette. Quindi, dopo il completamento dell'incisione, ci sono ancora alcuni acidi residui sulla superficie. Per rimuovere questi acidi, posizioneremo il campione in una soluzione di carbonato di sodio, che neutralizzerà completamente l'acido.

Dopo aver neutralizzato gli acidi, procederemo a rimuoverlo e a pulirlo con acqua deionizzata, quindi lo asciugheremo con azoto. A questo punto abbiamo terminato la mordenzatura acida. Niente più acido, mi sono tolto la tuta protettiva.

Lo preleveremo e lo trasferiremo per visualizzarlo al microscopio. Ora stiamo osservando il campione al microscopio. Questo è dopo aver eseguito l'incisione dell'ITO.

In questo caso, le regioni più scure sono aree di vetro da cui l'ITO è stato rimosso mediante incisione chimica. Le regioni più chiare sono invece l'ITO protetto da photoresist. Ancora una volta, queste sono le matrici che vanno da 500 a 50 micron e nell'altro caso abbiamo i nostri cerchi interconnessi di mille micron ciascuno.

Quindi abbiamo appena osservato al microscopio e abbiamo visto che erano presenti regioni di vetro e regioni di ITO, ma le regioni di ITO erano protette da photoresist. Ora dobbiamo rimuovere questo photoresist. Tutto ciò che dobbiamo fare è prendere il nostro substrato, immergerlo in acetone, quindi inserirlo nel bagno ad ultrasuoni e sottoporlo a sonicazione per 10 minuti.

Questo garantisce la completa rimozione della resistenza fotosensibile; è possibile utilizzare toni autonomi, ma attraverso un trattamento sonico, che sfrutta onde sonore per colpire, assicurando così una corretta eliminazione del fotoresist. Dopo averlo estratto dall'ambiente sonico, viene lavato con acqua deionizzata, asciugato nuovamente con azoto, e ora è possibile osservare chiaramente i pattern sul substrato di vetro. Questi sono i pattern inizialmente protetti dal fotoresist.

Ora che abbiamo esaminato i nostri campioni e individuato o realizzato i nostri schemi di ITO, inizieremo la seconda fase dell'esperimento. Questa fase prevede la modifica della superficie con uno strato autoassemblato di ciclina PEG. Ma prima di procedere, dobbiamo assicurarci che la superficie sia reattiva.

Per fare ciò, lo collochiamo in un pulitore al plasma. Questo introduce gruppi ossidrilici sulla superficie e la rende così reattiva. Per fare ciò, collochiamo semplicemente il nostro campione nel pulitore al plasma e quindi accendiamo la nostra pompa a vuoto.

Accendiamo l'ossigeno, quindi attiviamo l'alimentazione principale. Questa alimentazione viene utilizzata per convertire il gas ossigeno in plasma, che viene poi introdotto e forma così le scanalature ossidriliche. E una volta attivata l'alimentazione, proseguiamo premendo start.

Ora che il processo è completo, preleviamo il nostro substrato, lo conserviamo in una capsula e usciamo dalla sala pulita, ci togliamo le tute protettive ed eseguiamo il passaggio successivo. Ora che siamo usciti dalla sala pulita e abbiamo completato il nostro patterning ideale, procederemo a modificare la superficie appena ottenuta con polietilenglicole, CYLIN o PEG Cylin. È fondamentale sapere che il peg cylin è reattivo all'umidità.

Pertanto, tutto ciò che utilizziamo in legno deve essere privo di umidità. La vetreria che abbiamo usato, le capsule di Petri, è stata riscaldata a cento gradi Celsius per tutta la notte. E il solvente che utilizzeremo è anch'esso anidro.

Non contiene umidità. Ora verserò del toluene anidro in entrambi questi recipienti di vetro, uno dei quali contiene il nostro campione. Dobbiamo usare due capsule di Petri perché in una di esse eseguiremo la modifica.

E l'altro lo utilizzeremo successivamente, al termine della modifica, per lavare effettivamente il nostro substrato. Quindi, dopo aver posizionato i nostri piatti di vetro, li porterò semplicemente qui e li trasferirò nella camera dell'airlock all'interno della glove box. Dopo aver chiuso la camera dell'airlock, introdurremo azoto nella camera.

Ora la camera principale è già riempita di azoto. Pertanto, non vogliamo aprire questa camera a meno che non sia piena di azoto. Una volta che entrambe le camere contengono azoto, trasferiremo tutti i nostri campioni insieme a una pipetta.

Avremo a disposizione un perno e una pinzetta che utilizzeremo in seguito per trasferire i campioni. Indosseremo quindi i guanti, apriremo la camera qui e rimuoveremo lentamente e con attenzione tutto ciò che è presente nel nostro airlock, posizionandolo nella camera principale. Questo è il piatto di Petri con il nostro substrato e il piatto di Petri contenente soltanto toluene che useremo per il lavaggio.

Il pxi presente è stato confezionato sotto azoto e non si deve aprire questa bottiglia a meno che non ci si trovi in un'atmosfera di azoto. Pertanto, ogni volta che si preleva il campione, lo si rimette nuovamente nel sacchetto. Si preleva quindi il proprio cilindro e la concentrazione che utilizzeremo è del 2% in toluene.

Quindi si preleva, si inserisce nel contenitore alto, si mescola. Si versa anche nella camera e si verifica che sia ben miscelato, quindi si lascia incubare il campione in Toin per due ore. Ora che sono trascorse due ore, il nostro campione è stato in Pxi; preleveremo il campione e lo trasferiremo in una soluzione fresca di toin, dove verrà lavato brevemente, agitato delicatamente e quindi trasferito nella nostra camera stagna.

Una volta che è nella nostra camera di compensazione, apriremo semplicemente la camera ed estrairemo la superficie modificata, quindi possiamo trasportarla utilizzando la pistola a azoto. La posizioniamo nuovamente in una capsula di Petri pulita e asciutta e la mettiamo in un forno a cento gradi C per altre due ore. Ora che i campioni sono stati riscaldati in forno a cento gradi C per due ore, procederemo a collegare i fili agli elettrodi che abbiamo preparato.

Lo facciamo preparando una miscela uno a uno di epossidico argentato e un agente indurente. Questo è l'epossidico argentato, e ora aggiungiamo la stessa quantità di agente indurente. Dobbiamo mescolare bene, quindi prenderemo questa miscela e la useremo per fissare i nostri fili.

Posizioniamo quindi il nostro filo sugli elettrodi che intendiamo utilizzare e successivamente lo codifichiamo. La saldatura non funziona sull'ITO, pertanto dobbiamo utilizzare una resina epossidica argentata e l'agente indurente. Dopodiché, sottoponiamo il tutto a cottura in modo che l'agente indurente precedentemente utilizzato venga completamente rimosso, indurisca e possa essere utilizzato come elettrodo.

Ora che abbiamo completato due fasi, inizieremo la terza fase di un esperimento, ovvero la parte di elettrochimica. A tale scopo, preleveremo un campione e lo posizioneremo nella nostra cella elettrochimica. Dopo averlo posizionato nella cella elettrochimica, posizioneremo semplicemente un anello O sulla sommità.

Questo isolerà la regione in cui avverrà l'elettrochimica, dopodiché sigillerò semplicemente la cella. Ho quindi posizionato il mio campione, con il filo collegato, all'interno della cella elettrochimica. Ora sono pronto a utilizzare il potenziostato per applicare la tensione.

Quindi il filo bianco verrà collegato qui all'elettrodo di riferimento, quello rosso all'elettrodo contro, e infine quello verde all'elettrodo di lavoro. Una volta collegati tutti questi elettrodi, aggiungerò semplicemente una soluzione 1x di tampone salino fosfato, o PBS, alla cella elettrochimica stessa. Per chiarire meglio, il funzionamento prevede che l'intera superficie, così com'è al momento, sia modificata con pxi.

Pertanto, tutti gli elettrodi, comprese le regioni di vetro circostanti, vengono modificati con pxi. Una volta applicata la tensione ovunque in cui è presente l'ITO, ovvero nelle geometrie degli elettrodi che abbiamo realizzato, l'isola di peg si staccherà soltanto da quelle superfici, mentre le regioni circostanti non saranno affette. In questo modo, rimuoviamo selettivamente l'isola di peg dal nostro substrato.

Ora premerò play, il che avvierà l'applicazione di una tensione di -1,4 volt al nostro elettrodo di lavoro. Quando viene applicata la tensione, si osserva un cambiamento di colore sugli elettrodi. Il colore passa dal tono verde-bluastro trasparente iniziale a marrone.

Sospettiamo che possa verificarsi una reazione di ossidazione agli elettrodi che li fa diventare marroni. Questo è anche uno degli indicatori che il pxi dalla superficie è effettivamente stato rimosso dalla superficie. E ancora una volta, ogni volta che vedete del marrone, è lì che l'isola di peg è stata eliminata.

E le zone circostanti di vetro presentano ancora PXI assemblato. Pertanto, applichiamo una tensione di -1,4 watt per 60 secondi. Questo intervallo di tempo è sufficiente per rimuovere tutto il PXI presente sugli elettrodi.

È inoltre possibile utilizzare questo metodo per rimuovere gli elettrodi singolarmente indirizzati. In questo caso, vi erano tre file di cerchi da rimuovere. Possiamo selezionare quali rimuovere sfruttando tutti e tre gli elettrodi diversi.

Ora abbiamo completato con successo la terza parte dell'elettrochimica, in cui abbiamo rimosso selettivamente il silano PG dai nostri elettrodi ITO. Li ho lavati brevemente con PBS e acqua deionizzata, rimosso il filo e posizionato i campioni in normali piastre a sei pozzetti. Ora procederemo coltivando cellule su questi elettrodi.

Ora siamo nel laboratorio di coltura cellulare. Per la fase finale dell'esperimento, oggi utilizzeremo fibroblasti, cellule T tre tre. La concentrazione utilizzata per seminare le cellule è compresa tra 0,5 e 1,5 milioni di cellule per ml.

Dopo aver seminato le cellule, le lasciamo aderire al nostro campione per circa 20 minuti. Questo tempo è sufficiente perché si attacchino alle regioni prive di rivestimento. Successivamente, posizioneremo il campione nell'incubatore.

Ora sono passati 20 minuti e siamo pronti a osservare le cellule che si sono organizzate nelle regioni depilate di ITO, le regioni marroni che abbiamo visto in precedenza, e che si legano specificamente solo a queste aree senza aderire in alcun punto al di fuori di esse. Qui potete vedere le regioni marroni, che corrispondono alle zone di ITO da cui è stato rimosso il pxi. Mediante l'elettrochimica, le cellule si sono attaccate esclusivamente a queste regioni marroni e non alle zone circostanti di vetro.

In questo altro fotogramma, ancora una volta, vediamo il seltz attaccarsi alle regioni prive di rivestimento. Queste sono le regioni marroni, ma al di sopra di tali regioni marroni si riesce a malapena a vedere che il design ITO con PEG non è stato rimosso da questo design ITO, e quindi nessuna cellula si è attaccata ad esso. Ok, questo è tutto.

Abbiamo terminato il protocollo e le cellule mostrano un modello sugli elettrodi ITO, proprio come volevamo. Vi ho appena mostrato il controllo dell'adesione cellulare su elettrodi in ossido di indio e stagno microfabbricati e otticamente trasparenti. Oggi vi ho mostrato come ottenere un modello di fibroblasti THREET tre su questi elettrodi.

Abbiamo inoltre utilizzato lo stesso procedimento per ottenere un pattern di cellule Hep G2, cellule satelliti e cellule primarie di ratto. Le attuali tecniche di patterning cellulare consentono soltanto l'assemblaggio di due tipi cellulari sulla superficie. La flessibilità di questa tecnica permetterà in futuro l'assemblaggio di più tipi cellulari sulla superficie, isolati spazialmente.

Prevediamo di utilizzare questa tecnica per isolare spazialmente tre diversi tipi cellulari epatici sul substrato ITO, al fine di mimare l'ambiente microscopico in vivo. In questo modo, possiamo isolare spazialmente cellule immature o cellule staminali insieme a cellule mature e cellule di supporto. Ciò creerà un ambiente indicativo per la crescita e la differenziazione delle cellule immature.