In Vivo saggio canina funzione muscolare

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare e caratterizzare le proprietà meccaniche dei muscoli dell'arto posteriore nel cane in vita, utilizzando metodi non invasivi. Questo viene raggiunto posizionando innanzitutto correttamente il cane nel sistema fisiologico. Il secondo passaggio della procedura consiste nel misurare e registrare la coppia isometrica del singolo stimolo e la coppia massimale della flessione tibio-tarsale.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eseguire contrazioni eccentriche. L'ultimo passaggio della procedura è misurare e registrare il tremore isometrico, la coppia e la coppia tetanica durante l'estensione tibio-tarsale. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la forza muscolare dell'arto posteriore e la risposta a contrazioni eccentriche ripetute mediante un metodo fisiologico non invasivo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi su muscoli isolati ex vivo, che sono studi terminali, è che il metodo qui utilizzato può essere ripetuto nel tempo poiché è non invasivo e ben tollerato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia muscolare, come la risposta del muscolo a lesioni indotte dalla contrazione o alla fatica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi delle distrofie muscolari, poiché il metodo misura la funzione muscolare in cani o altri mammiferi di grandi dimensioni.

Sono necessari animali di grandi dimensioni negli studi preclinici di molte nuove terapie prima dei trial clinici e dell'applicazione su pazienti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui modelli canini, può essere applicato anche ad altri sistemi di modelli animali, come le scimmie non umane. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della precisione richiesta nel posizionare gli elettrodi di stimolazione e della conoscenza necessaria per interpretare correttamente i tracciati della coppia. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi relativi al posizionamento degli elettrodi sono difficili da apprendere a causa della precisione necessaria per ottenere la risposta massima di coppia dai muscoli.

In studio vengono utilizzati due protocolli scritti nel software di controllo muscolare dinamico o DMC per definire i parametri di stimolazione e di registrazione dei dati. Il primo protocollo, il protocollo di contrazione isometrica, viene utilizzato sia per le contrazioni a scatto che per quelle tetaniche. Il secondo protocollo, chiamato protocollo di lesione da stiramento eccentrico, viene utilizzato per le contrazioni eccentriche; le impostazioni dello stimolatore e le sequenze software utilizzate per ciascun protocollo sono riportate nella tabella mostrata qui; le contrazioni a scatto vengono elicitate con una stimolazione di un hertz.

Le contrazioni tetaniche ed eccentriche sono provocate mediante stimolazione a 50 hertz. Nel caso della contrazione eccentrica, viene sovrapposta una stiramento al muscolo in contrazione. Questi esperimenti prevedono l'induzione di diversi tipi di contrazioni muscolari, stimolando il nervo peroneo per ottenere contrazioni di tipo scatto, tetaniche o eccentriche di un muscolo flessore, e stimolando il nervo tibiale per ottenere contrazioni di tipo scatto o tetaniche di un muscolo estensore.

Dopo aver anestetizzato il cane, verificare il riflesso palpebrale per assicurarsi che l'animale sia profondamente anestetizzato. Monitorare attentamente l'anidride carbonica, l'ossimetria del polso e la temperatura. Durante la procedura, rasare i peli sul ginocchio laterale dove verranno posizionati gli elettrodi stimolanti.

Successivamente, posizionare il cane sul tavolo di fisiologia. Porre l’arto pelvico in posizione decubito dorsale in modo che femore e tibia formino un angolo retto e che la tibia sia parallela al piano del tavolo; verificare che il pedale della forza possa ruotare in sicurezza. Deve risultare rigido quando viene mosso manualmente.

Successivamente, accendere l'apparato fisiologico e attivare il pedale. Il movimento del pedale è controllato da un motore servo, che a sua volta è controllato dal computer. Ora, appoggiare delicatamente la zampa del cane sul misuratore del pedale e registrare la lunghezza della zampa del cane dall'asse centrale di rotazione fino all'estremità del dito laterale.

Quindi fissare la zampa del cane sul pedale con una fascia elastica autoadesiva. Il trasduttore nel pedale registra la forza delle contrazioni muscolari delle zampe. Configurare gli elettrodi di stimolazione collegando gli elettrodi monopolari schermati da 24 gauge all'unità di isolamento dello stimolo.

Con le mani guantate, pulire la cute del cane con alcol e palpare il nervo peroneo comune appena distale alla testa prossimale della fibula, utilizzando un dito per segnare l'area del nervo; inserire con attenzione l'elettrodo catodico nero sotto la cute e appena esterno al periostio, quindi posizionare l'elettrodo anodico rosso sotto la cute in posizione parallela e leggermente distale rispetto all'elettrodo catodico. Entrambi gli elettrodi dovranno trovarsi internamente al nervo peroneo comune, appena distali alla testa della fibula. Successivamente, attivare lo stimolatore a un hertz e osservare la risposta di contrazione sul monitor.

Eseguire piccoli aggiustamenti nella posizione degli elettrodi, se necessario, per ottenere l'ampiezza massima possibile del singolo tremito muscolare. Una volta che gli elettrodi sono posizionati correttamente, attivare il software DMC per registrare la risposta del singolo tremito. Il passaggio successivo consiste nell'indurre una contrazione tetanica senza spostare gli elettrodi.

Impostare lo stimolatore come specificato nella tabella per una contrazione tetanica. Quindi attivare il protocollo di contrazione isometrica nel software per generare una contrazione tetanica isometrica del muscolo. Il successivo esperimento, il protocollo di lesione da stiramento eccentrico, viene eseguito anch'esso senza spostare gli elettrodi.

Impostare lo stimolatore per una contrazione eccentrica e avviare la stimolazione. In questo protocollo, il nervo viene stimolato 10 volte a 50 hertz per un secondo. Durante quell'unico secondo, i muscoli flessori contraggono isometricamente per i primi 800 millisecondi, quindi il muscolo viene stirato negli ultimi 200 millisecondi.

Dopo un insieme di 10 contrazioni eccentriche, lasciare riposare il muscolo per quattro minuti. Quindi ripetere il protocollo di lesione da stiramento eccentrico altre due volte, con un intervallo di riposo di quattro minuti tra ogni serie per stimolare il muscolo estensore; spostare gli elettrodi sul nervo tibiale inserendo gli elettrodi perpendicolarmente alla pelle e in posizione prossimale rispetto al posizionamento originale utilizzato per la flessione. Il punto approssimativo di posizionamento si trova lungo una linea che biseca l'angolo di 90 gradi formato dal ginocchio.

Il nervo tibiale si trova più in profondità e medialmente rispetto al nervo peroniero comune. Spostare gli elettrodi secondo necessità per ottenere i potenziali di scatto ottimali. Una volta posizionati gli elettrodi, evocare uno scatto massimale utilizzando il protocollo isometrico senza spostare gli elettrodi.

Modificare le impostazioni dello stimolatore come specificato per le contrazioni tetaniche. Quindi attivare e registrare una contrazione tetanica del muscolo estensore tibio-tarsale. Il programma di analisi muscolare dinamica (DMA) viene utilizzato per analizzare la coppia e le informazioni temporali relative alle contrazioni muscolari.

In questa figura, la stimolazione del nervo tibiale a un hertz ha attivato singoli scatti dei muscoli estensori tibiali del tarso per l'analisi dei dati; le posizioni dei tre cursori sono impostate come segue. Il cursore blu è posizionato nel punto in cui la coppia inizia a salire dalla coppia di riposo. Il cursore giallo è collocato dove la coppia ritorna al valore di riposo.

Dopo la fase di rilassamento, il cursore bianco non è più necessario e quindi viene posizionato a destra del cursore giallo. Questa figura mostra una stimolazione isometrica della forza tetanica del nervo tibiale mediante un traino di impulsi a 50 hertz della durata di 1,5 secondi, che ha determinato una contrazione tetanica del muscolo estensore tarsale tibiale. Per l'analisi dei dati, vengono posizionati i cursori blu e giallo.

Per quanto riguarda l'analisi del singolo scatto in questa figura, sono state indotte contrazioni eccentriche nei flessori tibio-tarsali. Una stimolazione percutanea del nervo perineale ha attivato una contrazione isometrica iniziale della durata di 800 millisecondi, al termine della quale è stata applicata una stiramento forzato alla gamba. Per questa analisi dei dati, il cursore blu è posizionato nel punto in cui la coppia isometrica inizia a salire rispetto alla coppia a riposo.

Il cursore giallo viene posizionato nel punto in cui la coppia di allungamento eccentrico inizia a salire rispetto al plateau isometrico. Il cursore bianco viene posizionato nel punto in cui la coppia ritorna al valore di riposo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se effettuata correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un protocollo stampato con punti di controllo passo dopo passo seguendo questa procedura.

Altri metodi, come le biopsie muscolari, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come il tipo di fibra muscolare o l'espressione del transgene dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia muscolare per esplorare le risposte all'esercizio nei cani affetti da distrofia muscolare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di fisiologia muscolare non invasivo nei cani.