Name: Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Scopri come creare sistemi di coltura neuronale con idrogel micropatternati utilizzando la litografia a proiezione con maschera dinamica. Questa tecnica consente di studiare la vitalità cellulare e la crescita dei neuriti con geometrie specifiche.

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Gli autori desiderano ringraziare il laboratorio del Prof. Anthony Windebank per condividere le loro competenze in materia di DRG dissezione e la cultura, così come il Prof. Chen Shaochen per le discussioni utili per quanto riguarda la configurazione DMD. Questa ricerca è stata finanziata in parte da Tulane University e sovvenzioni da parte del Consiglio Louisiana of Regents (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) e il NIH (NS065374).

1. DMD installazione <ol><li> La scheda DMD, guida di luce UV (con collimatore) e la lente obiettivo 4x sono tutti montati verticalmente su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. </li><li> La guida ai raggi UV deve essere regolata in modo che la luce colpisce l'array specchio con un angolo di 45 ° rispetto al piano degli specchi, e 24 ° sotto il piano degli specchi (Figura 1). </li><li> La lente obiettivo è montato in modo che la distanza dalla DMD alla lente obiettivo corrisponde alla lunghezza focale associata con la lente. </li><li> Un microscopio invertito è posto sotto la lente dell'obiettivo, in modo che la luce focalizzata riflessa dalla DMD possono essere visualizzati attraverso il microscopio. La distanza dalla lente obiettivo alla superficie polimerizzazione dovrebbe corrispondere a circa la distanza di lavoro della lente. Il palco sul microscopio può quindi essere usato per regolare questa distanza a fuoco con precisione l'immagine. Questa distanza può variare a seconda della superficie polimerizzazione scelto. </li></ol> 2. Costruisce Hydrogel doppio per Tissue Culture Espianto A. DRG espianto adesione <ol><li> Rivestire le pareti di 6-cell e inserti rivestiti cultura collagene (Corning) con Rain-X, avendo cura di evitare la membrana stessa. (In alternativa, una penna barriera idrofoba può essere utilizzato.) </li><li> Inserti idrato durante la notte con 1,5 ml di adesione medio in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. L'adesione media è di media neurobasal con il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF. </li><li> Harvest embrionale radice gangli dorsali (DRG) da E-15 cuccioli di ratto. DRG dovrebbe essere placcato sul collagene rivestito da 6 e inserti, ben quattro per inserto. </li><li> Incubare inserti per 2 ore per consentire DRG adesione alla membrana. </li></ol> B. Dinamica maschera fotopolimerizzazione Un dispositivo micromirror digitale (DMD) è una x 1024 768 serie di singoli specchi, simile a quella di televisori a proiezione, che riflette la luce selettivamente in base alla posizione dello specchio. Per i nostri scopi, il DMD viene usato per modello ultravioletti (UV) su idrogel photocrosslinkable, creando geometrie idrogel determinabile in modo semplice e rapido. La figura 1 mostra la configurazione del percorso DMD e raggi UV. Anche se il nostro DMD è una unità autonoma, il dispositivo può essere integrato anche per l'uso con molti microscopi esistenti. <ol><li> Rimuovere tutto il liquido in eccesso da inserire ed aggiungere 500 ml di polimerizzazione medio dentro l'inserto. Medio di polimerizzazione contiene il 10% PEG (MW 1000) e 0,5% Irgacure 2959 sciolto in media neurobasal integrata con 20 mg / ml di NGF e 1% Pen / Strep. </li><li> Collocare l'inserto sotto il dispositivo DMD su un Rain-X vetrino trattati. </li><li> Caricare l'immagine appropriata in bianco e nero da utilizzare come "fotomaschera" sul DMD, attraverso l'uso del programma incluso ALP-3 GUI di base. Per i nostri scopi, una forma biforcano è stato scelto per consentire l'attuazione di sistemi di guida dei neuriti. </li><li> Utilizzando un microscopio invertito per la visualizzazione, allineare il espianti di tessuto con la posizione appropriata sul fotomaschera utilizzando una sorgente di luce visibile riflessa della DMD. </li><li> Accendere la sorgente di luce visibile per la sorgente di luce UV, e illuminare la soluzione di PEG fino a reticolazione è sufficiente. (Per le condizioni date e 5,0 watt / cm 2 incidente sul DMD, reticolazione può essere completato in appena 55 secondi.) Ripetere per tutti i DRG quattro sull'inserto. </li><li> Lavare ogni inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di crescita medio sotto gli inserti di coltura cellulare, e permette di equilibrare in un incubatore per 30 minuti. Mezzo di crescita e 'di medie neurobasal contenente 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF. </li></ol> C. idrogel secondaria Puramatrix <ol><li> Per le applicazioni neuronale, 1% Puramatrix viene diluita secondo le istruzioni del produttore al 0,15% in sterili H 2 O e integrata con 1 mg / mL laminina solubile. </li><li> Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dal PEG vuoti, che contengono le espianti DRG, utilizzando un cotton-fioc sterile, Kimwipe, o micropipetta. </li><li> Puramatrix viene aggiunto alla vuoti PEG con una micropipetta per riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume vuoto, tipicamente ~ 1 ml viene usato per costruire. </li><li> Puramatrix inizia il processo di auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina fisiologica, cioè il PEG gonfio, ma 1,5 mL di terreno di coltura viene aggiunto sotto l'inserto e messo in incubatrice per un'ora per garantire la gelificazione totale. </li><li> Inizialmente, Puramatrix è leggermente acido, in modo da cambiare il supporto dopo un'ora per permettere di equilibrare il pH. </li><li> Cambiamenti media sono necessari circa ogni 48 ore. Fare attenzione che tutti i media èaggiunto sotto l'inserto, per proteggere l'integrità del Puramatrix meccanicamente deboli. </li></ol> Agarosio <ol><li> Per le applicazioni neuronale, agarosio viene diluita ad una soluzione 1% a mezzo di crescita e posto in un bagno d'acqua a 60 ° C fino a quando l'agarosio si scioglie completamente (~ 1 ora). La soluzione è quindi integrata con 1 mg / mL laminina solubile. </li><li> Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dalla vuoti PEG. </li><li> Agarosio viene aggiunto alla vuoti PEG al fine di riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume di vuoto, di solito ~ 1 ml viene usato per costruire. </li><li> 1,5 mL di terreno di coltura è pre-fresco (8 ° C) in un 6-pozzetti, e gli inserti di agarosio contenente vengono trasferiti ai media refrigerati e mantenuti in frigorifero a 8 ° C per almeno tre minuti per consentire di agarosio gel. </li><li> Infine, gli inserti sono trasferiti a 1,5 ml di pre-riscaldato terreno di coltura (37 ° C) e mantenuto in incubatrice a 37 ° C, con cambiamenti supporto richiesto ogni 48 ore. </li></ol> 3. Cellulare dual incapsulamento Hydrogel 3D Incapsulamento idrogel Dual è appropriata quando si utilizza qualsiasi auto-assemblaggio gel. Il gel photocrosslinkable, in questo caso PEG, funge da supporto strutturale per la presentazione geometrica della auto-assemblaggio gel, ad esempio Puramatrix o agarosio. Alcuni dei metodi, in particolare il tipo di gel e la scelta di fotomaschera, dipenderà dalla particolare applicazione desiderata. <ol><li> Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per la nostra applicazione, la sopravvivenza cellulare, abbiamo semplicemente scelto una presentazione cilindrica di Puramatrix per aiutare nella stampa delle cellule. Ricercatori che studiano segnalazione cellulare potrebbe essere interessato a una geometria compartimentale per consentire la diffusione di molecole chemiotattici. Inoltre, una rozza approssimazione di un'arteria ha dimostrato di rappresentare possibile applicazione alla ricerca dei vasi sanguigni. </li><li> Trattare le pareti di un inserto in colture cellulari in poliestere con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito. </li><li> Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l'inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi. </li><li> Lavare tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. </li><li> Rimuovere tutti i supporti in eccesso dal PEG vuoti. </li><li> Spin le cellule alla densità desiderata in un pellet. Bisogna fare attenzione a rimuovere tutti i media dal pellet cellula prima della miscelazione, come Puramatrix inizia auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina. Sospendere le cellule all'interno dello 0,15% Puramatrix diluita in H 2 O sterile supplementato con 10% di saccarosio. </li><li> Iniettare il Puramatrix / cellula / saccarosio miscela all'interno vuoti nel PEG. </li><li> Aggiungere 1,5 mL di terreno di crescita sotto l'inserto, e permettono di gel all'interno dell'incubatore per un'ora. </li><li> Cambiare i media dopo un'ora, e ~ ogni 48 ore successive. </li></ol> 4. Singola cella incapsulamento Hydrogel 3D Un incapsulamento idrogel unico potrebbe essere appropriato per ogni situazione in cui le cellule possono essere esaminate all'interno di un idrogel photocrosslinkable. <ol><li> Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per gli studi di sopravvivenza cellulare, abbiamo scelto ancora una volta una maschera di base circolare, per rappresentare un cilindro. Maschere simili a quelli mostrati nel metodo 4 potrebbe nuovamente essere applicata per il campo di ricerca appropriato. </li><li> Trattare una cella inserire poliestere cultura con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito. </li><li> Celle in qualsiasi concentrazione desiderata possono essere aggiunti direttamente alla soluzione di PEG al 10%, mescolando bene per assicurare una distribuzione omogenea. </li><li> Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l'inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi. </li><li> Lavare tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. </li><li> Riempire con mezzo di crescita sia sotto che sopra l'inserto, cambiando ogni ~ 2 giorni. </li></ol> 5. A film sottile di polimerizzazione Hydrogel <ol><li> Caricare una maschera appropriata sul DMD. </li><li> Trattare un collagene rivestito cellule inserire poliestere cultura con Rain-X, e il luogo di pioggia-X scivolo rivestito. </li><li> Aggiungi medio di polimerizzazione sufficiente per coprire solo la parte inferiore dell'inserto (~ 250-300 microlitri per 6-e inserti di lamiera). Consentire ai media di permeare la membrana inserto per 30-45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere l'eccesso di polimerizzazione medio dal inserto con una micropipetta o Kimwipe. Aggiungere una quantità sufficiente di raggi UV-trasparente di olio per coprire completamente il fondo dell'inserto. Lasciare l'inserto a sedere per 15-30 minuti a temperatura ambiente, il tempo necessario per l'olio per formare uno strato distinto al di sopra della media saturando polimerizzazione della membrana inserimento. </li><li> Collocare l'inserto e far scorrere sotto la DMD. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV. A causa della sottigliezza dello strato di PEG, reticolazione può essere completato in appena 15 secondi a 5,0 watt / cm 2 incidente sulla DMD. </li><li lavare l tre volte con dpbs sterile e pen-strep. la persistenza di un residuo oleoso una preoccupazione detergente delicato come il tween pu essere aggiunta al tampone lavaggio.><li> Conservare l'inserto in un 6-pozzetti di coltura tissutale. Aggiungi terreno di coltura per cellule in sospensione, nella concentrazione desiderata e pipetta un volume sufficiente di sospensione cellulare dentro l'inserto di coltura cellulare per ottenere la densità cellulare desiderato. Quindi, aggiungere la crescita media abbastanza sotto l'inserto per mantenere completamente la vitalità cellulare (~ 1,5 ml). </li><li> Dopo 48 ore sono trascorse, lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep per rimuovere tutte le cellule unadhered. Modificare i media circa una volta ogni 48 ore. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Esempi di idrogel dual costruisce contenenti espianti DRG sono mostrati nella Figura 2. Si noti che la migrazione cellulare e l'estensione dei neuriti è limitata alla regione cellula permissiva del idrogel doppio costrutto. La Figura 3 mostra le cellule incapsulate dissociato allo stesso modo all'interno del costruisce idrogel duale. A causa della natura dinamica del fotomaschera DMD, la geometria a disposizione per l'incapsulamento è limitata solo dalle dimensioni e la risoluzione delle ottiche. Incapsulamento delle cellule è stato possibile anche all'interno di un idrogel singolo photopolymerizable, PEG, e un vivo / morto test di vitalità è stato effettuato, come evidenziato in Figura 4. Incapsulamento di PEG è inteso solo come esempio, come PEG non rappresenta un ambiente ideale per le cellule neurali. Pertanto, la vitalità cellulare realizzato nel nostro costruisce PEG è comprensibilmente bassa. Infine, esempi di utilizzo PEG film sottile come uno strato di fantasia restrittive per l'adesione cellulare su inserti colture cellulari sono mostrati in figura 5. Inoltre, esempi di possibili "cattivi" i risultati sono offerti in Figura 6. I risultati rappresentano solo una piccola frazione dei possibili usi dei metodi sviluppati nel nostro laboratorio. Essi hanno lo scopo di dimostrare l', versatilità e facilità la vitalità del nostro approccio, e potrebbero essere trattati come "prova di principio" per i ricercatori a sviluppare i loro propri adattamenti possibili. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Illustrazione schematica del percorso della luce utilizzata per fotolitografia. Riquadro: La luce UV illumina il DMD con un angolo di 45 ° e 24 ° sotto il piano del vettore specchio. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Crescita e la proliferazione in etichetta DRG contenenti costrutti di idrogel duale. DC) raffigurante immagini polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). Il espianti DRG sono contenuti in Puramatrix e situati nelle regioni circolare del modello, con neuriti crescente verso la biforcazione (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Costruisce idrogel doppio contenente cellule marcate con calceina AM, un marker di cellule in vivo, dopo 48 ore in mezzo di crescita. DC) PEG forme diverse, piene di Puramatrix contenenti dissociata neuroni DRG (~ 5x10 3 celle / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Idrogel singola costruzione contenenti cellule vive etichettati con calceina AM (verde) e le cellule morte etichettati con etidio omodimero-1 (rossa) dopo 24 ore in mezzo di crescita (5x10 3 celle / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Cella Figura 5. PEG restrittive polimerizzate come un film sottile utilizzando un "modello di prova" per aderire selettivamente le cellule dissociate alla membrana rivestita di collagene di supporti permeabili. A, B) le cellule vive sono etichettati dopo 48 ore con calceina AM (verde), mentre le cellule morte vengono etichettati con etidio omodimero-1 (rossa). Adesione cellulare minima si verifica nella zona contenente il film sottile PEG. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Immagini rappresentative dei risultati indesiderati. A) polimerizzazione parziale della PEG, portando ad una PEG inutilizzabile costruire. Polimerizzazione improprio può verificarsi a causa della presenza di un menisco nel pre-polimero medio, quantità insufficienti di media polimerizzazione, esposizione ai raggi UV insufficiente o non corretta messa a fuoco delle ottiche. B) immagine raffigurante polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). I neuriti sono stati in grado di crescere al di fuori dei canali PEG fantasia. Ciò si verifica spesso nella condizione che trabocca Puramatrix sulla parte superiore della porzione PEG durante l'iniezione.

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo descritto nel presente documento può essere utilizzato da qualsiasi investigatore alla ricerca semplice e riproducibile sistemi di colture cellulari. Teoricamente, a causa della grande varietà di idrogel photopolymerizable disponibili, l&#39;ambiente potrebbe essere adattato per consentire l&#39;utilizzo con qualsiasi tipo di cellula, compreso espianti di tessuto intero. Inoltre, il sistema duale idrogel permette di migliorare il controllo dello spazio nella presentazione di auto-polimerizzazione idrogel, che tendono a creare forme amorfe da soli. La risultante &quot;2,5 D&quot; costruisce idrogel micropatterned fornire una matrice 3D di crescita neurale presentato in una configurazione 2D che permette conveniente valutazione microscopica. Il substrato su cui si polimerizzato il gel può essere variata, consentendo un maggiore controllo nel disegno sperimentale. I nostri metodi sono ottimizzati per l&#39;uso con supporti colture cellulari permeabili, come abbiamo visto viabilità migliorata (Figura 4) rispetto alla polimerizzazione su vetrini (dati non riportati). Tuttavia, le superfici di polimerizzazione altri possono essere più applicabile per diverse applicazioni: lavorazione su vetro slide utilizzate negli esperimenti di microfluidica o formazioni aggregato di cellule, per esempio. La nostra esperienza con questi sistemi cultura ha portato all&#39;identificazione di potenziali aree di difficoltà. In primo luogo, le tecniche di cura sono tenuti a mantenere la sterilità dei costrutti. A causa della natura ingombrante della configurazione DMD, è difficile operare passi polimerizzazione in condizioni sterili. Per combattere questo problema, il risciacquo passo descritto nei metodi è utile, e gli antibiotici devono essere utilizzati in tutti i media. Inoltre, lo spessore finale e la forma del costrutto polimerizzato è fortemente dipendente dal comportamento fluido del pre-polimero misto, e la presenza di un menisco può portare a costrutti gel che sono troppo sottili o non completamente polimerizzati (Figura 6). A due passi possono essere adottate per minimizzare la formazione di un menisco interno inserisce colture cellulari. Per idrogel di spessore (&gt; 200 micron), un semplice rivestimento di pioggia-X attorno alla parete interna dell&#39;inserto è sufficiente. Tuttavia, come brevemente descritto sopra, per i costrutti sottili (&lt;200 micron), uno strato di olio è necessario per minimizzare sia il menisco e negare tempra ossigeno della polimerizzazione dei radicali liberi. Risoluzione è risultato essere dipendente da spessore, con una diminuzione della dimensione del tratto realizzato con gel sempre più spesso. La risoluzione inoltre varia a seconda che la funzione di rappresentare un rilievo positivo o negativo in idrogel. Tuttavia, abbiamo ottenuto una risoluzione sufficiente per le costruzioni con dimensioni caratteristiche minimo sulla scala di circa 100 micron con obiettivi microscopio solo come messa a fuoco dell&#39;ottica. I nostri esperimenti hanno mostrato che i costrutti idrogel dual qui descritti costituiscono una base eccellente per la formazione di base in vitro modelli di crescita dei neuriti e di orientamento. La tecnica impiegata micropatterning è un adattamento dei metodi esistenti 18,19, ma il nostro set-up ha sottolineato un semplice da implementare la progettazione ed è stato ottimizzato per la produzione di costrutti idrogel duplice inserti colture cellulari; inserti in colture cellulari sono stati di vitale importanza per migliorare la vitalità cellulare e come reticolazione intorno espianti tessuto precedentemente aderente. Il campo di applicazione i risultati mostrati è limitata dagli interessi del nostro laboratorio, tuttavia, riteniamo che i metodi descritti in questa pubblicazione si rivelerà utile per i ricercatori alla ricerca di un relativamente a buon mercato, metodo veloce e facile da usare per la fabbricazione di coltura cellulare 3D modelli.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo Digitale a Micromirror</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Sostegno Permeabile con Collagene Rivestito Transwell</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>Chiamato anche Inserto per Coltura Cellulare nel manoscritto</td></tr><tr><td>Sostegno Permeabile in Poliestere Transwell</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Chiamato anche Inserto per Coltura Cellulare nel manoscritto</td></tr><tr><td>Mezzo Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Serum Fetale Bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di Crescita Nervosa</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Olio</td><td>Sono stati utilizzati sia olio di colza che olio siliconico</td><td></td><td>Deve essere trasparente ai raggi UV e ridurre al minimo la formazione del menisco positivo/negativo</td></tr><tr><td>OmniCure Serie 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di idrogel micropatterned per i sistemi cultura neurali utilizzando dynamic fotolitografia proiezione mask

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Sempre più spesso, fantasia ambienti colture cellulari stanno diventando una tecnica rilevante per lo studio caratteristiche cellulari, e molti ricercatori credono nella necessità di ambienti 3D per rappresentare gli esperimenti in vitro che meglio imitare in qualità vivo 1-3. Gli studi in campi come la ricerca sul cancro 4, ingegneria neurale 5, fisiologia cardiaca 6 e cellula-matrice interazione 7,8 hanno mostrato il comportamento delle cellule differisce in modo sostanziale tra le colture monostrato tradizionali e costrutti 3D. Idrogel sono utilizzati come ambienti 3D a causa della loro varietà, versatilità e capacità di adattare la composizione molecolare attraverso funzionalizzazione 9-12. Esistono numerose tecniche per la creazione di costrutti come cellule matrici di supporto, tra cui electrospinning 13, francobolli elastomero 14, stampa a getto d&#39;inchiostro 15, photopatterning additivo 16, fotomaschera statico proiezione-litografia 17, e microstereolithography maschera dinamico 18. Purtroppo, questi metodi comportano fasi di produzione multiple e / o attrezzature non facilmente adattabile alle celle convenzionali e metodi di coltura di tessuti. La tecnica impiegata in questo protocollo si adatta ultimi due metodi, utilizzando un dispositivo digitale microspecchi (DMD) per creare fotomaschere dinamico per reticolazione geometricamente specifici poli-(glicole etilenico) (PEG) idrogel, indotta attraverso polimerizzazione UV iniziato radicali liberi. La risultante &quot;2,5 D&quot; strutture offrono un ambiente limitato 3D per la crescita neuronale. Ci avvaliamo di un sistema dual-idrogel approccio, in cui PEG funge da cellula-restrittivo struttura regione fornisce a un altro modo informe, ma cellule permissive auto-assemblaggio gel a base di entrambi i Puramatrix o agarosio. Il processo è veloce semplice fabbricazione passo che è altamente riproducibile e facilmente adattati per essere utilizzati con i metodi tradizionali di coltura cellulare e substrati. Espianti di tessuto intero, come ad esempio embrionale gangli spinali (DRG), possono essere incorporati in costrutti idrogel doppio per le prove sperimentali come crescita dei neuriti. Inoltre, le cellule possono essere dissociate incapsulato nel idrogel photocrosslinkable o auto polimerizzazione, o selettivamente aderito alla membrana permeabile supporto utilizzando cellule restrittive photopatterning. Utilizzando la DMD, abbiamo creato idrogel costruisce fino a ~ 1 mm di spessore, ma a film sottile (&lt;200 micron), le strutture PEG sono stati limitati dalla tempra d&#39;ossigeno della reazione di polimerizzazione radicalica. Successivamente abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza uno strato di olio di sopra del liquido di polimerizzazione che ha permesso sottile polimerizzazione struttura PEG. In questo protocollo, si descrive la creazione rapida di sistemi di idrogel 3D per la produzione di microfabbricazione di cellule neuronali e colture di tessuti. I costrutti idrogel dual dimostrato nel presente documento rappresentano versatili modelli in vitro che possono rivelarsi utili per gli studi nel campo delle neuroscienze che coinvolgono la sopravvivenza delle cellule, la migrazione e / o la crescita dei neuriti e di orientamento. Inoltre, come il protocollo può funzionare per molti tipi di idrogel e cellule, le potenziali applicazioni sono sia vario e vasto.

Semplici tecniche sono descritte per la produzione rapida di microfabbricazione sistemi di coltura neurali utilizzando un dispositivo digitale micromirror per litografia dinamica proiezione maschera su substrati regolari colture cellulari. Questi sistemi di coltura possono essere più rappresentativo dell&#39;architettura naturale biologico, e le tecniche descritte potrebbe essere adattato per numerose applicazioni.

Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Sempre più spesso, gli ambienti di coltura cellulare patternizzati stanno diventando una tecnica rilevante per studiare le caratteristiche cellulari, e molti ricercatori ritengono che...

L'obiettivo generale di questo procedimento è creare un sistema di coltura cellulare a idrogel doppio e microstrutturato per studi neuronali. Questo viene realizzato innanzitutto seminando innesti di tessuto, come gangli della radice dorsale embrionali, su inserti per coltura cellulare permeabili. Successivamente, viene creata una microstruttura in un idrogel fotoincrociabile utilizzando un dispositivo microscopico a specchio digitale o DMD come maschera fotodinamica.Successivamente, viene aggiunto l'idrogel autoassemblante come Pure, che può contenere una sospensione di cellule dissociate. È necessario un tempo di incubazione adeguato prima dell'analisi cellulare. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano la vitalità delle cellule neuronali e l'outgrowth dei neuriti attraverso configurazioni geometriche specifiche definite dal DMD.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che una massa foto-dinamica può essere rapidamente creata, modificata e proiettata a distanza per adattarsi a quasi ogni tipo di substrato, come inserti per colture cellulari permeabili. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui sistemi neurali, può essere applicato anche ad altri sistemi che potrebbero trarre beneficio da vincoli geometrici specificabili, come il segnaling cellulare, la migrazione cellulare, il contatto tra cellula e cellula o la morfogenesi, solo per citarne alcuni. Le luci UV della scheda DMD, la guida e l'obiettivo da quattro volte sono tutti montati verticalmente su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni.Un microscopio invertito viene posizionato al di sotto dell'obiettivo in modo che la luce focalizzata riflessa dal DMD possa essere visualizzata attraverso il microscopio. Per ulteriori dettagli sulla configurazione del DMD, si prega di consultare il protocollo scritto allegato. Innanzitutto, preparare le sei camere da coltura cellulare con rivestimento in collagene per accogliere le colture esplanti, rivestendo le pareti delle camere da coltura con Rain X, avendo cura di non applicare Rain X direttamente sulla membrana.Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo aian agli inserti e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, dopo aver isolato i gangli della radice dorsale embrionali da cuccioli di ratto E15, piastrare fino a quattro DRG su ciascun inserto da sei pozzetti rivestito con collagene e incubare per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire ai DRG di aderire alla membrana.Al termine del periodo di incubazione, i gangli della radice dorsale saranno pronti per la fotopolimerizzazione. Un dispositivo digitale a microspecchi è un array composto da 1024 × 768 microspecchi individuali, in grado di riflettere selettivamente la luce in base alla posizione di ciascuno specchio. In questa procedura, il dispositivo a microspecchi viene utilizzato per proiettare luce ultravioletta sui CRO fotoattivabili, idrogeli legabili, creando geometrie di idrogel definite in modo semplice e rapido.Sebbene il nostro DMD sia un'unità autonoma, il dispositivo può anche essere integrato per l'uso con molti microscopi esistenti. In primo luogo, prelevare le piante DRGX dall'incubatore, aspirare tutto il liquido in eccesso dall'inserto. Quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo di polimerizzazione all'interno dell'inserto.Trasferire i frammenti con le piante DRGX su un vetrino in vetro resistente alla pioggia e posizionare il vetrino sotto il DMD. Utilizzare il programma di interfaccia utente grafica ALP tre per caricare l'immagine in bianco e nero che verrà utilizzata come maschera fotografica sul DMD. In questo caso, è stata scelta una forma biforcata per consentire l'implementazione di sistemi di guida dei neuriti mediante un microscopio invertito e una sorgente di luce visibile DI.Allineare l'espianato di tessuto con la posizione corretta sulla maschera fotografica utilizzando la luce riflessa dal DMD come guida. Successivamente, sostituire la sorgente di luce visibile con una sorgente di luce UV. Illuminare il mezzo di polimerizzazione all'interno della coltura cellulare.Inserire fino al completamento del reticolaggio del PEG. Ripetere per ciascun ganglio radicolare dorsale sull'inserzione. Quindi lavare ogni inserzione tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato sterile contenente 1% di penicillina-streptomicina.Infine, aggiungere 1,5 millilitri di mezzo di crescita al di sotto degli inserti per coltura cellulare e lasciare equilibrare in un incubatore per colture tessutali a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Durante il periodo di incubazione, sottoporre la matrice pura a sonicazione per 30 minuti. Per solubilizzare i peptidi, diluire la soluzione fornita allo 1% fino allo 0,15% in acqua sterile e integrare con un microgrammo per millilitro di laminina solubile.Dopo 30 minuti, rimuovere le colture dall'incubatore ed aspirare tutto il mezzo in eccesso dall'inserto. Quindi, osservando il vuoto al microscopio, aspirare il mezzo dall'interno dell'area vuota nella costruzione di PEG contenente l'esplanato DRGX, pipettando circa un microlitro di soluzione di matrice pura nel vuoto attorno all'esplanato X. Assicurarsi che la matrice pura non trabocchi dal vuoto del perno.Quindi pipettare 1,5 millilitri di mezzo di crescita al di sotto dell'inserzione e posizionare nell'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora. Per garantire un'equilibratura completa dopo questo periodo, sostituire il mezzo di crescita e quindi reinserire le colture nell'incubatrice. Il mezzo di crescita viene sostituito ogni 48 ore di coltura.Esempi di costrutti di idrogel duali contenenti piante DRGX sono mostrati qui. Le piante DRGX sono state marcate per marcatori di crescita e proliferazione. Il costrutto di PEG polimerizzato appare grigio, le NEURITI del ganglio dorsale radicolare marcate con la beta-tubulina tre appaiono verdi e la colorazione DPI evidenzia i nuclei cellulari come visibili in blu.Si noti che la migrazione cellulare e l'estensione dei reticoli sono limitate alla regione permissiva per le cellule del costrutto idrogel doppio. L'incapsulamento in idrogel doppio è appropriato quando si utilizza qualsiasi gel autocomponente o gel foto-incrociabile. In questo caso, il PEG funge da supporto strutturale per la presentazione geometrica del gel autocomponente.Ad esempio, matrice pura o aris. Il tipo di gel e la scelta della maschera fotografica dipenderanno dall'applicazione desiderata specifica. Trattare le pareti di un inserto per coltura cellulare in poliestere con rain X come precedentemente dimostrato.Trasferire l'inserto su un vetrino rivestito con Rain X e posizionarlo sotto il DMD. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di mezzo di polimerizzazione all'inserto. Caricare sulla DMD la maschera appropriata per questo esperimento di sopravvivenza.Viene utilizzata una presentazione cilindrica di matrice pura per facilitare l'acquisizione delle immagini delle cellule. Esporre l'inserto alla luce UV per 55 secondi per indurre il legame incrociato dei perni dopo il legame incrociato. Lavare il vuoto appena formato con DPBS sterile e penicillina-streptomicina al 1%.Utilizzare una pipetta microlitrica o un bastoncino sterile in cotone per rimuovere tutto il liquido in eccesso dalla cavità. Preparare Matrixx puro mediante sonificazione per 30 minuti, diluirlo allo 0,15% in acqua sterile, integrato con un microgrammo per millilitro di laminina solubile e 10% di saccarosio. Successivamente, pellettizzare le cellule da coltivare mediante centrifugazione.Aspirare completamente il mezzo dal pellet cellulare e risospendere il pellet a una concentrazione di circa cinque per 10 alla tre cellule per millilitro nella soluzione di matrice pura allo 0,15%. È fondamentale che tutto il mezzo venga aspirato dal pellet cellulare, poiché la matrice pura inizia l'autoassemblaggio al contatto con la soluzione salina. Successivamente, pipettare circa un microlitro della miscela cellulare di matrice pura arricchita nell'interstizio del perno.Questo volume è generalmente sufficiente per riempire lo spazio vuoto senza far fuoriuscire 1,5 millilitri di terreno di crescita dalla pipetta al di sotto dell'inserzione. Successivamente, posizionare l'idrogel secondario di matrice pura nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora, al fine di garantire la completa gelificazione. Trascorso questo tempo, aspirare il terreno e aggiungere terreno fresco al di sotto dell'inserzione, avendo cura di non danneggiare la matrice pura, meccanicamente fragile.Riportare le colture nell'incubatore per colture cellulari e cambiare il mezzo ogni 48 ore. Di seguito sono riportati esempi di neuroni del ganglio della radice dorsale vivi incapsulati all'interno di diverse strutture di idrogel doppio. Dopo 48 ore in mezzo di crescita, le cellule sono state marcate con calcio, un marcatore per cellule vive che appare verde.Qui, a causa della natura dinamica della maschera foto-litografica DMD, la geometria disponibile per l'incapsulamento è limitata soltanto dalle dimensioni e dalla risoluzione dell'ottica. Un'incapsulazione singola in idrogel è appropriata quando le cellule possono essere esaminate all'interno di un idrogel foto-incrociabile conforme alla coltura cellulare su poliestere. Inserire con rain X e posizionare sotto il DMD su un vetrino rivestito con rain X.Come in precedenti occasioni, pipettare le cellule da coltivare direttamente nel mezzo di polimerizzazione alla concentrazione desiderata e mescolare bene per garantire una distribuzione omogenea. Quindi pipettare 500 microlitri della miscela cellulare nel mezzo di polimerizzazione nell'apposito inserto. Selezionare la maschera appropriata e caricarla sul DMD, quindi indurre il reticolaggio del PEG esponendo alla luce UV per 55 secondi.Per studi sulla sopravvivenza cellulare, si utilizza una maschera circolare di base per rappresentare un cilindro: lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e penicillina-streptomicina al 1%, quindi aggiungere con una pipetta 1,5 millilitri di mezzo di crescita al di sotto dell'inserto e una quantità sufficiente di mezzo di crescita al di sopra per immergere completamente l'inserto; incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, con cambi del mezzo ogni 48 ore. Di seguito è riportato un esempio di neuroni corticali dissociati vitali incapsulati all'interno di PEG. Le cellule vive sono marcate con calcio am e appaiono verdi, mentre le cellule morte sono marcate con ethidio homodimer-1 e appaiono rosse.L'incapsulamento in PEG è indicato solo come esempio, poiché il PEG non rappresenta un ambiente ideale per le cellule neurali. La geometria scelta rappresenta un metodo semplice per studiare la vitalità cellulare, ma potrebbe essere adattata a una vasta gamma di strutture. I gel idratati sotto forma di film sottile possono essere utilizzati per generare specifici modelli di cellule confinate.Trattare nuovamente l'inserto per coltura cellulare in poliestere con rain X come in precedenza e posizionarlo su un vetrino trattato con rain X. Successivamente, pipettare da 250 a 300 microlitri di mezzo di polimerizzazione sul fondo dell'inserto per coltura cellulare trattato. Questo volume è sufficiente per coprire appena il fondo dell'inserto; incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti per permettere al mezzo di permeare la membrana dell'inserto. Aspirare il mezzo in eccesso dall'inserto con una micropipetta.Quindi pipettare una quantità sufficiente di olio trasparente ai raggi UV sul fondo dell'inserto in modo da coprire completamente l'area. Incubare l'inserto a temperatura ambiente per 15-30 minuti, tempo sufficiente perché l'olio formi uno strato distinto al di sopra del mezzo di polimerizzazione. Per saturare la membrana dell'inserto, caricare una maschera appropriata sul DMD.Dopo aver posizionato il frammento e il vetrino sotto il DMD, indurre il cross-linking dei peg mediante esposizione alla luce UV. Lavare il frammento tre volte con DPBS sterile e 1% pen strap; dopo il lavaggio, trasferire il frammento in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti, raccogliere e centrifugare le cellule da coltivare. Aspirare il mezzo e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crescita alla concentrazione desiderata, compresa tra 10⁴ e 10⁶ cellule per millilitro.Quindi pipettare un volume sufficiente della sospensione cellulare all'interno dell'inserto per colture cellulari per ottenere la densità cellulare desiderata. Aggiungere un quantitativo sufficiente di mezzo di crescita al di sotto dell'inserto per mantenere completamente la vitalità cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica dopo 48 ore di incubazione.Lavare l'inserimento tre volte con DPBS sterile e 1% penicillina-streptomicina per rimuovere eventuali cellule non aderite. Quindi aggiungere mezzo di crescita fresco nei pozzetti. Reintrodurre la piastra nell'incubatore per colture cellulari ed eseguire il cambio del mezzo ogni 48 ore.Qui il PEG restrittivo per le cellule è stato polimerizzato come un sottile film utilizzando un modello di prova per aderire selettivamente le cellule dissociate alla membrana rivestita di collagene dei supporti permeabili. Le cellule sono state marcate dopo 48 ore di incubazione. Le cellule vive marcate con calc am appaiono verdi, mentre le cellule morte sono marcate con atherium homodimer uno e appaiono rosse.Si può osservare che si verifica un minimo ingobbio cellulare nell'area contenente il sottile film di PEG. Questo è un esempio di risultato indesiderato. Una polimerizzazione parziale del PEG ha prodotto una struttura di PEG inutilizzabile.Una polimerizzazione inadeguata può verificarsi a causa della presenza di un menisco nel mezzo pre-polimerico, quantità insufficienti di polimerizzazione, mezzo insufficiente, esposizione inadeguata ai raggi UV o messa a fuoco impropria dell'ottica. Questo è un esempio di un'inadeguata incapsulazione tridimensionale in idrogel doppio di colture cellulari vegetali A-D-R-G-X. In questa immagine, si può osservare che i neuriti visibili in verde sono riusciti a crescere al di fuori dei canali dei perni strutturati.Questo si verifica spesso se la matrice pura trabocca sulla porzione di PEG durante l'iniezione. Seguendo questa procedura, altri metodi standard come il patch clamping o l'immunohistochimica possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio l'elettrofisiologia o l'espressione fenotipica.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la fotolitografia con proiezione di maschere dinamiche per definire la presentazione geometrica di sistemi ad idrogel singoli o doppi allo scopo di studiare colture cellulari neuronali.

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Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

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