Una procedura 1,5 ore per l'identificazione di Enterococcus Specie Direttamente da emocolture
10 febbraio 2011
Un protocollo rapido per l'identificazione diretta di Enterococcus faecalis ed Enterococcus altre specie da una emocoltura positiva con un Peptide Nucleic Acid test di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH PNA).
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare rapidamente le specie di enterococcus da flaconi di emocoltura positivi utilizzando la fluorescenza con acido nucleico peptidico e l'ibridazione C 2. Una volta che le emocolture sono state preparate e sottoposte a gramtest per confermare la presenza di colture di enterococchi, i campioni vengono fissati su vetrini da microscopio per pesci PNA. I vetrini vengono quindi incubati con sonde di PNA specifiche per gli organismi di interesse.
Una volta che le sonde si sono ibridate, viene eseguito un lavaggio rigoroso per rimuovere la sonda non ibridata in eccesso. I supporti di montaggio vengono aggiunti ai vetrini, che vengono poi sigillati con vetrini coprioggetto. Le specie di enterococcus presenti nel campione possono essere identificate mediante microscopia a fluorescenza.
Questo protocollo di identificazione PNA Fish è unico nel fornire un metodo rapido e specifico per l'identificazione dell'enterococco da paralisi. Campioni di emocoltura del paziente Incubare due flaconi di emocoltura, uno aerobico e uno anaerobico contenenti sangue venoso di un paziente sospetto di sepsi in uno strumento di emocoltura automatizzato a 35 gradi Celsius. Una volta che il dispositivo indica di aver rilevato una crescita microbica, rimuovere il flacone, agitare delicatamente i flaconi per emocoltura per risospendere uniformemente i batteri.
Quindi, utilizzando una siringa sterile e un ago, trasferire asetticamente circa cinque millilitri di sangue da ciascun flacone in un tubo con tappo a vite separato. Una volta che tutti i campioni sono stati assegnati, utilizzare una pipetta sterile per trasferire una goccia di sangue da ciascuna provetta su un vetrino da microscopio separato. Lasciare asciugare il vetrino all'aria per circa 15 minuti.
Quindi, dopo che il vetrino è completamente asciutto, immergerlo nel metanolo per fissare il campione. Dopo che i vetrini sono stati fissati, lavarli ed eseguire una colorazione di Gram standard per determinare la morfologia degli organismi presenti in ciascuna coltura di sangue. Esaminare i vetrini utilizzando un microscopio con un obiettivo ad immersione in olio.
Entra in un caucus, le specie appariranno come cocchi gram-positivi, tipicamente assemblati in coppie o catene corte. Mettere una goccia di soluzione di fissazione nel pozzetto di un vetrino da microscopio per pesci e uno per pesci. Mescolare delicatamente la provetta dell'emocoltura da testare.
Quindi trasferire 10 microlitri di coltura sulla goccia di soluzione di fissazione e convogliarla su e giù per emulsionare il campione. Posizionare i vetrini su una piastra riscaldante a 55 gradi Celsius per 20 minuti per fissare le sbavature in ogni test. Assicurarsi di includere vetrini di controllo positivi e negativi per la valutazione della qualità del saggio.
In caso di incallizione, i vetrini di controllo possono essere acquistati da un Van DX o preparati utilizzando colture di riferimento. Una volta che lo striscio è pronto, posizionare una goccia di EFI callous O-E-P-N-A sul pozzetto contenente il campione di emocoltura e anche sui pozzetti di controllo positivo e negativo. Per evitare la contaminazione della soluzione stock della sonda, assicurarsi di non lasciare che la punta del flacone contagocce tocchi lo striscio di sangue.
Posizionare un vetrino coprioggetti sopra il campione, facendo attenzione a non creare bolle d'aria. Quindi incubare il vetrino su un blocco riscaldante a 55 gradi Celsius per 30 minuti. Per consentire al PNA di ibridarsi dopo l'incubazione, posizionare i vetrini in un supporto per vetrini.
Immergere il supporto per vetrini caricato in una vaschetta per la colorazione contenente una soluzione di lavaggio preriscaldata a 55 gradi Celsius. Per rimuovere il PNA in eccesso dal campione e sfilare delicatamente il vetrino coprioggetti agitando il vetrino nel tampone o utilizzando una pinza. Incubare il vetrino a 55 gradi Celsius in soluzione di lavaggio per 30 minuti.
Quindi rimuovere il vetrino dalla vaschetta di colorazione e lasciarlo asciugare all'aria. Una volta che il vetrino è asciutto, aggiungere una goccia di terreno di montaggio a temperatura ambiente al vetrino e posizionare con cura un vetrino coprioggetti sul campione. Esaminare i vetrini su un microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro a doppia banda entro due ore dalla preparazione.
Usando questo metodo, incerto, calloso, mostrato in verde a sinistra può essere distinto da eum in rosso. Nel pannello centrale all'estrema destra c'è un risultato negativo. Tre cose da ricordare per ottenere risultati di successo sono che le temperature dello strumento devono essere mantenute alle temperature impostate.
È necessario seguire molto attentamente la procedura di colorazione come descritto nel foglietto illustrativo. E infine, è necessario avere un lettore esperto che faccia una lettura approfondita della diapositiva. Questo protocollo è utile per prendere decisioni terapeutiche per il trattamento della sepsi causata dall'enterococco.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo rapido per l'identificazione di Enterococcus faecalis e di altre specie di Enterococcus da colture ematiche positive mediante un saggio di ibridazione fluorescente in situ con acido nucleico peptidico (PNA FISH). Il metodo consente un'identificazione rapida e specifica, utile per il trattamento della sepsi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Diagnostica clinica
- Malattie infettive
Sfondo
- Le specie di Enterococcus sono patogeni significativi nelle infezioni del flusso sanguigno.
- L'identificazione rapida da colture ematiche è fondamentale per un trattamento efficace.
- La PNA FISH offre un metodo specifico per identificare questi organismi.
- Il protocollo è stato progettato per essere efficiente e affidabile.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di identificazione rapida per le specie di Enterococcus.
- Migliorare la velocità diagnostica in ambito clinico.
- Supportare decisioni terapeutiche tempestive nel trattamento della sepsi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di colture ematiche e colorazione di Gram per confermare la presenza di Enterococcus.
- Utilizzo di sonde PNA specifiche per specie di Enterococcus.
- Microscopia a fluorescenza per la visualizzazione dei campioni ibridati.
- Inclusione di vetrini di controllo per la valutazione della qualità.
Risultati principali
- Identificazione efficace di specie di Enterococcus mediante PNA FISH.
- La microscopia a fluorescenza distingue efficacemente tra le specie.
- Risultati rapidi che facilitano decisioni cliniche tempestive.
- Il protocollo dimostra alta specificità e affidabilità.
Conclusioni
- Il protocollo PNA FISH è uno strumento prezioso per la diagnostica microbiologica.
- Migliora la velocità di identificazione dei patogeni nei colturi ematici.
- Questo metodo può influenzare in modo significativo la gestione della sepsi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione rapida a livello di specie di Enterococcus da colture ematiche supporta un uso tempestivo e appropriato degli antimicrobici e il monitoraggio della resistenza nella gestione del sepsi. La differenziazione tra E. faecalis e E. faecium orienta le decisioni terapeutiche precoci, data la diversa sensibilità ai farmaci. Questo saggio PNA FISH della durata di 1,5 ore permette di ridurre i rischi associati alle scelte terapeutiche empiriche nei programmi di ricerca sulle malattie infettive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi sui meccanismi di virulenza specifici per specie nei modelli di batteriemia.
- Valore operativo: Fornisce un'identificazione microbica standardizzata per studi preclinici di sepsi riproducibili.
- Valore predittivo: Supporta l'affidabilità del bersaglio collegando l'identificazione della specie a profili differenziali di risposta ai farmaci.
Screening e sviluppo di saggi
- Prontezza del saggio: Genera output di fluorescenza quantificati per la validazione di risultati positivi nei flussi di screening antimicrobici.
- Riproducibilità: Include controlli positivi/negativi integrati che garantiscono la robustezza del saggio tra diversi operatori.
- Scalabilità: Compatibile con l'elaborazione ad alto rendimento di preparati per il profilo di librerie di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la patofisiologia della batteriemia umana consentendo la caratterizzazione di modelli di sepsi stratificati per specie.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del bersaglio in vitro agli studi di efficacia in vivo utilizzando ceppi microbici clinicamente rilevanti.
- Mitigazione del rischio: Riduce l'attribuzione errata di effetti terapeutici a bersagli microbici incorretti nei modelli di sepsi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posiziona l'identificazione microbica come un controllo critico tra la validazione dell'obiettivo e l'ottimizzazione del composto iniziale nella scoperta di agenti anti-infettivi.
- Biologia della scoperta: Conferma l'attività sul bersaglio verificando le specie causative in modelli di infezione prima dell'elucidazione del meccanismo.
- Screening: Permette la determinazione dell'MIC specifica per specie al fine di valutare con precisione la potenza del composto.
- Analisi: Fornisce risultati binari per specie che permettono di stratificare i composti attivi in base allo spettro di attività.
- Ricerca traslazionale: Garantisce che i modelli preclinici rispecchino la diversità degli isolati clinici per una validità predittiva.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile ad altri patogeni Gram-positivi mediante riprogettazione delle sonde per un'applicazione su piattaforma estesa.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'interpretazione dei modelli di sepsi mediante l'identificazione precisa del patogeno.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro microbiologici tra i team di ricerca e preclinici.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo eliminando l'errata identificazione della specie come fattore confondente nei dati di efficacia.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento stratificato per rischio dei candidati a spettro ristretto rispetto a quelli a spettro ampio, in base all'epidemiologia della resistenza.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e tecniche di ibridazione degli acidi nucleici.
- Dipende da attrezzature per il termociclaggio in grado di mantenere 55 °C durante i passaggi di fissazione, ibridazione e lavaggio.
- Necessita di protocolli standardizzati di preparazione dei vetrini per garantire una fissazione del campione e un'accessibilità delle sonde costanti.
- Richiede una validazione su diverse ceppi di Enterococcus per confermare la specificità delle sonde in pannelli di isolati a livello globale.
- Limitato alle specie rilevabili per le quali sono disponibili sonde PNA; specie nuove o rare potrebbero richiedere metodi supplementari.
