Con tutto il supporto per l'analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l'etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire l'analisi immunoistochimica dell'intero Mount per l'imaging dell'intera vascolarizzazione nella pelle degli arti in via di sviluppo. Ciò si ottiene tagliando prima quattro arti dall'embrione, fissando i quattro arti in aldeide paraforme al 4% in PBS e poi disidratandoli in metanolo al 100%. Il secondo passo consiste nell'utilizzare una pinzetta sottile per staccare la pelle alla base dell'arto.

Segui le linee tratteggiate blu e stacca la pelle in un piatto contenente metanolo al 100%. Rimuovere la pelle dall'arto. Successivamente, la colorazione immunoistochimica con anticorpi primari specifici vascolari e anticorpi secondari fluorescenti viene eseguita sulla pelle dell'arto.

Infine, la microscopia confocale a montaggio intero con marcatura multipla consentirà un imaging robusto della vascolarizzazione cutanea dell'intero arto Ciò può avvantaggiare questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'analisi istologica del conteggio incrociato. L'analisi immunoistochimica dell'intero sistema vascolare degli arti ci consente non solo di visualizzare l'intero sistema vascolare, compresi i componenti cellulari, ma anche di studiare i processi di differenziazione e il pattern delle cellule dei vasi sanguigni e la ramificazione dei vasi linfatici. Stiamo dimostrando la procedura insieme al postdoc DA del mio laboratorio, le pelli embrionali degli arti vengono raccolte da topi femmine gravide.

Dopo aver rimosso e lavato l'utero, lavorare al microscopio da dissezione per separare e sezionare gli embrioni. Una volta che gli embrioni sono stati sezionati, il passo successivo è quello di rimuovere i quattro LIMS dagli embrioni utilizzando una pinzetta sottile. Tagliare i quattro lim sulla spalla, quindi utilizzare una pinza ad anello per trasferire i quattro lim su una piastra a 24 pozzetti contenente ghiaccio.

Freddo, fresco 4%Paraform Hyde in PBS posizionare due quattro LIMS per pozzetto in due millilitri di PFA al 4%. Fissare i quattro arti con una miscelazione delicata su un miscelatore mutatore a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo. Rimuovere il PFA da ogni pozzetto e aggiungere due millilitri di PBS.

Lavare i campioni per cinque minuti mescolando delicatamente sul miscelatore mutatore a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio due volte per un totale di tre lavaggi. Quindi, trasferire i quattro arti in un tubo inferiore rotondo in polipropilene da cinque millilitri contenente il 100% di metanolo, conservare a meno 20 gradi Celsius in un congelatore enzimatico con controllo critico della temperatura e senza una funzione di sbrinamento automatico Dopo la conservazione notturna e i meno 20, la pelle può essere staccata dalla caduta.

Questo è uno degli aspetti più critici di questa procedura perché il successo della successiva colorazione e imaging dipende dal non danneggiare le pelli. La pelle dell'arto si separa facilmente dall'arto quando è disidratata in questo modo per staccare la pelle dai quattro arti. Per prima cosa posiziona l'arto con il lato ventrale rivolto verso l'alto.

Quindi, usando una pinzetta sottile, seziona la pelle vicino alla base dell'arto verso la zampa in linea retta. Quindi, seziona l'intero arto, staccando la pelle mentre giri l'arto. Una volta che le bucce sono state staccate.

I quattro arti iniziano la colorazione immunoistochimica dell'intero montatura delle pelli degli arti Preparare in anticipo. Tre provette stock da 50 millilitri con metanolo al 75%50% e 25% in PBT per la reidratazione. Le bucce, le pelli degli arti vengono reidratate incubando attraverso una serie grattugiata di metanolo dalle concentrazioni di metanolo più alte a quelle più basse per cinque minuti ciascuna.

Per iniziare, trasferire la pelle dell'arto in un tubo a fondo tondo in polipropilene da cinque millilitri contenente il 75% di metanolo in PBT. Dopo cinque minuti sul miscelatore mutatore, aspirare con cura il 75% di metanolo e riempire con il 50% di metanolo e PBT. Cinque minuti dopo.

Sostituire il 50% di metanolo con il 25% di metanolo e PBT. Al termine dell'incubazione finale. Aspirare con cautela il PBT di metanolo al 25% e rabboccare con PBT.

Lavare le pelli degli arti per cinque minuti mescolando delicatamente sul miscelatore mutatore a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio una volta. Facendo attenzione a non danneggiare la pelle degli arti durante lo scambio delle soluzioni.

Una volta reidratate le pelli degli arti, bloccarle con l'apposito tampone bloccante. Incubare per due ore mescolando delicatamente sul miscelatore di nutt a temperatura ambiente Dopo due ore, posizionare le pelli degli arti su una piastra di Petri di 35 x 10 millimetri. Quindi utilizzare una pinza ad anello per trasferire le pelli in una provetta da due millilitri contenente 800 microlitri di anticorpi primari diluiti nell'apposito tampone bloccante.

In questo caso, è possibile utilizzare contemporaneamente più anticorpi primari derivati da specie diverse. Incubare le pelli degli arti con una miscelazione delicata sul miscelatore mutatore a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo, posizionare le pelli degli arti su una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri. Trasferire le bucce in un tubo a fondo tondo in polipropilene da cinque millilitri contenente quattro litri dell'apposito tampone di lavaggio.

Lavare cinque volte per 15 minuti ciascuna mescolando delicatamente sul miscelatore mutatore a temperatura ambiente. Sostituire con cura il tampone usato con un nuovo tampone per ogni lavaggio durante i lavaggi. Preparare gli anticorpi secondari per rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari.

Utilizzare un filtro per siringa a membrana PVDF da 0,22 micron per filtrare la soluzione di anticorpi secondari in un tubo per fuge da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare il campione filtrato a 15.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere particelle e bolle d'aria. Raccogliere la soluzione di anticorpi filtrata in una provetta microfuge da due millilitri.

Al termine dei cinque lavaggi, posizionare le pelli degli arti su una piastra di Petri da 35 x 10 millimetri e trasferirle in un tubo micro fuge da due litri contenente 800 microlitri di anticorpi secondari nel tampone bloccante. In questa fase è possibile utilizzare contemporaneamente diversi anticorpi secondari coniugati fluorescenti derivati da specie diverse. Incubare gli arti, le pelli al buio per un'ora mescolando delicatamente sul miscelatore mutatore a temperatura ambiente.

Dopo un'ora di incubazione, posizionare le pelli degli arti su una piastra di Petri da 35 x 10 millimetri e trasferirle in un tubo a fondo tondo in polipropilene da cinque millilitri contenente quattro millilitri del tampone di lavaggio appropriato. Lavare cinque volte per 15 minuti ciascuna al buio mescolando delicatamente sul miscelatore Tator a temperatura ambiente per l'imaging mediante microscopia confocale. Le pelli degli arti devono essere montate su un vetrino dopo la colorazione immunoistochimica.

Per iniziare questa procedura, posizionare le pelli degli arti macchiate su una piastra di Petri di 35 x 10 millimetri, lavorando sotto uno stereomicroscopio a bassa illuminazione. Per evitare un esteso sbiancamento delle foto, utilizzare una pinzetta fine per rimuovere i cristalli di polvere e le fibre dallo strato interno delle pelli. Trasferire le pelli degli arti su un vetrino per microscopia adesivo.

Posizionare le pelli con lo strato interno rivolto verso l'alto sul vetrino rivolto verso il vetrino coprioggetti. Quindi appiattire accuratamente le bucce con una pinzetta fine. Rimuovere il tampone di lavaggio di Kim wipe.

Aggiungi il supporto di montaggio Antifa alle pelli e posiziona un vetrino coprioggetto 25 per 25 sopra i campioni. Facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria, polimerizzare su una superficie piana al buio a temperatura ambiente per la conservazione a lungo termine dei campioni. Sigillare il vetrino coprioggetto sul vetrino con smalto per unghie e conservare a quattro gradi Celsius.

Il patterning dei nervi e dei vasi sanguigni nel topo per la pelle degli arti a E 15.5 è mostrato da questi risultati rappresentativi dell'immunofluorescenza al microscopio confocale a tripla etichetta a montatura intera dell'immunofluorescenza del marcatore di cellule endoteliali pan-endoteliali pcam uno è blu. Il marcatore del neurofilamento due H tre è verde e il marcatore delle cellule muscolari lisce alfa SMA è rosso. Queste immagini hanno rivelato un caratteristico modello di ramificazione delle arterie alfa SMA positive indicato da una punta di freccia bianca allineata con due H tre nervi periferici indicati da frecce aperte oltre alla ramificazione dei vasi sanguigni.

Questo modello di vascolarizzazione cutanea degli arti può anche rivelare il pattern della ramificazione dei vasi linfatici utilizzando il marcatore delle cellule endoteliali linfatiche LYVE uno mostrato in rosso e la pillola neuro in due mostrata in verde i vasi linfatici sono visualizzati sia da LYV uno che da NRP due, mentre LYV uno è anche espresso da un sottoinsieme di macrofagi indicati dalle punte di freccia aperte. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per esplorare il complesso patterning e i processi di differenziazione della vascolarizzazione durante lo sviluppo dei tessuti, le riparazioni tissutali e in condizioni di malattia.