Cromosoma Trappola associate per identificare interazioni a lungo raggio del DNA

L'obiettivo generale del seguente esperimento è scoprire e identificare partner di DNA associati a lungo raggio. Questo viene ottenuto mediante fissazione, lisi cellulare e digestione del DNA con il primo enzima di restrizione, seguita da una ligazione per creare un DNA chimera composto da segmenti dei due geni associati. Successivamente, dopo la seconda digestione di restrizione, vengono aggiunti dei linker al DNA chimera per facilitarne l'amplificazione; quindi si effettua l'amplificazione mediante PCR utilizzando primer specifici per il linker e per il DNA esca, al fine di ottenere quantità sufficienti dei frammenti di DNA associati. I risultati ottenuti mostrano i partner di DNA associati a lungo raggio rispetto al DNA esca, in base all'analisi delle sequenze dei frammenti di DNA amplificati.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il chromosome conformation capture o il three C è che A-C-T-S-A può essere utilizzato per identificare in modo efficace un partner del DNA associato a lungo raggio sconosciuto. Al contrario, il three C è stato sviluppato per la verifica di interazioni precedentemente sospettate. Per iniziare questo protocollo, coltivare cellule umane in un incubatore con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino a quando non raggiungono una confluenza dell'80-90%.

Per questa dimostrazione vengono utilizzate cellule di leucemia promielocitica acuta umana. Raccogliere le cellule versandole in un tubo NOC da 50 millilitri e centrifugare a 1200 giri al minuto per 15 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere il mezzo per aspirazione.

Aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura per risospendere i pellet cellulari. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, prelevare circa un milione di cellule e portarle a un volume di 40 millilitri con RPMI 1640, mezzo contenente FBS al 10%. Quindi aggiungere 1,7 millilitri di formaldeide al 37% per fissare la cromatina diluita.

Incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti con agitazione delicata. Al termine dell'incubazione, bloccare la reazione con 2,4 millilitri di glicina due molar. Successivamente, centrifugare il campione per 15 minuti a 1200 giri al minuto e a quattro gradi Celsius.

Dopo aver rimosso il surnatante, lavare il pellet una volta con 40 millilitri di PBS freddo di ghiaccio, quindi centrifugare il campione per recuperare il pellet cellulare lavato. Risospendere il pellet ottenuto in 40 millilitri di tampone di lisi freddo di ghiaccio contenente inibitori delle proteasi appena aggiunti e PMSF 0,1 millimolare. Incubare il campione in una stanza fredda con rotazione per 90 minuti. Infine, centrifugare il campione a 2.500 giri al minuto per 15 minuti, rimuovere il surnatante ed ottenere i nuclei isolati. Risospendere i nuclei in 0,5 millilitri di tampone NEB 1X e aggiungere 15 microlitri di SDS al 10%.

Incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione. Quindi aggiungere 45 microlitri di Triton X-100 al 20% per sequestrare l'SDS e incubare nuovamente a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione e un'aliquote pari a uno per 10 alla sesta. I nuclei, pari a circa 15 microgrammi, vengono utilizzati per la digestione con enzimi di restrizione in 55 microlitri di soluzione nucleare.

Aggiungere 433 microlitri di un buffer XNEB tre e 12 microlitri di BGL due. Per ottenere un volume totale di reazione di digestione di 500 microlitri, incubare la reazione a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, inattivare l'enzima di restrizione aggiungendo 95 microlitri di SDS al 10% e denaturare l'enzima riscaldando a 65 gradi Celsius per 20 minuti.

In un bagno d'acqua, aggiungere sette millilitri di buffer di ligazione 1x e 360 microlitri di Triton X-100 al 20%. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per un'ora. Abbassare la temperatura a 16 gradi Celsius e aggiungere 50 microlitri di 400 unità per microlitro.

T quattro DNA ligasi. Lasciare incubare la reazione di ligazione a 16 gradi Celsius per quattro ore, quindi a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine della ligazione, aggiungere 300 microgrammi di proteinasi K e incubare a 65 gradi Celsius per tutta la notte.

Quindi aggiungere cinque microgrammi di RNAA e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Purificare il DNA mediante estrazione con fenolo-cloroformio e precipitare il DNA in isopropanolo; sciogliere il DNA precipitato in 150 microlitri di acqua distillata sterile. Per aggiungere linker al DNA chimera, digerire innanzitutto il DNA incubando due microgrammi di DNA purificato con cinque unità di msp, una a 37 gradi Celsius per quattro-sei ore; al termine della digestione, inattivare MSP a 65 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi precipitare il DNA in etanolo con un microlitro di glicogeno al cinque milligrammi per millilitro. Sciogliere il pellet di DNA risultante in 50 microlitri di acqua distillata sterile. Successivamente, mescolare 50 microlitri di DNA trattato con MSP1 con due microlitri di un oligonucleotide linker (L) di 20 micromolare e un microlitro di un oligonucleotide (S) di 20 micromolare, quindi aggiungere un microlitro di acqua distillata sterile e sei microlitri di buffer 10X per DNA Ligasi T4.

Coprire la miscela con cera liquida. Denaturare gli oligonucleotidi a 50 gradi Celsius per un minuto e lasciare raffreddare gradualmente fino a 10 gradi Celsius con un gradiente di 0,5 gradi Celsius al minuto. Utilizzando un termociclatore, aggiungere un microlitro di ligasi del DNA T4 a 400 unità per microlitro e incubare la reazione a 15 gradi Celsius per tutta la notte.

Il giorno successivo, purificare il DNA legato al linker utilizzando un kit di purificazione PCR rapida kaya ed eluire in 50 microlitri di acqua distillata sterile. Quindi scegliere un primer per la regione specifica di DNA da analizzare per le interazioni a lungo raggio. In questo esempio, Abel verrà utilizzato come primer o come esca.

Preparare il DNA purificato per la prima reazione di PCR unendo un microlitro di DNA purificato a un microlitro di primer specifico per l'allele uno (20 micromolare), 46 56, e un microlitro di primer specifico per il linker (20 micromolare), 29 63. Aggiungere quindi tre microlitri di tre x ClinTech, un cocktail di DNA polimerasi precedentemente miscelato con 32 P-D-C-T-P secondo il protocollo scritto, seguito da tre microlitri di acqua distillata sterile. Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando il ciclo termico PCR con partenza a caldo descritto nel protocollo scritto dopo il completamento del ciclo PCR.

Purificare i prodotti della prima PCR utilizzando un kit di purificazione rapida per PCR Kaya, eluendo in 30 microlitri di acqua distillata sterile. Utilizzare un microlitro del prodotto della prima PCR diluito 100 volte per eseguire un secondo ciclo di PCR usando primer nidificati, aggiungendo un microlitro di primer specifico per l'allele 1 da 20 micromolare, 46 26, e un microlitro di primer specifico per il linker da 20 micromolare, 29 61.

Aggiungere nuovamente tre microlitri di tre x ClinTech, DNA polimerasi, un cocktail e tre microlitri di acqua distillata sterile. Eseguire il secondo round di PCR utilizzando un programma di termociclaggio di 25 cicli a 95 gradi Celsius per 20 secondi, 67 gradi Celsius per 40 secondi e 72 gradi Celsius per un minuto, seguito da un'estensione a 72 gradi Celsius per cinque minuti.

Visualizzare i prodotti della PCR eseguendo un gel PAGE all'urea al 5% e quindi scansionando lo schermo esposto in un fospoimager. Ogni banda di PCR può essere recuperata dal gel sciogliendo le strisce di gel in un eppendorf contenente 60 microlitri di acqua distillata sterile e incubando a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare brevemente i prodotti di gel sciolti a 10.000 giri/min per 10 secondi.

Per raccogliere tutti i campioni. Rimuovere un microlitro da utilizzare come stampo di DNA per eseguire la PCR con il repair prime. 29 61 46 26.

Utilizzando le stesse condizioni descritte in precedenza, dopo la purificazione, è possibile eseguire l'analisi del sequenziamento mediante uno strumento online per determinare la localizzazione cromosomica. Una volta raggiunto il sito di bioinformatica genomica, fare clic su blatt per generare una nuova finestra e incollare la sequenza di DNA. Dopo aver inviato la sequenza di DNA, verranno visualizzati i risultati della ricerca BLATT.

Fare clic sul risultato nel browser con identità del 100% per rivelare la posizione della sequenza di DNA. La regione able one è stata utilizzata come esca per determinare le sue interazioni di DNA a lungo raggio. Due siti BGL two e un sito BAM H one sono stati scelti per il saggio A CT nel secondo round del set di primer per PCR: il primer 46 26 29 61 è stato utilizzato per amplificare able M1, il primer 46 30 29 61 per able M two e il primer 46 36 29 61 per able M three.

Un tipico profilo elettroforetico rivela una o più bande, come mostrato qui per able M1, able M2 e able M3. La sequenza di DNA del clone able M1 è riportata per dimostrare che ogni frammento ottenuto da un saggio A CT è costituito da due segmenti di DNA combinati. Un segmento deriva dalla regione di DNA esca, mentre il secondo proviene dal partner associato.

I segmenti sono uniti l'uno all'altro tramite la prima sequenza di riconoscimento dell'enzima di restrizione. La sequenza di riconoscimento del secondo enzima apparirà alla fine della sequenza del partner associato. Il frammento M1 clonabile contiene DNA della regione di ABLE uno localizzata sul cromosoma nove Q 32.4, e il partner associato si trova sul cromosoma tre P tre, che è stato identificato come proc due.

Allo stesso modo, il partner associato abile M due è stato localizzato sul cromosoma cinque Q 21.1, mentre il clone abile M tre è stato identificato come un'associazione intracromosomica vicino al locus ABLE uno, a differenza dei saggi tre C. La metodologia descritta in questo video selezionerà le interazioni a lungo raggio più prevalenti. Tuttavia, aumentando il numero di cicli PCR R, è possibile identificare anche ulteriori associazioni meno frequenti, utilizzando la regione di imprinting e di controllo o ICR al locus IGF due H 19 come DNA esca in cellule di fibroblasti murini; sono stati applicati diversi programmi di ciclatura nel primo e nel secondo round di PCR nel saggio A CT.

L'assay A CT può essere utilizzato anche per identificare differenze nell'architettura nucleare e nelle interazioni a lungo raggio tra cellule normali e cellule tumorali. Tessuto colonnare normale e tessuto di cancro del colon sono stati omogeneizzati ed è stato eseguito l'assay A CT seguendo le procedure descritte in questo documento. Qui viene mostrata la struttura del DNA della regione ICR nel locus IGF two H 19 e del gene IGF two dpn.

Due siti per il saggio A CT sono etichettati; i primer utilizzati nella PCR del secondo round sono indicati da frecce e numeri in diversi colori. Il profilo elettroforetico del saggio A CT rappresenta i risultati della PCR ottenuti utilizzando il primer 29 61 con ciascuna delle coppie di primer 41 61, 41 63, 51 45 e 51 51. Le bande uniche che compaiono esclusivamente nel tessuto colonnare normale sono indicate da frecce gialle, mentre quelle presenti soltanto nel tessuto di cancro del colon sono indicate da frecce rosse dopo lo sviluppo.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia del mercato per esplorare l'architettura nucleare e la regolazione genica in maniera tridimensionale.