Cellule patterning su elettrodi Tin otticamente trasparente di ossido di indio

Ciao, sono Isha. Sono uno studente laureato del secondo anno nel laboratorio del Dr.Zen. Siamo qui al Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università della California Davis.

Oggi vi mostrerò il controllo di Ian su elettrodi di ossido di indio 10 microfabbricati otticamente trasparenti nell'ingegneria tissutale e sono stati fatti sforzi di rigenerazione per imitare il microambiente dell'organo. Per creare questo microambiente in vitro, è essenziale isolare spazialmente e temporalmente le cellule su un substrato. Siamo interessati a progettare superfici in cui possiamo controllare la posizione di diversi tipi di cellule epatiche.

Nell'esperimento di oggi, utilizzeremo la modifica della superficie, la microfabbricazione e l'elettrochimica per formare una superficie che può essere commutata da cella non adesiva a cella adesiva. Il primo passo è la fotolitografia. Ecco un diagramma di flusso di come funzionerà questo processo.

Il blu è la luce di vetro, il verde è l'ossido di indio 10 che è rivestito sopra la luce di vetro. Innanzitutto, quello che faremo è lo spin coat photo resist rosso mostrato qui sopra la luce in vetro rivestito di ossido di indio 10. Quindi passeremo attraverso una maschera fotografica alla luce ultravioletta e le regioni esposte saranno sviluppate in una soluzione in via di sviluppo.

Le regioni ITO che non sono protette da fotoresist verranno rimosse in IT. E infine, tutto il fotoresist rimanente verrà rimosso in acetone per formare i nostri elettrodi ITO. Ecco il diagramma di flusso dei restanti tre passaggi.

Innanzitutto, modificheremo l'intera superficie con il cilindro del piolo. Questo renderà la superficie non sporca e nessuna cellula o proteina si legherà ad essa. Successivamente, utilizzeremo l'elettrochimica per assorbire in modo specifico il cilindro peg dai due elettrodi I che abbiamo realizzato in precedenza.

E infine, incuberemo i fibroblasti sulla parte superiore della superficie e si legheranno selettivamente solo alle regioni della striscia. Quindi ora siamo pronti per iniziare il nostro esperimento. Il primo passo prevede la fotolitografia, che verrà eseguita in camera bianca.

Quindi andiamo avanti ed entriamo nella camera bianca. Quindi ora eccoci qui, siamo nella nostra camera bianca. Prima di iniziare il nostro esperimento, quello che faremo è cuocere i nostri campioni di ossido di indio e stagno o rivestiti di ITO a 200 C nel nostro forno.

In questo modo possiamo disidratare tutte le nostre superfici. E dopo averlo cotto a 200 C è il momento in cui lo posizioneremo sulla nostra tecnologia di rotazione e applicheremo effettivamente il fotoresist. Quindi, dopo aver disidratato il nostro substrato ITO, lo prenderemo e lo posizioneremo sul mandrino della tecnologia di rotazione.

Questo mandrino è abbastanza grande da contenere un quarto di luce di vetro. Poi applicheremo il vuoto. Successivamente, applichiamo un tono positivo, fotoresist sul substrato.

Dopo l'applicazione del fotoresist, andiamo avanti e iniziamo. Ciò comporta due passaggi. Il primo è la stesura e il secondo è la centrifuga nella fase di stesura.

Il mandrino ruota a 800 giri/min e questo distribuisce uniformemente il fotoresist su tutta la superficie. Tuttavia, il prossimo è la fase di rotazione, che si trova a 4.000 RPN e a 4.000 giri/min, forma uno strato davvero sottile. Per sottile intendo circa un micron.

Se rompi la parola foto, resisti, si trasforma in foto e resisti. Viene attivato dalla luce. Quindi, lavoriamo in camera bianca e utilizziamo la luce filtrata in modo che la nostra porta fotografica resistente non venga attivata dalla luce e sia resistente alle risorse, che utilizzeremo in seguito quando faremo l'incisione.

Quindi ora abbiamo finito con lo spin coating, il fotoresist sulla superficie e lo toglieremo e passeremo al nostro passaggio successivo. Quindi, dopo aver cotto il campione per un minuto e 45 secondi, lo prenderemo dalla piastra calda e lo sposteremo sul nostro rivestimento della maschera del cannone. Qui prendiamo una maschera di cui abbiamo bisogno e poi posizioniamo la maschera sopra sopra il nostro substrato in modo da avere una stampa a contatto tra il nostro substrato con port resist e la maschera, la posizioniamo con un wafer di vetro da quattro pollici solo per aggiungere peso ad esso.

E una volta che abbiamo finito, rimettiamo l'otturatore e poi esponiamo il campione alla luce UV. Una volta completata l'esposizione, spostiamo semplicemente il coperchio in ordine inverso. Tiriamo fuori il nostro wafer di vetro, togliamo la nostra maschera, e poi rimuoviamo il nostro substrato e lo prendiamo in consegna per lo sviluppo.

Dopo aver esposto l'esempio, lo inseriamo in una soluzione per sviluppatori. Quando il campione è stato esposto alla luce UV, c'erano ioni idrogeno, che si sono neutralizzati con la base e la soluzione di sviluppo e sono stati effettivamente rimossi dalla superficie. Quindi ora vuoi assicurarti che quando fai il campione, stai costantemente deviando il substrato.

E quando lo si fa, si può vedere che in circa il primo minuto o minuto e mezzo, le regioni esposte sono effettivamente sviluppate e rimosse dalla superficie. Ma per lo sviluppo completo, lo lasciamo riposare nella soluzione per sviluppatori per circa cinque minuti. Al termine dello sviluppo, lo estrarremo, lo laveremo e lo asciugheremo con una pistola ad azoto.

Una volta essiccato il nostro campione, lo prenderemo in consegna e lo visualizzeremo al microscopio. Qui stiamo osservando il campione al microscopio. L'abbiamo semplicemente tolto dopo averlo sviluppato per cinque minuti.

Ci sono due regioni che puoi vedere qui, una regione più scura che è coperta dal fotoresist e la regione più chiara in cui il fotoresist è stato rimosso. In relazione alla maschera che abbiamo usato in precedenza, le regioni più scure sulla maschera erano le regioni più scure che vediamo ora al microscopio, mentre le regioni chiare che vediamo qui, erano trasparenti sulla maschera. Uno dei progetti che viene mostrato qui è costituito da array di diverse dimensioni che vanno da 500 a 50 micron, mentre l'altro design è costituito da cerchi da 1000 micron che sono semplicemente interconnessi.

Quindi qui abbiamo un design diverso che è stato realizzato utilizzando la stessa procedura. Qui abbiamo elettrodi indirizzabili individualmente. Quello che intendo con questo è che le diverse regioni dell'ITO sono interconnesse e possono essere attivate in modo diverso.

Ad esempio, qui, le regioni circolari centrali, sono collegate a un pad elettrico qui, mentre le regioni rettangolari più esterne, sono collegate a un pad elettrico diverso. In questo modo possiamo stimolare queste due diverse superfici in momenti diversi. Dopo aver esaminato i nostri campioni, il passaggio successivo a cui passiamo è l'incisione del campione.

Tutte le regioni che non sono protette dalle foto verranno incise in un'incisione ITO. Prima di farlo, dobbiamo assicurarci di indossare indumenti adeguati poiché l'incisione ITO contiene acidi. E ora, dopo aver indossato il mio camice protettivo contro gli acidi, indossato la visiera, verserò un po' di incisione ITO in un bicchiere di vetro.

L'incisione ITO è composta per il 20% da acido cloridrico, per il 5% da acido nitrico e per il resto da acqua deionizzata (AI). E poi porto il mio campione e lo metto nell'incisione. In precedenza, al microscopio, abbiamo visto che c'erano alcune regioni che non erano protette dai fotorilievi.

Gli acidi nell'incisione ITO hanno attaccato quelle regioni e hanno causato l'incisione dell'ITO da quelle regioni. Man mano che l'ITO si degrada lentamente dalla superficie, cambia colore. Qui puoi vedere che è passato da un cambiamento bluastro che aveva originariamente a questo cambiamento violaceo e ora sta passando allo scambio giallo.

Il cambiamento di colore indica che l'ITO è in fase di incisione. Quindi ora eccoci qui a 15 minuti. Tutto l'ITO, è completamente inciso.

E quello che vedi in questo momento sono le foto è protetto regioni ITO. Quindi, dopo che l'incisione è stata completata, ci sono ancora alcuni acidi che rimangono sulla superficie. Per rimuovere questi acidi, lo metteremo in una soluzione di carbonato di sodio, che neutralizzerà tutto l'acido.

Dopo aver neutralizzato gli acidi, lo tireremo fuori e lo puliremo con acqua deionizzata e poi asciugheremo con l'azoto cotto. Quindi ora abbiamo finito con l'incisione con l'acido. Niente più acido, ho finito il mio camice caldo.

Lo tireremo fuori, lo trasferiremo e lo visualizzeremo al microscopio. Quindi ora stiamo osservando il campione al microscopio. Questo è dopo che abbiamo eseguito l'incisione ITO.

In questo caso, le regioni più scure sono regioni di vetro da cui è stato inciso ITO. E le regioni più chiare sono ITO che sono protette da fotoresist in questo caso. Ancora una volta, questi sono gli array da 500 a 50 micron e nell'altro caso abbiamo i nostri cerchi interconnessi di mille micron ciascuno.

Quindi abbiamo guardato al microscopio e abbiamo visto che c'erano regioni di vetro e regioni ITO, ma le regioni ITO erano protette dal fotoresist. Ora dobbiamo togliere questo fotoresist. Quindi tutto quello che faremo è prendere il nostro substrato, metterlo nell'acetone, e poi metterlo nel sonicato e sonicare per 10 minuti.

Ciò garantisce che tutta la resistenza fotografica tolta, potrebbe essere utilizzata come toni da sola, ma con un colpo sonico, che utilizza le onde sonore per colpire e che assicura che la resistenza fotografica venga rimossa correttamente. Dopo averlo tolto dall'aria sonica, viene lavato in acqua deionizzata, asciugato di nuovo in azoto e ora è possibile vedere chiaramente i motivi sul substrato di vetro. Questi erano i modelli che inizialmente erano protetti dal fotoresist.

Ora che abbiamo esaminato i nostri campioni e trovato o realizzato i nostri modelli ITO, stiamo per iniziare la nostra seconda fase dell'esperimento. Questa fase prevede la modifica della superficie con un monostrato autoassemblato di ciclina PEG. Ma prima di farlo, dobbiamo assicurarci che la superficie sia reattiva.

Per fare ciò, lo mettiamo in un pulitore al plasma. Questo introduce gruppi ossidrilici sulla superficie e quindi la rende reattiva. Per fare ciò, basta posizionare il nostro campione nel pulitore al plasma e poi accendiamo la nostra pompa del vuoto.

Accendiamo l'ossigeno, accendiamo l'alimentazione principale. Questa energia viene utilizzata per convertire l'ossigeno gassoso in plasma, che viene poi introdotto e forma così i solchi ossidrilici. E una volta accesa l'alimentazione, andiamo avanti e premiamo start.

Quindi, una volta completato il processo, estraiamo il nostro substrato, lo conserviamo in un piatto e ci dirigiamo fuori dal camice per camera bianca e passiamo alla fase successiva. Quindi, ora che siamo usciti dalla camera bianca e abbiamo terminato il nostro modello ideale, modificheremo la superficie che abbiamo appena modellato con glicole polietilenico, CYLIN o PEG Cylin. È fondamentale sapere che il piolo cylin è reattivo all'umidità.

Quindi tutto ciò che usiamo in legno deve essere privo di umidità. I bicchieri che abbiamo usato qui, i piatti per animali domestici, sono stati cotti a cento C per tutta la notte. E anche il tino che useremo come solvente è anidro.

Non contiene umidità. Quindi ora verserò tun, tolu anidro in entrambi questi altoparlanti di vetro, uno dei quali contiene il nostro campione. Ora dobbiamo usare due piastre di Petri perché una di esse è dove faremo la modifica.

E l'altro lo useremo più tardi, quando la modifica sarà terminata, per lavare effettivamente il nostro substrato. Quindi, dopo aver messo i nostri piatti per pizza in vetro, lo prenderò in consegna e lo trasferirò nella nostra camera di compensazione qui nel vano portaoggetti. Dopo aver chiuso la camera di compensazione, introdurremo l'azoto nella camera.

Ora la camera principale qui è già piena di azoto. Quindi non vogliamo aprire questa camera a meno che non sia riempita di azoto. Una volta che entrambe le camere saranno azoto, trasferiremo tutti i nostri campioni insieme a una pipetta.

Avremo il nostro piolo e una pinzetta che useremo in seguito per trasferire i campioni. Quindi indosseremo i guanti, apriremo la camera qui e lentamente e con attenzione tireremo fuori tutto ciò che abbiamo nella nostra camera stagna e lo metteremo nella camera principale. Questa è la piastra di Petri con il nostro substrato e la piastra di Petri solo con toluene che useremo per il lavaggio.

Il pxi presente è stato confezionato sotto azoto e non dovresti aprire questa bottiglia a meno che tu non ti trovi in un ambiente di azoto. Quindi, una volta che vuoi estrarre il campione, lo rimetti nella borsa. Quindi togli il tuo cylin e la concentrazione che useremo è del 2% nel toluene.

Quindi lo togliete, lo mettete nell'alto, lo mescoliamo. Bene anche la camera e assicurarsi che sia ben miscelato e poi lasciare incubare il campione in Toin per due ore. Quindi, ora che sono passate due ore, il nostro campione è stato in Pxi, tireremo fuori il campione e lo trasferiremo in una soluzione di toin fresca dove lo laveremo brevemente, lo faremo deviare e lo sposteremo nella nostra camera di compensazione.

Una volta che è nella nostra camera stagna, apriremo semplicemente la nostra camera e toglieremo la nostra superficie modificata e potremo guidare usando la pistola ad azoto. Lo mettiamo di nuovo in una capsula di Petri pulita e asciutta e lo passiamo e lo mettiamo in forno a cento gradi C per altre due ore. Quindi, ora che i campioni sono stati cotti in forno a cento C per due ore, prenderemo e attaccheremo i nostri fili agli elettrodi che abbiamo preparato.

Lo facciamo realizzando una miscela uno a uno di resina epossidica d'argento e un agente indurente. Quindi questa è la resina epossidica d'argento, e ora aggiungiamo la stessa quantità di polimerizzazione. Vogliamo mescolarlo bene, e poi lo prenderemo e lo useremo per collegare i nostri fili.

Quindi posizioniamo il nostro filo sugli elettrodi che vogliamo utilizzare e poi lo codiciamo. La saldatura non funziona su ITO, quindi dobbiamo usare resina epossidica d'argento e l'agente indurente. E poi cuociamo in modo che tutto l'agente indurente che abbiamo usato in precedenza venga rimosso e si indurisca e possiamo usarlo come elettrodo.

Quindi, ora che abbiamo terminato le due fasi, inizieremo la terza fase di un esperimento, che consiste nell'eseguire la parte di elettrochimica. Per fare ciò, prenderemo un campione e lo metteremo nella nostra cella elettrochimica. Dopo averlo posizionato nella nostra cella elettrochimica, ci metteremo sopra un O-ring.

Questo isolerà la regione in cui avverrà l'elettrochimica, e poi sigilleremo la cella. Quindi ho posizionato il mio campione con il filo attaccato nella cella elettrochimica. Ora sono pronto per utilizzare la statistica del potenziale per applicare la tensione.

Quindi il filo bianco, lo collegherò proprio qui all'elettrodo di riferimento, a quello rosso, al controelettrodo e infine a quello verde che collegherò al nostro elettrodo di lavoro. Una volta che tutti questi elettrodi sono collegati, aggiungerò solo una soluzione di soluzione salina tampone fosfato fosfato o PBS all'elettrochimico stesso. Ora, giusto per chiarire questo, il modo in cui funzionerà è che l'intera superficie al momento viene modificata con pxi.

Quindi tutti gli elettrodi, comprese le regioni di vetro circostanti, vengono modificati con pxi. Una volta applicata la tensione ovunque, dove è presente ITO, che sono i disegni degli elettrodi che abbiamo realizzato, l'isola del piolo si staccherà solo da quelle superfici e non sarà influenzato dalle regioni circostanti. Quindi, rimuoviamo selettivamente l'isola del piolo dal nostro substrato.

Quindi ora premerò play e questo inizierà e applicherò una tensione di 1,4 volt negativi al nostro elettrodo di lavoro. Quando viene applicata la tensione, c'è un cambiamento di colore che puoi vedere sugli elettrodi. Cambia dal blu verdastro trasparente che dovevamo a marrone.

Sospettiamo che potrebbe esserci una reazione di ossidazione che potrebbe verificarsi sugli elettrodi che li fa diventare marroni. Questo è anche uno degli indicatori che il pxi dalla superficie è stato effettivamente strappato dalla superficie. E ancora una volta, ovunque si veda il marrone, è da lì che l'isola dei pioli è stata rimossa.

E le regioni di vetro circostanti hanno ancora PXI assemblato su di esso. Quindi applichiamo una tensione negativa di 1,4 watt per 60 secondi. Questo dà abbastanza tempo per rimuovere tutti i pxi che erano presenti sugli elettrodi.

Possiamo anche utilizzare questo metodo per spellare gli elettrodi che vengono indirizzati individualmente. In questo caso, c'erano tre file di cerchi che verranno spogliati. Possiamo selezionare cosa, quali vogliamo spelare utilizzando tutti e tre i diversi elettrodi.

Ora abbiamo terminato con successo la nostra terza parte di elettrochimica in cui abbiamo rimosso selettivamente il siling PG dai nostri elettrodi ITO. L'ho lavato brevemente, l'ho lavato con acqua PBS e DI, ho rimosso il filo e ho posizionato i campioni in normali piastre a sei pozzetti. Ora andremo avanti e coltiveremo le cellule su questi elettrodi.

Eccoci qui nella sala di coltura dei tessuti. Per la fase finale dell'esperimento, oggi useremo i fibroblasti, tre cellule T e tre. La concentrazione che usiamo per seminare le cellule è compresa tra 0,5 e 1,5 milioni di cellule per mil.

Dopo aver seminato le cellule, le lasciamo sul nostro campione per circa 20 minuti. Ciò gli consentirebbe tutto il tempo per attaccarlo alle regioni spogliate. Quindi lo metteremo nell'incubatrice.

Quindi ora sono passati 20 minuti e siamo pronti a guardare le cellule che si sono modellate sulle regioni spogliate di ITO, le regioni marroni che abbiamo visto in precedenza, e si legherebbero specificamente a quelle regioni e non si attaccheranno da nessuna parte al di fuori di quelle regioni. Qui puoi vedere che le regioni marroni erano regioni ITO che sono state spogliate di pxi. Utilizzando l'elettrochimica, le celle si sono attaccate solo a queste regioni marroni e non alle regioni di vetro circostanti.

In quest'altro fotogramma, ancora una volta, vediamo seltz attaccarsi alle regioni spogliate. Quelle sono le regioni marroni, ma al di sopra di quelle regioni marroni si vede a malapena e il PEG del design ITO non è stato rimosso da questo design ITO, quindi non ci sono celle attaccate ad esso. Ok, quindi questo è tutto.

Abbiamo finito con il protocollo e le celle hanno un modello sugli elettrodi ITO ed è esattamente quello che volevamo. Vi ho appena mostrato il controllo dell'adesione cellulare su elettrodi di ossido di indio 10 microfabbricati otticamente trasparenti. Oggi vi ho mostrato come modellare THREET tre fibroblasti su questi elettrodi.

Abbiamo anche usato la stessa procedura per modellare le cellule dell'Hep G due, le cellule satelliti e le cellule primarie di ratto. Le attuali tecniche di modellazione delle celle consentono solo l'assemblaggio di due tipi di celle sulla superficie. La flessibilità di questa tecnica consentirà in futuro l'assemblaggio di più tipi di cellule sulla superficie che saranno spazialmente isolate.

Abbiamo in programma di utilizzare questa tecnica per isolare spazialmente tre diversi tipi di cellule epatiche sul substrato ITO al fine di imitare il microambiente in vivo. In questo modo, possiamo isolare spazialmente le cellule immature o le cellule staminali insieme alle cellule mature e alle cellule di supporto. Questo creerà un ambiente istruttivo per la crescita e la differenziazione delle cellule immature.