Una procedura 1,5 ore per l'identificazione di Enterococcus Specie Direttamente da emocolture

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare rapidamente le specie di enterococco da flaconi di emocoltura positivi mediante ibridazione fluorescente con acido peptidonucleico e ibridazione C due. Una volta che le emocolture sono state preparate e sottoposte a colorazione di Gram per confermare la presenza di enterococchi in coltura, i campioni vengono fissati su vetrini per ibridazione PNA. Successivamente, i vetrini vengono incubati con sonde PNA specifiche per gli organismi di interesse.

Dopo l'ibridazione delle sonde, si esegue un lavaggio stringente per rimuovere l'eccesso di sonda non ibridata. Si aggiunge un mezzo di montaggio ai vetrini, che vengono quindi sigillati con coprioggetti. Le specie di enterococco presenti nel campione possono essere identificate mediante microscopia a fluorescenza.

Questo protocollo di identificazione PNA Fish è unico in quanto fornisce un metodo rapido e specifico per l'identificazione di enterococco proveniente da paralisi. Incubare due flaconi per emocoltura, uno aerobico e uno anaerobico, contenenti sangue venoso prelevato da un paziente sospetto di sepsi, in uno strumento automatizzato per emocolture a 35 gradi Celsius. Una volta che l'apparecchio indica di aver rilevato una crescita microbica, rimuovere il flacone e agitare delicatamente i flaconi per emocoltura per risospendere in modo uniforme i batteri.

Quindi, utilizzando una siringa sterile e un ago, trasferire asetticamente circa cinque millilitri di sangue da ciascuna bottiglia in un tubo distinto con tappo a vite. Una volta assegnati tutti i campioni, utilizzare una pipetta sterile per trasferire una goccia di sangue da ciascun tubo su un vetrino da microscopio in vetro separato. Lasciare asciugare il vetrino all'aria per circa 15 minuti.

Successivamente, una volta che il vetrino è completamente asciutto, immergerlo nel metanolo per fissare il campione. Dopo che i vetrini sono stati fissati, lavarli ed eseguire una colorazione Gram standard per determinare la morfologia degli organismi presenti in ciascuna coltura ematica. Esaminare i vetrini colorati utilizzando un microscopio con obiettivo ad immersione in olio.

Inserire una specie di caucci apparirà come cocchi gram-positivi tipicamente assemblati in coppie o catene corte. Posizionare una goccia di soluzione fissante nella cavità di un vetrino da microscopio per pesci. Mescolare delicatamente il tubo di emocoltura da sottoporre a test.

Quindi trasferire 10 microlitri di coltura sulla goccia di soluzione fissante e aspirare e rilasciare più volte per emulsionare il campione. Posizionare i vetrini su una piastra riscaldante a 55 gradi Celsius per 20 minuti per fissare gli strisci in ogni test. Assicurarsi di includere vetrini di controllo positivo e negativo per la valutazione della qualità del saggio.

Lestrini di controllo per callo possono essere acquistati da un fornitore Van DX oppure preparati utilizzando colture di riferimento. Una volta pronto lo striscio, aggiungere una goccia di EFI callous O-E-P-N-A nel pozzetto contenente il campione ematico in coltura, nonché nei pozzetti di controllo positivo e negativo. Per evitare la contaminazione della soluzione madre della sonda, accertarsi che la punta del flacone con contagocce non entri in contatto con lo striscio ematico.

Posizionare un coprioggetto sopra il campione, avendo cura di non creare bolle d'aria. Quindi incubare il vetrino su un blocco riscaldante a 55 gradi Celsius per 30 minuti. Per consentire l'ibridazione del PNA dopo l'incubazione, inserire i vetrini in un portavetrini.

Immergere il portavetrino caricato in una vaschetta di colorazione contenente soluzione di lavaggio preriscaldata a 55 gradi Celsius. Rimuovere l'eccesso di PNA dal campione e staccare delicatamente il coprioggetto agitando il vetrino nel tampone o utilizzando pinzette. Incubare il vetrino a 55 gradi Celsius nella soluzione di lavaggio per 30 minuti.

Quindi rimuovere il vetrino dalla vaschetta di colorazione e lasciarlo asciugare all'aria. Una volta che il vetrino è asciutto, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio a temperatura ambiente sul vetrino e posizionare con cura un coprioggetto sul campione. Esaminare i vetrini al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro a doppia banda entro due ore dalla preparazione.

Utilizzando questo metodo, iffy, calloso, mostrato in verde a sinistra, può essere distinto da eum in rosso. Nel pannello centrale a destra si osserva un risultato negativo. Tre aspetti da ricordare per ottenere risultati soddisfacenti sono che le temperature dello strumento devono essere mantenute alle temperature impostate.

È necessario seguire attentamente la procedura di colorazione come indicato nel foglietto illustrativo. Infine, è fondamentale disporre di un operatore esperto che esegua un'analisi accurata del vetrino. Questo protocollo è utile per prendere decisioni terapeutiche nel trattamento della sepsi causata da enterococco.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.