Name: Con tutto il supporto per lanalisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Scopri l'immunoistochimica whole-mount per analizzare la morfogenesi vascolare nella pelle degli arti embrionali del topo. Questo metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle reti vascolari in sviluppo.

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Ringraziamo K. Gill per l&#39;assistenza con l&#39;allevamento del mouse e cura e per la gestione del laboratorio. Grazie anche a Mukoyama membri laboratorio per assistenza tecnica. Il finanziamento è stato fornito dal programma di ricerca intramurale degli Istituti Naitonal della Salute.

1. La raccolta degli arti pelle embrionali di topo (~ E13.5 E17.5) <ol><li> Euthanize collegato femmine con procedura approvata. Secondo il nostro protocollo animali approvati, le femmine sono eutanasia da CO 2 l'esposizione e poi assicurata dalla dislocazione cervicale. Giaceva l'animale al tovagliolo di carta assorbente e immergerlo completamente nel 70% EtOH / H 2 O da una bottiglia a spruzzo. </li><li> Sezionare l'utero intatto e mettetelo in un piatto da 100 mm x 15 Petri contenenti soluzione equilibrata Salt ghiacciata Hanks '(HBSS) per lavare nel sangue. </li><li> Separati e sezionare l'embrione. Rimuovere il amnios molto sottile dall'embrione. </li><li> (Opzione) Dissect un singolo embrione in un piatto x 35 10 millimetri Petri se ogni embrione deve essere genotipizzati. Coda sezionato viene trasferito in un tubo da 0,2 ml PCR per la genotipizzazione. </li><li> Tagliare le zampe anteriori di embrione ed il trasferimento arti anteriori da una pinza l'anello in 24 pozzetti contenenti 2 ml di ghiacciata paraformaldeide fresca 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Fissare le zampe anteriori con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno seguente, togliere la PFA e lavare tre volte per 5 min in 2 ml di PBS con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Trasferimento degli arti anteriori in 100% di metanolo (MeOH) e memorizzarli congelatore a -20 ° C enzima (il congelatore con controllo della temperatura critica e senza funzione di sbrinamento automatico). Anticorpi primari indicati nella tabella 1 lavoro dopo il trattamento MeOH 100%. </li><li> Pelle a buccia fuori dalla zampa anteriore con una pinzetta sottile. Cutanee degli arti, quando disidratato, dovrebbe separare facilmente dal arto. In primo luogo l'arto con il lato ventrale (lato palmo) verso l'alto. Quindi, utilizzando una pinzetta sottile, tagliare la pelle, come mostrato nel video. Avanti sezionare intorno tutto l'arto, desquamazione della pelle fuori delicatamente senza alcun danno. </li></ol> 2. Tutto-mount la colorazione immunoistochimica di Skins Limb <ol><li> Reidratare le pelli arto in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo incubando attraverso la serie graduata di MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) per 5 minuti ciascuno. Si noti che lo scambio di soluzioni dovrebbero fare attenzione a non danneggiare le bucce degli arti. </li><li> Lavare due volte per 5 min in PBT con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Bloccare le pelli di capra arto o con 10% di siero / PBS +0,2% TX100 tampone di bloccaggio per gli anticorpi di capra secondario o al 10% Donkey siero / PBS +0,2% TX100 tampone di bloccaggio per gli anticorpi asino secondaria di 2 ore con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a a temperatura ambiente. </li><li> Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza ad anello in 2ml-microcentrifuga tubo con 800μl di anticorpi primari (diluizione appropriato tra quelli riportati nelle tabelle) nel tampone di bloccaggio (o di capra 10% di siero / PBS 0,2 TX100% o 10% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%). Incubare le pelli arto con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a 4 ° C durante la notte. Si noti che più gli anticorpi primari derivati ​​da specie diverse (ad esempio, anticorpo monoclonale di ratto + anticorpo policlonale di coniglio) possono essere utilizzati contemporaneamente. </li><li> Il giorno seguente, posizionare le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza l'anello in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo con 4 ml di tampone di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS +0,2% TX100 o 2 Donkey% siero / PBS TX100 +0,2%). </li><li> Lavare cinque volte per 15 minuti mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza ad anello in 2ml-microcentrifuga tubo con 800μl di anticorpi secondari nel buffer di blocco (o 10% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o al 10% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%). Di solito si usa anticorpi secondari da Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, diluizioni 1:300) o Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 diluizione). Filtrare la soluzione secondaria di anticorpi utilizzando 0.22μm PVDF filtri a membrana siringa per rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari. Incubare le bucce arto al buio o avvolti con fogli di alluminio per 1 ora mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. Si noti che diversi fluorescente anticorpi coniugati secondari derivati ​​da specie diverse possono essere utilizzati contemporaneamente. </li><li> Mettere le bucce arto su un piatto da 35 mm x 10 Petri e il trasferimento da una pinza l'anello in polipropilene da 5 ml a fondo rotondo tubo con 4 ml di tampone di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS +0,2% TX100). Lavare cinque volte per 15 minuti al buio o avvolti in fogli di alluminio con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. </li><li> (Opzione per la contro-contro nucleo) Incubare le pelli degli arti con 4 ml di tampone di lavaggio (sia Capra 2% siero / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%), con A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , diluizione 1:3000) al buio o avvolti con fogli di alluminio per 10 minuti mescolando con delicato sulla Mixer Nutator a temperatura temperare. Poi, lavare tre volte per 5 min con 4ml del buffer di lavaggio (sia il 2% siero di capra / PBS TX100 +0,2% o 2% Donkey siero / PBS TX100 +0,2%), al buio o avvolta da un foglio di alluminio con miscelazione delicata sulla Mixer Nutator a temperatura ambiente. Si noti che la colorazione forte e specifico per i nuclei si osserva per To-pro-3 in una emissione specifica (HeNe 633 nm di eccitazione). </li></ol> 3. Montaggio del Skins Limb su Slide <ol><li> Mettere le bucce arto su un piatto x 35 10 millimetri Petri. Rimuovere polveri, cristalli, fibre dallo strato interno della pelle con una pinzetta sottile con lo stereomicroscopio, con illuminazione bassa per evitare foto esteso sbiancamento. </li><li> Trasferire le pelli arto per adesivo microscopio da una pinza ad anello. Posizionare le bucce con lo strato interno disteso verso l'alto della diapositiva (cioè verso coprioggetto). Appiattire la pelle accuratamente con una pinzetta sottile e rimuovere riporto il tampone di lavaggio da Kimwipe. </li><li> Montare in supporti di montaggio anti-sbiadimento senza bolle d'aria. Utilizziamo 25 coprioggetto "x25". Cure su una superficie piana al buio (per esempio, i campioni montato utilizzando Prolungare reagente oro sono poste una notte al buio a temperatura ambiente prima linea). Per la conservazione a lungo termine, sigillare il coprioggetto alla diapositiva e conservare a 4 ° C. </li></ol> 4. Microscopia confocale <ol><li> Impostare laser appropriato per fluorofori. Noi usiamo microscopio confocale Leica TCS SP5 con tre sorgenti laser compresa Argon 488 nm (per Alexa Fluor 488 e GFP), DPSS 561nm (per Alexa Fluor 568 e Cy3) e HeNe 633nm (per Alexa Fluor 633, Cy5 e To-Pro-3) . </li><li> Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale per evitare o ridurre le interferenze, in cui tutti i coloranti in campioni di doppia o tripla macchiati saranno entusiasti al tempo stesso. Nella modalità di scansione sequenziale, le immagini verranno registrate in ordine sequenziale. </li><li> Altre informazioni relative al coloranti fluorescenti e laser per l'eccitazione può essere fondata in "Microscopia confocale per biologi" di Hibbs (2004) </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Tutto-mount microscopia confocale tripla etichetta immnofluorescence in pelle di topo anteriore al E15.5 con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (Fig. 1A-C, D blu), il marker neurofilamenti 2H3 (Figura 1A verde), e le cellule muscolari lisce marcatore αSMA (Figura 1A, B rossa) ha rivelato un quadro caratteristico di ramificazione di αSMA arterie +, in linea con 2H3 + nervi periferici nella pelle degli arti. Oltre al vaso sanguigno ramificazione, questa skin modello vascolarizzazione degli arti vengono usati per studiare patterning di vasi linfatici branching tramite anticorpi per il marcatore delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 (Figura 1D, E rosso) e Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1D, F verde ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (AC) Arterie allinearsi con i nervi periferici nella pelle degli arti embrionali. Tutto-mount tripla etichetta microscopia confocale immnofluorescence con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (AC, blu), il marker neurofilamenti 2H3 (A, verde), e il buon marker delle cellule muscolari αSMA (A e B, rosso ) viene visualizzato. A E15.5, 2H3 + nervi periferici (frecce aperte) associare arterie (punte di freccia), che sono coperti da αSMA + cellule muscolari lisce. (DF) vasi linfatici nella pelle degli arti embrionali. Triple-label microscopia confocale immnofluorescence con anticorpi pan-marker delle cellule endoteliali PECAM-1 (D, blu), il marker delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 (D ed E, rosso) e Neuropilin2 (NRP2) (D e F, verde ) viene visualizzato. Vasi linfatici sono visualizzate da entrambi LYVE-1 e NRP2, mentre LYVE-1 è espressa anche da un sottoinsieme di macrofagi (punte di freccia aperta). Scala grafica: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema vascolare è fondamentale per lo sviluppo degli organi durante l&#39;embriogenesi, nonché per la manutenzione degli organi e delle funzioni riproduttive negli adulti, in quanto fornisce sufficiente ossigeno e nutrienti agli organi. Adeguata rete vascolare è ben stabilita con processi complessi e multi-passo per l&#39;angiogenesi in cui viene riorganizzato pre-esistente rete capillare di strutture fortemente ramificate e gerarchica. Sebbene numerose opere sono state dimostrato che una varietà di molecole è coin...

Anticorpi Pan-marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Criceto armeno (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> Diluizione 1:100 # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr><tr><td> Collagene IV </td><td> Coniglio (P) </td><td> ABD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> Diluizione 1:300 # 2 </td></tr></tbody></table> Arterioso marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Laboratorio del Kolodkin Alex # 3 </td><td></td><td> Diluizione 1:3000 </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Capra (P) </td><td> R &amp; S </td><td> AF1006 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Venoso marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Capra (P) </td><td> R &amp; S </td><td> AF446 </td><td> Diluizione 1:100 </td></tr></tbody></table> Linfatico marker delle cellule endoteliali <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Capra (P) </td><td> R &amp; S </td><td> AF2727 </td><td> Diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 diluizione </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Criceto siriano (M) </td><td> Ibridomi Banca </td><td> 8.1.1 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Delle cellule muscolari lisce / periciti marcatore <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Mouse (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> Diluizione 1:500 # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Coniglio (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Coniglio (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per giornalista GFP <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Coniglio (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> Diluizione 1:300 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per giornalista LacZ <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Coniglio (P) </td><td> MP Biomedica </td><td> 55976 </td><td> Diluizione 1:5000 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Capra (P) </td><td> ABD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per assoni periferici <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Specie </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Condizione di lavoro </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Mouse (M) # 7 </td><td> Ibridomi Banca </td><td> 2H3 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Mouse (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> Coniglio (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> Diluizione 1:1000 </td></tr></tbody></table> Anticorpi per la migrazione di cellule di Schwann <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Coniglio (P) </td><td> Il laboratorio di Thomas Müller # 9 </td><td></td><td> Diluizione 1:3000 </td></tr></tbody></table> (P): anticorpo policlonale, (M): anticorpo monoclonale # 1: capra anti-armeno criceto-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) anticorpo deve essere usato come anticorpo secondario. # 2: l&#39;anticorpo collagene IV può essere utilizzato per rilevare i vasi sanguigni dopo ibridazione in situ. # 3: L&#39;anticorpo Neuropilin1 è gentilmente fornito da laboratorio del Kolodkin di Alex nella Johns Hopkins University. Pecora anti-umano degli anticorpi Neuropilin1 è disponibile in R &amp; S (AF3870), anche se non l&#39;abbiamo ancora testato. # 4: Il LYVE-1 anticorpi anche rilevare un sottoinsieme dei macrofagi nella pelle embrionale. # 5: L&#39;anti-αSMA anticorpo monoclonale di topo IgG2a. # 6: Il Cy3-anticorpo coniugato αSMA è incubato per 1 ora a temperatura ambiente insieme al secanticorpi secondaria per gli altri anticorpi primari. # 7: 2H3 anticorpo è topo monoclonale IgG1 contro neurofilamenti. # 8: Tuj1 anticorpo è topo IgG2a anticorpi monoclonali contro Neuron specifica classe III beta-tubulina. # 9: (cervello-specifiche di acidi grassi legame con le proteine) BFABP anticorpo è gentilmente fornito da laboratorio del Müller Thomas in Max-Delbrück-Centro di Medicina Molecolare.

con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Tutto-mount analisi immunoistochimica per l&#39;imaging la vascolarizzazione intera è fondamentale per la comprensione dei meccanismi cellulari di ramificazione morfogenesi. Abbiamo sviluppato la pelle modello vascolarizzazione degli arti per lo studio dello sviluppo vascolare in cui viene riorganizzato un preesistente primitivo plesso capillare in una rete ramificata gerarchicamente vascolare. Tutto-mount microscopia confocale con etichettatura più permette l&#39;imaging con robusto dei vasi sanguigni intatti così come i loro componenti cellulari, comprese le cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce, utilizzando specifici marcatori fluorescenti. I progressi in questo modello vascolarizzazione della pelle degli arti con studi genetici hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari di sviluppo vascolare e patterning. La pelle modello vascolarizzazione degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici fornire un modello spaziale per la differenziazione ed il modello delle arterie. In questo articolo video descrive un protocollo semplice e robusto per colorare i vasi sanguigni intatti vascolare con anticorpi specifici e anticorpi secondari fluorescenti, che è applicabile per vascolarizzato organi embrionali dove siamo in grado di seguire il processo di sviluppo vascolare.

Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l&#39;etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

L'analisi immunoistochimica whole-mount per l'imaging dell'intera vascolarizzazione è fondamentale per comprendere i meccanismi cellulari della morfogenesi ramificata. Abbiamo sviluppato il modello della vascolarizzazione della pelle degli arti per studiare lo sviluppo vascolare in cui un plesso capillare primitivo preesistente viene riorganizzato in una rete vascolare ramificata gerarchicamente. La microscopia confocale whole-mount con marcatura multipla consente un imaging robusto di vasi sanguigni intatti cũng come dei loro componenti cellulari, incluse le cellule endoteliali, i periciti e le cellule muscolari lisce, utilizzando marker fluorescenti specifici. I progressi in questo modello di vascolarizzazione della pelle degli arti, integrati con studi genetici, hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari dello sviluppo e del patterning vascolare. Il modello della vascolarizzazione della pelle degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici forniscano un template spaziale per la differenziazione e il patterning delle arterie. Questo video-articolo descrive un protocollo semplice e robusto per colorare vasi sanguigni intatti con anticorpi specifici per il sistema vascolare e anticorpi secondari fluorescenti, applicabile agli organi embrionali vascolarizzati in cui è possibile seguire il processo di sviluppo vascolare.

L'obiettivo generale di questo procedimento è eseguire un'analisi immunohistochimica in montaggio intero per l'immagine dell'intera vascolarizzazione nella cute in via di sviluppo degli arti. Questo viene realizzato innanzitutto tagliando quattro arti dall'embrione, fissando i quattro arti in paraformaldeide al 4% in PBS e quindi disidratandoli in metanolo al 100%. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare pinzette fini per staccare la cute alla base dell'arto.Seguire le linee tratteggiate blu e staccare la pelle in una piastra contenente metanolo al 100%. Rimuovere la pelle dall'arto. Successivamente, viene eseguita la colorazione immunohistochimica con anticorpi primari specifici per i vasi sanguigni e anticorpi secondari fluorescenti sulla pelle dell'arto.Infine, la microscopia confocale su preparati interi con marcatura multipla permetterà un'analisi robusta dell'intera vascolarizzazione della cute delarto, vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'analisi istologica del conteggio incrociato. L'utilizzo di sezioni embrionali è che l'analisi immunohistochimica su preparati interi della vascolarizzazione della cute delarto ci consente non solo di visualizzare l'intera rete vascolare, inclusi i componenti cellulari, ma anche di studiare i processi di differenziamento e il patterning delle cellule dei vasi sanguigni e la ramificazione dei vasi linfatici. Stiamo dimostrando la procedura insieme a winding DA, ricercatrice postdottorato del mio laboratorio; le cute degli arti embrionali vengono raccolte da topi femmina incinta.Dopo aver rimosso e lavato l'utero, lavorare sotto un microscopio stereoscopico per separare e dissezionare gli embrioni. Una volta dissezionati gli embrioni, il passaggio successivo consiste nel rimuovere i quattro arti dagli embrioni utilizzando pinzette fini. Tagliare i quattro arti a livello della spalla, quindi utilizzare una pinza ad anello per trasferire i quattro arti in una piastra a 24 pozzetti contenente ghiaccio.Aggiungere 2 ml di paraformaldeide al 4% fredda e fresca in PBS, posizionando due arti per pozzetta. Fissare gli arti a 4 °C durante la notte con mescolamento delicato su un agitatore. Il giorno seguente, rimuovere la PFA da ogni pozzetta e aggiungere 2 ml di PBS.Lavare i campioni per cinque minuti con miscelazione delicata sul mixer a movimento rotatorio a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio due volte per un totale di tre lavaggi. Successivamente, trasferire le quattro zampe in un tubo conico in polipropilene da cinque millilitri contenente metanolo al 100% e conservare a meno 20 gradi Celsius in un congelatore enzimatico con controllo critico della temperatura e senza funzione di sbrinamento automatico. Dopo il periodo di conservazione notturno a meno 20, la pelle può essere rimossa dal tessuto sottostante.Questo è uno degli aspetti più critici di questa procedura, poiché il successo delle successive colorazioni e analisi dipende dalla non danneggiamento delle pelli. La pelle degli arti si stacca facilmente dall'arto quando viene disidratata in questo modo, permettendo di rimuovere la pelle dai quattro arti. Posizionare innanzitutto l'arto con il lato ventrale rivolto verso l'alto.Quindi, utilizzando pinzette fini, effettuare una dissezione attraverso la cute vicino alla base dell'arto verso la zampa in linea retta. Successivamente, dissezionare intorno all'intero arto, staccando la pelle mentre si ruota l'arto. Una volta che le pelli sono state rimosse.I quattro arti iniziano la colorazione immunohistochimica in toto delle pelli degli arti da preparare in anticipo. Preparare tre provette da 50 millilitri con metanolo al 75%, 50% e 25% in PBT per la reidratazione. Le pelli, ovvero le pelli degli arti, vengono reidratate mediante incubazione attraverso una serie graduata di metanolo, partendo dalle concentrazioni più elevate fino a quelle più basse, per cinque minuti ciascuna.Per iniziare, trasferire la cute dell'arto in una provetta rotonda in polipropilene da cinque millilitri contenente metanolo al 75% in PBT. Dopo cinque minuti sul mixer agitatore, aspirare con attenzione il metanolo al 75% e riempire nuovamente con metanolo al 50% e PBT. Cinque minuti dopo.Sostituire il 50% di metanolo con metanolo al 25% e PBT. Alla fine dell'incubazione finale, aspirare con attenzione il PBT con metanolo al 25% e ricomporre con PBT.Lavare le pelli degli arti per cinque minuti con miscelazione delicata sul mixer mutatore a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio una volta. Avere cura di evitare di danneggiare le pelli degli arti durante il cambio delle soluzioni.Dopo aver riidratato le pelli degli arti, bloccarle con il relativo tampone di blocco. Incubare per due ore con mescolamento delicato sul mixer a nutator a temperatura ambiente. Trascorse due ore, posizionare le pelli degli arti in una piastra Petri da 35 per 10 millimetri. Successivamente, utilizzare pinze ad anello per trasferire le pelli in un tubo fuge da 2 millilitri contenente 800 microlitri di anticorpi primari diluiti nel relativo tampone di blocco.Qui, è possibile utilizzare contemporaneamente diversi anticorpi primari derivati da specie differenti. Incubare le pelli degli arti con mescolamento delicato sul mixer mutatore a quattro gradi Celsius durante la notte; il giorno seguente, posizionare le pelli degli arti in una piastra di Petri da 35 per 10 millimetri. Trasferire le pelli in un tubo in polipropilene da cinque millilitri con fondo rotondo contenente quattro litri del tampone di lavaggio appropriato.Lavare cinque volte per 15 minuti ciascuno con miscelazione delicata sul mixer a movimentazione casuale a temperatura ambiente. Sostituire con attenzione il tampone usato con tampone fresco per ogni lavaggio durante le operazioni di lavaggio. Preparare gli anticorpi secondari per rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari.Utilizzare un filtro a siringa con membrana in PVDF da 0,22 micron per filtrare la soluzione dell'anticorpo secondario in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare il campione filtrato a 15.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere particelle e bolle d'aria. Raccogliere la soluzione di anticorpo filtrata in una microprovetta da due millilitri.Una volta completati i cinque lavaggi, posizionare le pelli degli arti su una piastra di Petri da 35 per 10 millimetri e trasferirle in un tubo microcentrifuga da due litri contenente 800 microlitri di anticorpi secondari nel buffer di blocco. Diversi anticorpi secondari coniugati con fluorocromi, ottenuti da specie diverse, possono essere utilizzati contemporaneamente in questo passaggio. Incubare gli arti e le pelli al buio per un'ora con mescolamento delicato sul mixer mutatore a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione di un'ora, posizionare le pelli degli arti su una piastra di Petri da 35 per 10 millimetri e trasferirle in un tubo con fondo rotondo in polipropilene da cinque millilitri contenente quattro millilitri del tampone di lavaggio appropriato. Lavare cinque volte per 15 minuti ciascuno al buio, con miscelazione delicata sul mixer Tator a temperatura ambiente, per l'analisi mediante microscopia confocale. Le pelli degli arti devono essere montate su un vetrino dopo la colorazione immunohistochimica.Per iniziare questa procedura, posizionare le pelli degli arti colorate su una piastra di Petri di 35 per 10 millimetri, lavorando al microscopio stereoscopico con illuminazione bassa. Per evitare un'eccessiva fotodegradazione, utilizzare pinzette fini per rimuovere i cristalli di polvere e le fibre dallo strato interno delle pelli. Trasferire le pelli degli arti su un vetrino adesivo per microscopia.Posizionare le pelli con il lato interno rivolto verso l'alto sul vetrino, in modo che sia rivolto verso il coprioggetto. Quindi appiattire con cura le pelli utilizzando pinzette fini. Rimuovere il tampone di lavaggio residuo con un fazzoletto di carta Kim.Aggiungere il mezzo di montaggio Antifa alle pelli e posizionare un coprioggetto di 25 per 25 su ciascun campione. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria e lasciare indurire su una superficie piana al buio a temperatura ambiente per la conservazione a lungo termine dei campioni. Sigillare il coprioggetto al vetrino con smalto per unghie e conservare a quattro gradi Celsius.Il patterning di nervi e vasi sanguigni nel topo per la cute degli arti a E 15,5 è mostrato da questi risultati rappresentativi di microscopia a fluorescenza confocale su preparato intero con triplice marcatura: l'immunofluorescenza per il marcatore pan-endoteliale pcam appare in blu. Il marcatore per neurofilamenti due H tre è verde, e il marcatore per cellule muscolari lisce alfa SMA è rosso. Queste immagini rivelano un pattern di ramificazione caratteristico delle arterie positive per alfa SMA, indicato dalla freccia bianca, allineate con i nervi periferici positivi per due H tre, indicati da frecce vuote, oltre alla ramificazione dei vasi sanguigni.Questo modello di vascolarizzazione della cute delarto può inoltre rivelare il patterning della ramificazione dei vasi linfatici utilizzando il marcatore delle cellule endoteliali linfatiche LYVE-1 mostrato in rosso e NRP-2 mostrato in verde; i vasi linfatici sono visualizzati sia mediante LYVE-1 che NRP-2, mentre LYVE-1 è espressa anche da un sottoinsieme di macrofagi indicati dalle teste di freccia aperte. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia vascolare per esplorare i complessi processi di patterning e differenziazione della vascolarizzazione durante lo sviluppo tissutale, la riparazione dei tessuti e in condizioni patologiche.

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