Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di scoprire e identificare i partner del DNA associati a lungo raggio. Ciò si ottiene mediante fissazione, lisi cellulare e digestione del DNA mediante il primo enzima di restrizione seguito dalla legatura per creare un DNA chimerico composto da segmenti dei due geni associati. Successivamente i linker vengono aggiunti al DNA chimerico dopo la seconda digestione di restrizione Per facilitarne l'amplificazione, l'amplificazione PCR viene quindi eseguita utilizzando primer specifici per DNA linker ed esca al fine di ottenere quantità sufficienti dei frammenti di DNA associati Si ottengono risultati che mostrano i partner del DNA associati a lungo raggio con il DNA esca sulla base dell'analisi della sequenza dei frammenti di DNA amplificati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la cattura di conferma cromosomica o le tre C, è che A-C-T-S-A può essere utilizzato per identificare efficacemente un partner di DNA associato a lungo raggio sconosciuto. Mentre tre C sono emerse per la verifica solo di interazioni precedentemente sospette. Per iniziare questa coltura protocollare, le cellule umane in un incubatore hanno fornito il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino a raggiungere l'80-90% di confluenza.

Per questa dimostrazione vengono utilizzate cellule di leucemia acida umana prom. Raccogliere le cellule versandole in una provetta NOC da 50 millilitri e centrifugare a 1200 RPM per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il fluido mediante aspirazione.

Aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura per risospendere i pellet cellulari. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, prelevare circa una volta 10 alla settima cellula fino a un volume di 40 millilitri con RPMI 1640, terreno contenente il 10% di FBS. Quindi aggiungere 1,7 millilitri di formaldeide al 37% per fissare la cromatina diluita.

Incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti agitando delicatamente. Dopo l'incubazione, spegnere la reazione con 2,4 millilitri di glicina a due molari. Quindi, centrifugare il campione per 15 minuti a 1200 giri/min e quattro gradi Celsius.

Dopo aver rimosso la super natina, lavare il pellet una volta con 40 millilitri di PBS ghiacciato, quindi centrifugare il campione per recuperare il pellet di cella lavato, risospendere il pellet risultante in 40 millilitri di tampone di lisi ghiacciato con inibitori della proteasi appena aggiunti e PMSF 0,1 millimolare, incubare il campione in una cella frigorifera con rotazione per 90 minuti. Infine, centrifugare il campione a 2.500 RPM per 15 minuti e rimuovere la super natina e ottenere i nuclei isolati. Risospendere i nuclei in 0,5 millilitri di un tampone XNEB tre e aggiungere 15 microlitri di SDS al 10%.

Incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora agitandolo. Quindi aggiungere 45 microlitri di Triton X 100 al 20% per sequestrare la SDS e incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione e aliquote di una volta 10 alla sesta. I nuclei, ovvero circa 15 microgrammi, vengono utilizzati per la digestione enzimatica di restrizione a 55 microlitri di soluzione di nuclei.

Aggiungere 433 microlitri di un tampone XNEB tre e 12 microlitri di BGL due. Per ottenere un volume totale di reazione digestiva di 500 litri, incubare la reazione a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo inattivare l'enzima di restrizione aggiungendo 95 microlitri di SDS al 10% e denaturare l'enzima riscaldandolo a 65 gradi Celsius per 20 minuti.

A bagnomaria, aggiungere sette millilitri di un tampone di legatura x e 360 microlitri di Triton X 100 al 20%. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora. Abbassare la temperatura a 16 gradi Celsius e aggiungere 50 microlitri da 400 unità per microlitro.

T quattro DNA ligasi. Lasciare incubare la reazione di legatura a 16 gradi Celsius per quattro ore e poi a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine della legatura, aggiungere 300 microgrammi di proteinasi K e incubare a 65 gradi Celsius per una notte.

Quindi aggiungere cinque microgrammi di RNAA e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Purificare il DNA mediante estrazione di fenolo, cloroformio e precipitare il DNA in isopropanolo, sciogliere il DNA precipitato in 150 microlitri di acqua distillata sterile. Per aggiungere linker al DNA chimerico, prima digerire il DNA incubando due microgrammi di DNA purificato con cinque unità di msp, uno a 37 gradi Celsius per quattro-sei ore dopo la digestione, inattivare l'MSP uno a 65 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi precipitare il DNA in etanolo con un microlitro di cinque milligrammi per millilitro. Il glicogeno dissolve il DNA del palato risultante in 50 microlitri di acqua distillata sterile. Successivamente, mescolare 50 microlitri di MSP, un DNA trattato con due microlitri di un oligonucleotide L linker da 20 micromolari e un microlitro di un oligonucleotide S da 20 micromolari, quindi aggiungere un microlitro di acqua distillata sterile e sei microlitri di tampone 10 XT a quattro DNA ligasi.

Coprire il composto con cera liquida. Denaturare gli oligonucleotidi a 50 gradi Celsius per un minuto e lasciarli raffreddare gradualmente fino a 10 gradi Celsius con un gradiente di 0,5 gradi Celsius al minuto. Utilizzando un termociclatore, aggiungere un microlitro di 400 unità per microlitro di T quattro DNA ligasi e incubare la reazione a 15 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo purificare il DNA legato al linker utilizzando un kit di purificazione rapida kaya PCR ed eluire in 50 microlitri di acqua distillata sterile. Scegliere un primer per la regione specifica del DNA da studiare per le interazioni a lungo raggio. In questo esempio, Abel sarà usato come innesco o esca.

Preparare il DNA purificato per il primo ciclo di PCR combinando un microlitro di DNA purificato con un microlitro di 20 micromolari in grado di un primer specifico, 46 56, e un microlitro di 20 primer specifico per linker micromolari 29 63. Quindi aggiungere tre microlitri di tre cocktail di ClinTech, DNA polimerasi che è stato precedentemente miscelato con 32 P-D-C-T-P secondo il protocollo scritto, seguito da tre microlitri di acqua distillata sterile. Eseguire l'amplificazione della PCR utilizzando il ciclo termico di PCR con avvio a caldo descritto nel protocollo scritto al termine del ciclo di PCR.

Purificare i prodotti PCR del primo ciclo utilizzando un kit di purificazione PCR rapida kaya Eluire in 30 microlitri di acqua distillata sterile. Utilizzare un microlitro del primo prodotto PCR diluito 100 volte per eseguire un secondo ciclo di PCR utilizzando primer nidificati aggiungendo un microlitro di 20 micromolari in grado di un primer specifico, 46 26 e un microlitro di 20 primer specifico per linker micromolari. 29 61.

Ancora una volta, aggiungi tre microlitri di tre x ClinTech, DNA polimerasi, un cocktail e tre microlitri di acqua distillata sterile. Eseguire il secondo ciclo di PCR utilizzando un programma di cicli termici di 25 cicli a 95 gradi Celsius per 20 secondi. 67 gradi Celsius per 40 secondi e 72 gradi Celsius per un minuto, seguiti da un'estensione a 72 gradi Celsius per cinque minuti.

Visualizzate i prodotti PCR eseguendo un gel di pagina al 5% di urea e quindi scansionando lo schermo esposto in un imager fosfo. Ogni banda PCR può essere riciclata dal gel sciogliendo le strisce di gel in una provetta einor contenente 60 microlitri di acqua distillata sterile e incubando a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifuga. I prodotti in gel disciolto si alternano brevemente a 10.000 giri/min per 10 secondi.

Per raccogliere tutti i campioni. Rimuovere un microlitro da utilizzare come modello di DNA per eseguire la PCR con la riparazione principale. 29 61 46 26.

Utilizzando le stesse condizioni sopra descritte, dopo la purificazione e il sequenziamento è possibile eseguire l'analisi con uno strumento online per determinare la posizione cromosomica. Una volta sul sito di bioinformatica del genoma, fai clic su blatt per generare una nuova finestra e incollare la sequenza del DNA. Dopo aver inviato la sequenza di DNA, appariranno i risultati della ricerca BLATT.

Fare clic sul browser sul colpo con 100%identity per rivelare la posizione della sequenza di DNA. La regione in grado è stata utilizzata come esca per determinare le sue interazioni con il DNA a lungo raggio. Due BGL, due siti e un BAM H, un sito è stato scelto per il test A CT nel secondo ciclo di primer PCR, 46, 26, 29, 61 è stato utilizzato per amplificare l'abile M1, 46,30, 29, 61 è stato utilizzato per l'abile M due e 46, 36, 29, 61 è stato utilizzato per l'abile M tre.

Un tipico modello di gel rivela da una a diverse bande, come mostrato qui per l'abile M1, l'abile M due e l'abile M tre qui. La sequenza di DNA di M1 clonabile dimostra che ogni frammento di un saggio A CT è costituito da due segmenti di DNA combinati. Un segmento è derivato dalla regione del DNA dell'esca, mentre il secondo segmento proviene dal partner associato.

I segmenti sono uniti tra loro dalla prima sequenza di riconoscimento dell'enzima di restrizione. La seconda sequenza di riconoscimento enzimatico apparirà alla fine della sequenza del partner associato. Il frammento M1 clonato contiene DNA dalla regione di ABLE 1 situata sul cromosoma nove Q 32.4, e il partner associato si trova sul cromosoma tre P tre, che è stato identificato come proc due.

Allo stesso modo, il partner associato all'abilità M 2 è stato localizzato sul cromosoma cinque Q 21.1 mentre il clone in grado M 3 è stato identificato come un'associazione intracromosomica vicino al locus ABLE one in contrasto con tre saggi C. La metodologia delineata in questo video selezionerà le interazioni a lungo raggio più diffuse. Tuttavia, aumentando il numero di cicli di PCR R, è possibile identificare ulteriori associazioni meno frequenti utilizzando la regione di imprinting e controllo o ICR presso il locus IGF due H 19 come DNA esca in cellule di fibroblasti di topo, diversi programmi di ciclo sono stati applicati nel primo e nel secondo ciclo di PCR nel test A CT.

Il test A CT può essere utilizzato anche per identificare le differenze nell'architettura nucleare e le interazioni a lungo raggio tra cellule normali e cellule tumorali. Il tessuto normale del colon e il tessuto tumorale del colon sono stati omogeneizzati e il test A CT è stato eseguito seguendo le procedure qui descritte. Qui è mostrata la struttura del DNA della regione ICR al locus IGF due H 19 e al gene IGF due dpn.

Due siti per il test A CT sono etichettati: i primer utilizzati nel secondo ciclo di PCR sono etichettati da frecce e numeri in colori diversi. Il modello su gel del test A CT rappresenta i risultati della PCR utilizzando il primer 29 61 con una delle coppie di primer 41, 61, 41 63, 51 45 e 51 51. Le bande uniche che appaiono solo nel normale tessuto del colon sono etichettate da frecce gialle e quelle bande che sono apparse solo nel tessuto del cancro del colon sono etichettate in frecce rosse Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia di mercato per esplorare l'architettura nucleare e la regolazione genica in modo tridimensionale.