Name: Con tutto il supporto per lanalisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri l'immunoistochimica whole-mount per analizzare la morfogenesi vascolare nella pelle degli arti embrionali del topo. Questo metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle reti vascolari in sviluppo.

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Ringraziamo K. Gill per l&#39;assistenza con l&#39;allevamento del mouse e cura e per la gestione del laboratorio. Grazie anche a Mukoyama membri laboratorio per assistenza tecnica. Il finanziamento è stato fornito dal programma di ricerca intramurale degli Istituti Naitonal della Salute.

1. La raccolta degli arti pelle embrionali di topo (~ E13.5 E17.5) <ol><li> Euthanize collegato femmine con procedura approvata. Secondo il nostro protocollo animali approvati, le femmine sono eutanasia da CO 2 l'esposizione e poi assicurata dalla dislocazione cervicale. Giaceva l'animale al tovagliolo di carta assorbente e immergerlo completamente nel 70% EtOH / H 2 O da una bottiglia a spruzzo. </li><li> Sezionare l'utero intatto e mettetelo in un piatto da 100 mm x 15 Petri contenenti soluzione equilibrata Salt ghiacciata Hanks '(HBSS) per lavare nel sangue. </li><li> Separati e sezionare l'embrione. Rimuovere il amnios molto sottile dall'embrione. </li><li> (Opzione) Dissect un singolo embrione in un piatto x 35 10 millimetri Petri se ogni embrione deve essere genotipizzati. Coda sezionato viene trasferito in un tubo da 0,2 ml PCR per la genotipizzazione. </li><li> Tagliare le zampe anteriori di embrione ed il trasferimento arti anteriori da una pinza l'anello in 24 pozzetti contenenti 2 ml di ghiacciata paraformaldeide fresca 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Fissare le zampe anteriori con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno seguente, togliere la PFA e lavare tre volte per 5 min in 2 ml di PBS con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Trasferimento degli arti anteriori in 100% di metanolo (MeOH) e memorizzarli congelatore a -20 ° C enzima (il congelatore con controllo della temperatura critica e senza funzione di sbrinamento automatico). Anticorpi primari indicati nella tabella 1 lavoro dopo il trattamento MeOH 100%. </li><li> Pelle a buccia fuori dalla zampa anteriore con una pinzetta sottile. Cutanee degli arti, quando disidratato, dovrebbe separare facilmente dal arto. In primo luogo l'arto con il lato ventrale (lato palmo) verso l'alto. Quindi, utilizzando una pinzetta sottile, tagliare la pelle, come mostrato nel video. Avanti sezionare intorno tutto l'arto, desquamazione della pelle fuori delicatamente senza alcun danno. </li></ol> 2. Tutto-mount la colorazione immunoistochimica di Skins Limb <ol><li> Reidratare le pelli arto in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo incubando attraverso la serie graduata di MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) per 5 minuti ciascuno. Si noti che lo scambio di soluzioni dovrebbero fare attenzione a non danneggiare le bucce degli arti. </li><li> Lavare due volte per 5 min in PBT con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Bloccare le pelli di capra arto o con 10% di siero / PBS +0,2% TX100 tampone di bloccaggio per gli anticorpi di capra secondario o al 10% Donkey siero / PBS +0,2% TX100 tampone di bloccaggio per gli anticorpi asino secondaria di 2 ore con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a a temperatura ambiente. </li><li> Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza ad anello in 2ml-microcentrifuga tubo con 800μl di anticorpi primari (diluizione appropriato tra quelli riportati nelle tabelle) nel tampone di bloccaggio (o di capra 10% di siero / PBS 0,2 TX100% o 10% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%). Incubare le pelli arto con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a 4 ° C durante la notte. Si noti che più gli anticorpi primari derivati ​​da specie diverse (ad esempio, anticorpo monoclonale di ratto + anticorpo policlonale di coniglio) possono essere utilizzati contemporaneamente. </li><li> Il giorno seguente, posizionare le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza l'anello in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo con 4 ml di tampone di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS +0,2% TX100 o 2 Donkey% siero / PBS TX100 +0,2%). </li><li> Lavare cinque volte per 15 minuti mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza ad anello in 2ml-microcentrifuga tubo con 800μl di anticorpi secondari nel buffer di blocco (o 10% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o al 10% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%). Di solito si usa anticorpi secondari da Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, diluizioni 1:300) o Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 diluizione). Filtrare la soluzione secondaria di anticorpi utilizzando 0.22μm PVDF filtri a membrana siringa per rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari. Incubare le bucce arto al buio o avvolti con fogli di alluminio per 1 ora mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. Si noti che diversi fluorescente anticorpi coniugati secondari derivati ​​da specie diverse possono essere utilizzati contemporaneamente. </li><li> Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza l'anello in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo con 4 ml di tampone di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS +0,2% TX100). Lavare cinque volte per 15 minuti al buio o avvolti in fogli di alluminio con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> (Opzione per la contro-contro nucleo) Incubare le pelli degli arti con 4 ml di tampone di lavaggio (sia Capra 2% siero / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%), con A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , diluizione 1:3000) al buio o avvolti con fogli di alluminio per 10 minuti mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura temperare. Poi, lavare tre volte per 5 min con 4ml del buffer di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%), al buio o avvolta da un foglio di alluminio con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. Si noti che la colorazione forte e specifico per i nuclei si osserva per To-pro-3 in una emissione specifica (HeNe 633 nm di eccitazione). </li></ol> 3. Montaggio del Skins Limb su Slide <ol><li> Mettere le bucce arto su un piatto x 35 10 millimetri Petri. Rimuovere polveri, cristalli, fibre dallo strato interno della pelle con una pinzetta sottile con lo stereomicroscopio, con illuminazione bassa per evitare foto esteso sbiancamento. </li><li> Trasferire le pelli arto per adesivo microscopio da una pinza ad anello. Posizionare le bucce con lo strato interno disteso verso l'alto della diapositiva (cioè verso coprioggetto). Appiattire la pelle accuratamente con una pinzetta sottile e rimuovere riporto il tampone di lavaggio da Kimwipe. </li><li> Montare in supporti di montaggio anti-sbiadimento senza bolle d'aria. Utilizziamo 25 coprioggetto "x25". Cure su una superficie piana al buio (per esempio, i campioni montato utilizzando Prolungare reagente oro sono poste una notte al buio a temperatura ambiente prima linea). Per la conservazione a lungo termine, sigillare il coprioggetto alla diapositiva e conservare a 4 ° C. </li></ol> 4. Microscopia confocale <ol><li> Impostare laser appropriato per fluorofori. Noi usiamo microscopio confocale Leica TCS SP5 con tre sorgenti laser compresa Argon 488 nm (per Alexa Fluor 488 e GFP), DPSS 561nm (per Alexa Fluor 568 e Cy3) e HeNe 633nm (per Alexa Fluor 633, Cy5 e To-Pro-3) . </li><li> Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale per evitare o ridurre le interferenze, in cui tutti i coloranti in campioni di doppia o tripla macchiati saranno entusiasti al tempo stesso. Nella modalità di scansione sequenziale, le immagini verranno registrate in ordine sequenziale. </li><li> Altre informazioni relative al coloranti fluorescenti e laser per l'eccitazione può essere fondata in "Microscopia confocale per biologi" di Hibbs (2004) </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Tutto-mount microscopia confocale tripla etichetta immnofluorescence in pelle di topo anteriore al E15.5 con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (Fig. 1A-C, D blu), il marker neurofilamenti 2H3 (Figura 1A verde), e le cellule muscolari lisce marcatore αSMA (Figura 1A, B rossa) ha rivelato un quadro caratteristico di ramificazione di αSMA arterie +, in linea con 2H3 + nervi periferici nella pelle degli arti. Oltre al vaso sanguigno ramificazione, questa skin modello vascolarizzazione degli arti vengono usati per studiare patterning di vasi linfatici branching tramite anticorpi per il marcatore delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 (Figura 1D, E rosso) e Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1D, F verde ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (AC) Arterie allinearsi con i nervi periferici nella pelle degli arti embrionali. Tutto-mount tripla etichetta microscopia confocale immnofluorescence con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (AC, blu), il marker neurofilamenti 2H3 (A, verde), e il buon marker delle cellule muscolari αSMA (A e B, rosso ) viene visualizzato. A E15.5, 2H3 + nervi periferici (frecce aperte) associare arterie (punte di freccia), che sono coperti da αSMA + cellule muscolari lisce. (DF) vasi linfatici nella pelle degli arti embrionali. Triple-label microscopia confocale immnofluorescence con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (D, blu), il marker delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 (D ed E, rosso) e Neuropilin2 (NRP2) (D e F, verde ) viene visualizzato. Vasi linfatici sono visualizzate da entrambi LYVE-1 e NRP2, mentre LYVE-1 è espressa anche da un sottoinsieme di macrofagi (punte di freccia aperta). Scala grafica: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema vascolare è fondamentale per lo sviluppo degli organi durante l&#39;embriogenesi, nonché per la manutenzione degli organi e delle funzioni riproduttive negli adulti, in quanto fornisce sufficiente ossigeno e nutrienti agli organi. Adeguata rete vascolare è ben stabilita con processi complessi e multi-passo per l&#39;angiogenesi in cui viene riorganizzato pre-esistente rete capillare di strutture fortemente ramificate e gerarchica. Sebbene numerose opere sono state dimostrato che una varietà di molecole è coin...

Anticorpi Pan-marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Criceto armeno (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Diluizione 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr><tr><td> Collagene IV </td><td> Coniglio (P) </td><td> ABD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> Diluizione 1:300 # 2 </td></tr></tbody></table> Arterioso marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Laboratorio del Kolodkin Alex # 3 </td><td></td><td> Diluizione 1:3000 </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Capra (P) </td><td> R &amp; S </td><td> AF1006 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Venoso marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Capra (P) </td><td> R &amp; S </td><td> AF446 </td><td> Diluizione 1:100 </td></tr></tbody></table> Linfatico marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Capra (P) </td><td> R &amp; S </td><td> AF2727 </td><td> Diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 diluizione </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Criceto siriano (M) </td><td> Ibridomi Banca </td><td> 8.1.1 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Delle cellule muscolari lisce / periciti marcatore <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Mouse (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> Diluizione 1:500 # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Coniglio (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per giornalista GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Coniglio (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per giornalista LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Coniglio (P) </td><td> MP Biomedica </td><td> 55976 </td><td> Diluizione 1:5000 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Capra (P) </td><td> ABD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per assoni periferici <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Mouse (M) # 7 </td><td> Ibridomi Banca </td><td> 2H3 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Mouse (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> Coniglio (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per la migrazione di cellule di Schwann <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Coniglio (P) </td><td> Il laboratorio di Thomas Müller # 9 </td><td></td><td> Diluizione 1:3000 </td></tr></tbody></table> (P): anticorpo policlonale, (M): anticorpo monoclonale # 1: capra anti-armeno criceto-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) anticorpo deve essere usato come anticorpo secondario. # 2: l&#39;anticorpo collagene IV può essere utilizzato per rilevare i vasi sanguigni dopo ibridazione in situ. # 3: L&#39;anticorpo Neuropilin1 è gentilmente fornito da laboratorio del Kolodkin di Alex nella Johns Hopkins University. Pecora anti-umano degli anticorpi Neuropilin1 è disponibile in R &amp; S (AF3870), anche se non l&#39;abbiamo ancora testato. # 4: Il LYVE-1 anticorpi anche rilevare un sottoinsieme dei macrofagi nella pelle embrionale. # 5: L&#39;anti-αSMA anticorpo monoclonale di topo IgG2a. # 6: Il Cy3-anticorpo coniugato αSMA è incubato per 1 ora a temperatura ambiente insieme al secanticorpi secondaria per gli altri anticorpi primari. # 7: 2H3 anticorpo è topo monoclonale IgG1 contro neurofilamenti. # 8: Tuj1 anticorpo è topo IgG2a anticorpi monoclonali contro Neuron specifica classe III beta-tubulina. # 9: (cervello-specifiche di acidi grassi legame con le proteine) BFABP anticorpo è gentilmente fornito da laboratorio del Müller Thomas in Max-Delbrück-Centro di Medicina Molecolare.

con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Tutto-mount analisi immunoistochimica per l&#39;imaging la vascolarizzazione intera è fondamentale per la comprensione dei meccanismi cellulari di ramificazione morfogenesi. Abbiamo sviluppato la pelle modello vascolarizzazione degli arti per lo studio dello sviluppo vascolare in cui viene riorganizzato un preesistente primitivo plesso capillare in una rete ramificata gerarchicamente vascolare. Tutto-mount microscopia confocale con etichettatura più permette l&#39;imaging con robusto dei vasi sanguigni intatti così come i loro componenti cellulari, comprese le cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce, utilizzando specifici marcatori fluorescenti. I progressi in questo modello vascolarizzazione della pelle degli arti con studi genetici hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari di sviluppo vascolare e patterning. La pelle modello vascolarizzazione degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici fornire un modello spaziale per la differenziazione ed il modello delle arterie. In questo articolo video descrive un protocollo semplice e robusto per colorare i vasi sanguigni intatti vascolare con anticorpi specifici e anticorpi secondari fluorescenti, che è applicabile per vascolarizzato organi embrionali dove siamo in grado di seguire il processo di sviluppo vascolare.

Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l&#39;etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

L'analisi immunoistochimica whole-mount per l'imaging dell'intera vascolarizzazione è fondamentale per comprendere i meccanismi cellulari della morfogenesi ramificata. Abbiamo sviluppato il modello della vascolarizzazione della pelle degli arti per studiare lo sviluppo vascolare in cui un plesso capillare primitivo preesistente viene riorganizzato in una rete vascolare ramificata gerarchicamente. La microscopia confocale whole-mount con marcatura multipla consente un imaging robusto di vasi sanguigni intatti cũng come dei loro componenti cellulari, incluse le cellule endoteliali, i periciti e le cellule muscolari lisce, utilizzando marker fluorescenti specifici. I progressi in questo modello di vascolarizzazione della pelle degli arti, integrati con studi genetici, hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari dello sviluppo e del patterning vascolare. Il modello della vascolarizzazione della pelle degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici forniscano un template spaziale per la differenziazione e il patterning delle arterie. Questo video-articolo descrive un protocollo semplice e robusto per colorare vasi sanguigni intatti con anticorpi specifici per il sistema vascolare e anticorpi secondari fluorescenti, applicabile agli organi embrionali vascolarizzati in cui è possibile seguire il processo di sviluppo vascolare.

L'obiettivo generale di questo procedimento è eseguire un'analisi immunohistochimica in montaggio intero per l'immagine dell'intera vascolarizzazione nella cute in via di sviluppo degli arti. Questo viene realizzato innanzitutto tagliando quattro arti dall'embrione, fissando i quattro arti in paraformaldeide al 4% in PBS e quindi disidratandoli in metanolo al 100%. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare pinzette fini per staccare la cute alla base dell'arto.Seguire le linee tratteggiate blu e staccare la pelle in una piastra contenente metanolo al 100%. Rimuovere la pelle dall'arto. Successivamente, viene eseguita la colorazione immunohistochimica con anticorpi primari specifici per i vasi sanguigni e anticorpi secondari fluorescenti sulla pelle dell'arto.Infine, la microscopia confocale su preparati interi con marcatura multipla permetterà un'analisi robusta dell'intera vascolarizzazione della cute delarto, vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'analisi istologica del conteggio incrociato. L'utilizzo di sezioni embrionali è che l'analisi immunohistochimica su preparati interi della vascolarizzazione della cute delarto ci consente non solo di visuali

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Questo articolo descrive un metodo per l'etichettatura di pelle embrionale e vasi sanguigni timo.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

Vi presentiamo un protocollo per l'analisi dei vasi coronarici, in tutto cuori murini embrionali fino a E15.5, usando metodi di colorazione immunologici standard, seguiti da gioco ottica e la microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione dei vasi sanguigni durante tutto cuore senza la necessità di analizzare tempo di sezioni seriali.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Questo protocollo introduce un metodo rapido per l'imaging vascolare tridimensionale quantitativo a montaggio intero utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. L'efficacia del metodo è dimostrata utilizzando il sistema arterioso dell'arco faringeo del modello di embrione di pollo, con forze emodinamiche quantificate tramite fluidodinamica computazionale.

Imaging rapido ad alta risoluzione a montaggio intero della vascolarizzazione di piccoli animali per studi quantitativi

Scopri l'immunoistochimica whole-mount per analizzare la morfogenesi vascolare nella pelle degli arti embrionali del topo. Questo metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle reti vascolari in sviluppo.

Con tutto il supporto per lanalisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione (Video) | JoVE Journal

Con tutto il supporto per l'analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

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