Name: Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri il saggio di homing competitivo per studiare la migrazione dei linfociti T gut-tropici nel topo. Questo metodo permette di confrontare le capacità migratorie di sottopopolazioni cellulari in un unico ricevente.

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EJV è sostenuto da una borsa di studio L&#39;s &amp; colite di Crohn Foundation of America (CCFA). JRM è supportato anche da finanziamenti CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) e Innovator Award nuovo direttore del NIH s.

1. Generazione ex vivo di cellule T gut-homing e di controllo (vedi Figura 1) <ol><li> Isolare splenociti da schiacciare uno milza di topi wild-type. Risospendere la sospensione le cellule in PBS e centrifugare per 5 'a 400 x g. Rimuovere il supernatante e lisare i globuli rossi da risospendere il pellet in 4 ml di tampone di lisi ACK per 2-3 minuti. Dopo di che, aggiungere 5 ml di PBS. Centrifugare per 5 'a 400 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere splenociti totale a 1 x 10 6 / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM di 2-mercaptoetanolo + penicillina / streptomicina (IMDM completo). Separare le cellule in due gruppi, uno dei quali è integrato con AR (o sintetiche RAR-agonisti, come Am80 o Am580) ad una concentrazione finale di 100-200 nM 3. Cellule T attivate in presenza di RA o RAR-agonisti sarà upregulate a4b7and CCR9 e diventerà gut-tropico cellule T, mentre le cellule T attivate senza RA diventeranno cellule T di controllo. </li><li> Aggiungere 1,5-2,0 mL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una 24-pozzetti precedentemente rivestita con anti-CD3 (10 mg / ml) e anti-CD28 (10 mg / ml) e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2 (per il rivestimento della piastra aggiungere 500 ml / pozzetto di anti-CD3, più anti-CD28 in PBS e incubare per 2 ore a 37 ˚ C e poi lavare due volte con 2 ml di PBS). </li><li> Al fine di evitare eccesso di stimolazione delle cellule T, dopo 2-3 giorni il trasferimento delle sospensioni di cellule in una nuova patinata 24-pozzetti. Incubare per altri 2-3 giorni. A seconda della densità delle cellule e la proliferazione dei media potrebbe diventare acido (giallo), nel qual caso potrebbe essere necessario sostituire la metà della media con fresca IMDM completa. Raccogliere le cellule dopo 4-5 giorni (contando da giorno 0). </li><li> Tipici rendimenti finali sono 1-2 x 10 6 cellule T effettrici / bene. Quindi, un minimo di 9-12 pozzi di ogni gut-tropico cellule T ed il controllo delle cellule T dovrebbe essere placcato per finire con 10-20 x 10 6 cellule T per condizione. </li></ol> 2. Analisi di gut-homing recettori su cellule T attivate Dopo 4-5 giorni di coltura si dovrebbero osservare un'alta espressione di gut-homing a4b7and CCR9 recettori sulle cellule T attivate in presenza di agonisti RA o RAR, mentre il controllo delle cellule T dovrebbe esprimere livelli molto bassi di questi recettori 4. Citometria a flusso (FACS) analisi. <ol><li> Raccogliere tra 0,2-0,5 x10 6 celle e centrifugare per 5 min a 300 g a 4 ° C. </li><li> Incubare con anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) e anti-CD8-PerCP per 15 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Dopo l'incubazione, centrifugare per 5 min a 300 g 4 ° C. Lavare e risospendere le cellule in colorazione buffer e analizzare con il FACS. </li></ol> 3. T etichettatura cella con inseguitori cellula CFSE e CMTMR <ol><li> Tenere tutte le soluzioni a 37 ° C prima di iniziare. Lavare gut-tropico cellule T (a4b7 alta CCR9 alta) e il controllo delle cellule T (a4b7 Basso / Neg CCR9 Basso / Neg) due volte con PBS per rimuovere il siero. Regolare la concentrazione delle cellule T a 10-15 x 10 6 / ml in PBS. </li><li> Aggiungi CFSE (Carboxyfluorescein succinimidile estere) o CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluorofori a uno gut-tropico T e il controllo delle cellule T ad una concentrazione finale di 5 mm e 10 mm, rispettivamente, dolcemente vortex e incubare per 20 minuti a 37 ° C. Si raccomanda di scambiare le labelings nello stesso o in un esperimento separato per escludere potenziali effetti intrinseci di fluorofori sulla migrazione delle cellule T. </li><li> Dopo l'incubazione, spegnere con 1 volume di FBS e incubare per 1-5 minuti a temperatura ambiente. Diluire 10 volte con caldo PBS e centrifugare per 5 min a 300 g. Lavare due volte con PBS e risospendere in IMDM completo. </li><li> Idealmente, 10-20 x 10 6 cellule di ogni popolazione T deve essere miscelato in rapporto 1:1 e poi centrifugato a 300 xg per 5 min. Infine, risospendere le cellule in 200-250 ml di PBS caldo e iniettare attraverso la vena della coda. </li><li> Per calcolare il rapporto esatto di ingresso (idealmente prossimo a 1) salvare 5-10 ml di sospensione cellulare iniettato e diluire con 300 ml di PBS e analizzare con il FACS. </li></ol> 4. Analisi di homing delle cellule T Anche se i topi possono essere analizzati in vari momenti (tra 1 ora e diversi giorni dopo l'iniezione di cellule T), homing di gut-tropico cellule T è meglio documentato tra 12-24 ore dopo l'iniezione. Punti di tempo più lungo aumentare i potenziali effetti di altre variabili che incidono sulla cella finale numeri / rapporti, come ad esempio l'apoptosi delle cellule T e cellule T uscita dal tessuto. Dopo i topi sono eutanasia, sospensioni cellulari da tessuti diversi devono essere isolati senza indugio al fine di diminuire la morte delle cellule, che potrebbero influire sul rendimento finale e risultati. I tessuti di interesse sono il piccolo intestino, colon, milza, linfonodi, placche di Peyer, fegato, polmoni e sangue. Se l'iniettate cellule T sono in buona fede gut-tropico cellule T, che dovrebbero a casa in media 5-10 volte migliore (o superiore) alla mucosa dell'intestino tenue rispetto al controllo delle cellule T. Tuttavia, altri tessuti, come il sangue e la milza, non dovrebbe mostrare una preferenziale la migrazione delle cellule T. Isolamento dei linfociti da lamina propria intestinale e il vano intraepiteliale è stato descritto in precedenza 5. <ol><li> Colorazione FACS: I campioni sono risospesi a seconda del numero di cellule raccolte, con una densità non superiore a 3,0 x 10 6 cellule / ml. Se congenic CD45.1 + o + Thy1.1 topi sono stati usati come destinatari, le cellule sono colorate con il marcatore corrispondente congenic (ad esempio, CD45.2 o Thy1.2) in combinazione con alcuni marker lignaggio (ad esempio, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Durante l'analisi FACS, le cellule sono gated sul marcatore congenic (ad esempio CD45.1) e poi sui globi lineage specifici (ad esempio CD4/CD8) e analizzati per i rapporti tra CMTMR e cellule CFSE positivo. </li><li> I dati sono di solito espressa come l'Indice di Homing (HI), che è calcolato come rapporto CFSE / CMTMR (o CMTMR / CFSE) in ogni tessuto divisa per il rapporto di ingresso corrispondente (vedi sotto). Se il rapporto di ingresso è molto vicino a 1, poi i rapporti tessuto sarà equivalente al HI. </li></ol> HI = CFSE tessuto / tessuto CMTMR: CFSE ingresso / CMTMR ingresso Il sangue dovrebbe essere analizzati al fine di determinare se le due popolazioni di cellule T sono ugualmente rappresentati in circolazione o se una popolazione di cellule T è diminuito rispetto agli altri (ad esempio, intrappolando preferenziale nei polmoni / fegato o con vitalità ridotta). Ciò può accadere quando si confrontano ingenuo o di riposo delle cellule T memoria rispetto recentemente attivato le cellule T effettrici, in quanto quest'ultimo potrebbe essere intrappolato in misura maggiore nei polmoni. Se il HI nel sangue è significativamente diverso da 1, si può normalizzare HI nei tessuti dalla HI nel sangue. Sangue può essere ottenuto tramite puntura cardiaca di topi anestetizzati (con l'eutanasia o Avertin isofluorane precedente) e devono essere lisate due volte con tampone ACK prima di utilizzarlo per la colorazione FACS. Normalizzazione sangue = HI tessuto / HI Sangue 5. Rappresentante Risultati Topi riceventi (Thy1.1 +) sono stati dopo l'iniezione euthanized18h cellulare. Sospensioni cellulari sono stati generati dalla milza, linfonodi periferici (PLN), linfonodi mesenterici (MLN) e piccola lamina propia intestino (LP). Dopo che le cellule sono state colorate per Thy1.2 e CD8 e poi analizzati da FACS di gating su valida Thy1.2 + cellule CD8 +, che sono stati infine analizzati per il rapporto tra le cellule CMTMR + (gut-tropico cellule T) e CFSE + cellule (controllo di cellule T) divisa per il rapporto di ingresso. I risultati possono essere visualizzati come mostrato nella Figura 2, in cui può essere apprezzato che gut-tropico e il controllo delle cellule T homed anche per la milza (HI vicino a 1, indicato con una linea rossa). Al contrario, gut-tropico cellule T migrate circa 10 volte più efficiente al LP rispetto al controllo delle cellule T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Schema della generazione e l'etichettatura di gut-tropico e non-gut cellule T tropico cellule T sono isolate da topi wild-type e attivato con anti-CD3/anti-CD28 e in presenza o assenza di 100-200 nM tutti - trans retinoico (RA). Dopo 4-5 giorni AR trattati con cellule T acquisire l'espressione dei recettori di homing intestino CCR9 e a4b7. Poi, gut-tropico e il controllo delle cellule T sono etichettati in modo differenziale con CFSE o CMTMR, lavati, mescolati in rapporto 1:1 e iniettato in un topo destinatario attraverso la vena della coda. Alcune cellule marcate sono utilizzati per determinare il CFSE / CMTMR rapporto input (dovrebbe essere vicino a 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Esempio di analisi homing topi analizzati 12-18 ore dopo l'iniezione di cellule T e le sospensioni singola cella sono ottenute dagli organi di interesse. Le cellule sono colorate con anti-Thy1.2 (marcatore congenic) più anti-CD8 + e poi Thy1.2 cellule T CD8 + vengono analizzati per il rapporto tra CMTMR CFSE + + e le cellule di ogni tessuto da FACS. Il CMTMR / CFSE rapporti tessuti vengono poi normalizzate dal rapporto input CMTMR / CFSE di ottenere gli indici di homing (HI). In questo esempio e + CMTMR CFSE cellule + sono gut-tropico e le cellule T effettrici controllo, rispettivamente.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Anche se gli esperimenti di homing fornire informazioni molto importanti sulla migrazione di popolazioni di cellule totali in qualsiasi tessuto dato, va tenuto presente che questi test non direttamente analizzare l&#39;adesione endoteliale e, pertanto, che non discriminino in cui passo (s) del adesione multistep cascata (tethering / a rotazione, l&#39;attivazione o attaccare), un recettore dato homing agisce. Il gold standard per definire il ruolo specifico dei recettori di homing in cascata l&#39;adesione è microscopia...

Animali: topi C57BL / 6 sono comunemente usati per l&#39;isolamento delle cellule T. Inoltre, CD45.1 e Thy1.1 ceppi congenic sono disponibili attraverso Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Cultura dei media: IMDM (Medium Iscove di modifica Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) più 10% di siero FBS (Fetal Bovine Serum, endotossine basse, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina (antibiotici Hyclone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / amfotericina B (Gibco), e 50 mm b-mercaptoetanolo. ACK Red Cell Lysis buffer di sangue (globuli rossi, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), portato a pH 7,2-7,4 e conservare a temperatura ambiente). PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). Citometria a flusso (FACS), media (PBS o IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Quando colorazione utilizzando selectina-Fc chimere, mezzi di comunicazione con 2 mM Ca + + deve essere usato in tutte le misure (compresa l&#39;acquisizione FACS). IMDM è raccomandato in questo caso. Etichettatura delle cellule T e adottiva di trasferimento: CFSE (diacetato carboxyfluorescein, succinimidile estere), CMTMR ((5 - (e-6 )-((( 4-clorometil) benzoile) ammino) tetrametilrodamina) da Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x scorte dovrebbe essere effettuata in DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) e conservati a -20 ° C. Policlonale attivazione delle cellule T: 24-bene o piastre a 96 pozzetti (tessuto-coltura trattata, polistirolo, a fondo piatto con coperchio, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) vengono incubate per 2 ore a 37 ° C con 50 ml di PBS, rispettivamente , contenente anti-CD3 più anticorpi anti-CD28 (10 mg / mL). Poi, piastre di coltura vengono lavate due volte con PBS e utilizzato immediatamente per la coltura delle cellule T. In alternativa, Dynabeads rivestito con anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) possono essere utilizzati per l&#39;attivazione delle cellule T, invece di piatto legato anticorpi. Citometria a flusso (FACS) colorazione: attivazione policlonali: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing recettori: purificato CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotipo di controllo (IgG2a, k). Skin-homing recettori: P-selectina-Fc (depurata del mouse P-selectina - proteina di fusione IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectina-Fc (E-Selectin/Fc mouse ricombinante Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN), più corrispondente secondaria F capra reagente (ab &#39;) 2 anti-IgG umane R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Acido all-trans retinoico (Sigma, St. Louis, MO) è risospeso in etanolo assoluto o DMSO utilizzando una lampadina gialla o una fonte indiretta di luce durante la preparazione. Aliquote Conservare in flaconi di vetro a -80 ° C e al riparo dalla luce in ogni momento. Sintetico RAR-agonisti: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitivo saggi homing allo studio gut-tropico migrazione cellulare t

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Al fine di esercitare la loro funzione di linfociti bisogno di lasciare il sangue e migrare in vari tessuti del corpo. Adesione dei linfociti alle cellule endoteliali e lo stravaso del tessuto è un processo a più fasi controllate da molecole di adesione diversi (recettori di homing) ha espresso sui linfociti e le loro rispettive ligandi (addressins) visualizzati sulle cellule endoteliali 1 2. Anche se la funzione di questi recettori di adesione può essere parzialmente studiati ex vivo, l&#39;esame finale per la loro rilevanza fisiologica è quello di valutare il loro ruolo in vivo durante l&#39;adesione e la migrazione dei linfociti. Due strategie complementari sono state utilizzate per questo scopo: microscopia intravitale (IVM) e gli esperimenti di homing. Anche se IVM è stato essenziale per definire il contributo preciso di recettori di adesione specifici durante la cascata adesione in tempo reale e in diversi tessuti, IVM richiede tempo e lavoro intensivo, spesso richiede lo sviluppo di sofisticate tecniche chirurgiche, ha bisogno di isolamento prima di omogenea popolazioni di cellule e permette l&#39;analisi di un solo tessuto / organo in un dato momento. Al contrario, competitivo esperimenti di homing consentono il confronto diretto e simultaneo nella migrazione di due (o più) sottoinsiemi cellula lo stesso mouse e permettono anche l&#39;analisi di molti tessuti e di un elevato numero di cellule nel medesimo esperimento. Qui si descrive il classico protocollo di homing competitivo utilizzato per determinare il vantaggio / svantaggio di un tipo di cellula dato casa ai tessuti specifici rispetto ad una popolazione di cellule di controllo. Abbiamo scelto di illustrare le proprietà migratorie di gut-tropico rispetto a non gut-tropico cellule T, perché la mucosa intestinale è la superficie più grande corpo a contatto con l&#39;ambiente esterno ed è anche l&#39;olio extra-tessuto linfoide con il meglio definiti i requisiti migratori . Inoltre, un recente lavoro ha stabilito che la vitamina A metabolita acido all-trans retinoico (RA) è il principale meccanismo molecolare responsabile per indurre gut-specifici recettori di adesione (integrine recettori delle chemochine a4b7and CCR9) sui linfociti. Quindi, possiamo facilmente generare un gran numero di gut-tropico e non gut-tropico linfociti ex vivo, attivando le cellule T, in presenza o assenza di RA, rispettivamente, che possono essere finalmente utilizzati negli esperimenti di homing competitivo qui descritto.

Esperimenti di homing competitivo permettono di valutare direttamente le proprietà migratorie di due diverse popolazioni cellulari in un mouse. Qui illustrare questa procedura confrontando la migrazione di ex vivo generata gut-tropico rispetto a non-intestinali cellule T tropico.

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

Per poter esercitare la propria funzione, i linfociti devono lasciare il flusso sanguigno e migrare verso i diversi tessuti dell'organismo. L'adesione dei linfociti all'endotelio...

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare le capacità migratorie specifiche per tessuto di due o più sottoinsiemi cellulari nello stesso ricevente murino, consentendo l'analisi di numerosi tessuti e cellule in un singolo esperimento. Qui mostriamo un metodo per confrontare le capacità migratorie di linfociti T con tropismo intestinale e linfociti T di controllo generati in vitro in un topo ricevente di tipo selvaggio. Questo metodo può essere utilizzato, ad esempio, per determinare la capacità dei linfociti T con tropismo intestinale di migrare verso i linfonodi mesenterici intestinali, i linfonodi periferici e la milza.Rispetto ai linfociti T di controllo, in primo luogo devono essere generati in vitro linfociti T effetori gut-tropici e di controllo. Successivamente, i linfociti T sperimentali e di controllo devono essere marcati con coloranti differenziali e miscelati in rapporto uno a uno. Quindi, la miscela cellulare, ad eccezione di un piccolo campione di eloqua utilizzato per confermare il rapporto iniziale, viene iniettata nel topo ricevente.Infine, il topo viene sacrificato 18 ore dopo il trasferimento adottivo e gli organi di interesse vengono analizzati per la presenza di linfociti T con tropismo intestinale e linfociti T di controllo mediante citometria a flusso. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il trasferimento adottivo di una singola popolazione cellulare, consiste nell'iniezione di una combinazione di diversi sottotipi nello stesso topo ricevente, riducendo notevolmente la variabilità associata all'iniezione endovenosa o all'uso di topi riceventi diversi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie di malattie associate a un massivo infiltrato di leucociti, come la malattia infiammatoria intestinale.Ad esempio, ci permette di determinare quante molecole sono necessarie durante la migrazione normale e anche alterata dei linfociti all'intestino. Inoltre, questa procedura ci consente di valutare l'efficacia di farmaci progettati per bloccare il traffico dei leucociti. Etichettare ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di PBS contenente 10 milligrammi per millilitro di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. Incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% mentre i pozzetti vengono rivestiti.Sacrificare un topo di tipo selvatico ed estrarre la milza, ponendola in un tubo da 50 millilitri con mezzo. Isolare i linfociti splenici posizionando la milza tra due lamelle di vetro e frantumandola su una piastra di Petri. Sospendere nuovamente le cellule in PBS, trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e centrifugare per cinque minuti.A 400 G a temperatura ambiente, rimuovere il sopranatante e lisare i globuli rossi risospendendo il pellet cellulare in quattro millilitri di buffer di lisi attivo per due o tre minuti. Arrestare la lisi con cinque millilitri di PBS, centrifugare nuovamente la sospensione cellulare per cinque minuti a 400 G a temperatura ambiente e scartare il sopranatante. Risospendere il pellet risultante in un decimo del volume iniziale a una concentrazione di sei cellule per millilitro in ghiaccio completo.Dividere in parti uguali il mezzo modificato Coves delcos o l'IMDM in due provette separate, aggiungendo in una delle provette acido retinoico tutto trans o RA fino a una concentrazione finale di 100-200 nanomolar cubo. Proteggere la provetta dalla luce diretta per evitare la degradazione dell'acido retinoico tutto trans. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti dall'incubatore e lavare ogni pozzetto due volte con due millilitri di PBS.Aggiungere da 1,5 a due millilitri della sospensione cellulare arricchita con RA a metà della piastra a 24 pozzetti. Quindi aggiungere la stessa quantità di cellule di controllo in ciascun pozzetto dell'altra metà della piastra a 24 pozzetti e reinserire la piastra nell'incubatore. Dopo due o tre giorni, trasferire le sospensioni cellulari in una nuova piastra a 24 pozzetti non rivestita.Per evitare un'eccessiva stimolazione delle cellule T, incubare le cellule per altri due o tre giorni. Se il mezzo diventa giallo a causa della densità cellulare e/o della proliferazione, aggiungere 500 microlitri di IMDM fresco in ogni pozzetto per raggiungere un volume finale di un millilitro per pozzetto. Per raccogliere le cellule, prelevare il sopranatante al quarto o quinto giorno, considerando come giorno zero il giorno in cui le cellule sono state seminate.I resa finali tipici sono da uno a due volte 10 delle sei cellule T effettrici per pozzetto. Pertanto, un minimo di nove a dodici pozzetti di ciascuna delle cellule T tropiche per l'intestino e delle cellule T controllate dovrebbe essere seminato al fine di generare da 10 a 20 volte 10 alla sesta cellule T per gruppo. Per verificare i livelli di espressione di alfa quattro, beta sette e CCR nove su ra.I linfociti T attivati e controllati vengono raccolti, in una quantità compresa tra 0,2 e 0,5 volte 10 alla sesta delle cellule sperimentali e di controllo appena ottenute, in provette da 4 millilitri e centrifugati. Le provette per 5 minuti a 300 G a 4 gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone per marcatura, quindi incubare con anti-CD4 FSE, anti-CD4β7 PE, anti-CCR9 APC e anti-CD8 PerP per 15 minuti a 4 gradi Celsius al buio.Dopo l'incubazione, lavare le cellule con PBS per cinque minuti a 300 GS e 4 gradi Celsius, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule nel tampone di marcatura. Analizzare mediante citometria a flusso all'inizio di questo passaggio. Riscaldare preventivamente una bottiglia di IMDM e una di PBS a 37 gradi Celsius per un uso successivo nel protocollo di marcatura.Dopo aver confermato i fenotipi di homing delle cellule T delle due colture cellulari mediante citometria a flusso come descritto nel passaggio precedente, centrifugare le popolazioni di cellule T appena raccolte, ad alto tropismo intestinale (alfa 4, beta 7, CCR9 alto) e le popolazioni di controllo di cellule T (alfa 4, beta 7, CCR9 basso o negativo) a 300 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule altre due volte con PBS per rimuovere il siero, quindi regolare la concentrazione delle cellule T per ciascun gruppo a 10-15 × 10⁶ cellule per millilitro. In PBS, aggiungere il colorante CFSE o CMTMR a cellule T con tropismo intestinale o a cellule T di controllo.Qui il CFSE viene aggiunto alla popolazione cellulare di controllo e il C-M-T-M-R viene aggiunto all'intestino. Le cellule T tropiche raggiungono una concentrazione finale rispettivamente di cinque millimolari e 10 millimolari; vortexare delicatamente le cellule per cinque secondi e incubare i tubi per 20 minuti a 37 gradi Celsius nel bagnomaria. Al termine del periodo di incubazione, arrestare la colorazione aggiungendo cinque millilitri di FPS e incubare per uno a cinque minuti a temperatura ambiente.Diluire 10 volte con PBS tiepido e centrifugare per cinque minuti a 300 G a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e lavare ulteriormente due volte con PBS, quindi risospendere le cellule in IMDM completo. Idealmente, da 10 a 20 volte il 10⁻⁶ di cellule di ciascuna popolazione di linfociti T deve essere mescolato in provette da 4 millilitri in rapporto uno a uno.Per calcolare il rapporto di input esatto, conservare da cinque a dieci microlitri della sospensione cellulare iniettata nei tubi, denominata input, e mantenerla a quattro gradi Celsius. Centrifugare la miscela cellulare da iniettare a 300 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Ri-sospendere le cellule da iniettare in 250-300 microlitri di PBS caldo. Caricare una siringa da un CC per insulina con ago da 28 gauge con le cellule da iniettare.Iniettare 250 microlitri della miscela cellulare attraverso la vena della coda. Infine, analizzare le cellule in ingresso mediante citometria a flusso per ottenere la percentuale di cellule positive a CFSE e C-M-T-M-R precedentemente iniettate. Tale valore rappresenterà il rapporto in ingresso utilizzato.Nel calcolo finale dell'indice di homing, sospendiamo i campioni cellulari provenienti dai tessuti per l'analisi dell'homing dei linfociti T a una densità non superiore a tre volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Se vengono utilizzati topi conigenici come riceventi per questo esperimento, le cellule CD45.1 positive sono state marcate con l'opportuno marcatore conigenico combinato a un marcatore di linea durante l'analisi citofluorimetrica; si effettua il gating sul marcatore conigenico scelto, quindi sul marcatore di linea specifico CD8, e si analizzano i rapporti tra cellule CMTMR e cellule positive per CFSE.I dati vengono quindi espressi come indice di homing o hi, che viene calcolato come rapporto tra le due diverse colorazioni in ciascun tessuto diviso per il corrispondente rapporto in ingresso. Il rapporto in ingresso è il rapporto tra le cellule positive a CFSE e quelle positive a CMTM TMR nella siringa prima dell'iniezione, calcolato a partire da un'aliquote di cinque-dieci microlitri di sospensione cellulare messa da parte e analizzata mediante citometria a flusso a tale scopo. Se il rapporto in ingresso è molto vicino a uno, allora i rapporti nei tessuti saranno equivalenti all'hi.Se l'indice di omeostasi (HI) nel sangue differisce in modo significativo da uno, l'HI nei tessuti in esame può essere normalizzato rispetto all'HI nel sangue calcolando il rapporto tra l'HI nei tessuti e l'HI nelle sospensioni cellulari ottenute dal milza, dai linfonodi periferici o linfonodi linfatici mesenterici (PLN o MLN) e dalla lamina propria (LP) dell'intestino tenue, 18 ore dopo l'iniezione. Sono state analizzate l'espressione di C-M-T-M-R e CFSE su cellule CD8 positive e CD45.1 positive selezionate mediante gating, attivate per α4, β7 e CCR9. Le cellule T positive per C-M-T-M-R si dirigono verso il milza in numeri uguali rispetto alle cellule controllo CFSE positive, ma mostrano un marcato aumento nell'omoincircolazione verso l'intestino e verso i tessuti linfatici di drenaggio. Il calcolo dell'HI per ciascun tessuto ha ulteriormente confermato che le cellule T con tropismo intestinale e quelle di controllo si dirigono in ugual misura verso il milza, ma al contrario, le cellule T con tropismo intestinale migrano verso la lamina propria (LP) con un'efficienza di circa 10 volte superiore rispetto alle cellule T di controllo, dopo il perfezionamento della procedura.L'utilizzo di topi congenici invece della marcatura con coloranti può essere effettuato per valutare la capacità migratoria di ulteriori tipi cellulari, come le cellule dendritiche o i macrofagi. Poiché questi tipi cellulari tendono a perdere il colorante una volta iniettati nei topi riceventi, l'uso di animali congenici permette un migliore tracciamento delle cellule e per periodi di tempo molto più lunghi dopo il trasferimento adottivo.

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Immunologia e Infezioni

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