Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

L'obiettivo generale di questo procedimento è creare un sistema di coltura cellulare a idrogel doppio e microstrutturato per studi neuronali. Questo viene realizzato innanzitutto seminando innesti di tessuto, come gangli della radice dorsale embrionali, su inserti per coltura cellulare permeabili. Successivamente, viene creata una microstruttura in un idrogel fotoincrociabile utilizzando un dispositivo microscopico a specchio digitale o DMD come maschera fotodinamica.

Successivamente, viene aggiunto l'idrogel autoassemblante come Pure, che può contenere una sospensione di cellule dissociate. È necessario un tempo di incubazione adeguato prima dell'analisi cellulare. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano la vitalità delle cellule neuronali e l'outgrowth dei neuriti attraverso configurazioni geometriche specifiche definite dal DMD.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che una massa foto-dinamica può essere rapidamente creata, modificata e proiettata a distanza per adattarsi a quasi ogni tipo di substrato, come inserti per colture cellulari permeabili. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui sistemi neurali, può essere applicato anche ad altri sistemi che potrebbero trarre beneficio da vincoli geometrici specificabili, come il segnaling cellulare, la migrazione cellulare, il contatto tra cellula e cellula o la morfogenesi, solo per citarne alcuni. Le luci UV della scheda DMD, la guida e l'obiettivo da quattro volte sono tutti montati verticalmente su un tavolo di isolamento dalle vibrazioni.

Un microscopio invertito viene posizionato al di sotto dell'obiettivo in modo che la luce focalizzata riflessa dal DMD possa essere visualizzata attraverso il microscopio. Per ulteriori dettagli sulla configurazione del DMD, si prega di consultare il protocollo scritto allegato. Innanzitutto, preparare le sei camere da coltura cellulare con rivestimento in collagene per accogliere le colture esplanti, rivestendo le pareti delle camere da coltura con Rain X, avendo cura di non applicare Rain X direttamente sulla membrana.

Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzo aian agli inserti e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, dopo aver isolato i gangli della radice dorsale embrionali da cuccioli di ratto E15, piastrare fino a quattro DRG su ciascun inserto da sei pozzetti rivestito con collagene e incubare per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire ai DRG di aderire alla membrana.

Al termine del periodo di incubazione, i gangli della radice dorsale saranno pronti per la fotopolimerizzazione. Un dispositivo digitale a microspecchi è un array composto da 1024 × 768 microspecchi individuali, in grado di riflettere selettivamente la luce in base alla posizione di ciascuno specchio. In questa procedura, il dispositivo a microspecchi viene utilizzato per proiettare luce ultravioletta sui CRO fotoattivabili, idrogeli legabili, creando geometrie di idrogel definite in modo semplice e rapido.

Sebbene il nostro DMD sia un'unità autonoma, il dispositivo può anche essere integrato per l'uso con molti microscopi esistenti. In primo luogo, prelevare le piante DRGX dall'incubatore, aspirare tutto il liquido in eccesso dall'inserto. Quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo di polimerizzazione all'interno dell'inserto.

Trasferire i frammenti con le piante DRGX su un vetrino in vetro resistente alla pioggia e posizionare il vetrino sotto il DMD. Utilizzare il programma di interfaccia utente grafica ALP tre per caricare l'immagine in bianco e nero che verrà utilizzata come maschera fotografica sul DMD. In questo caso, è stata scelta una forma biforcata per consentire l'implementazione di sistemi di guida dei neuriti mediante un microscopio invertito e una sorgente di luce visibile DI.

Allineare l'espianato di tessuto con la posizione corretta sulla maschera fotografica utilizzando la luce riflessa dal DMD come guida. Successivamente, sostituire la sorgente di luce visibile con una sorgente di luce UV. Illuminare il mezzo di polimerizzazione all'interno della coltura cellulare.

Inserire fino al completamento del reticolaggio del PEG. Ripetere per ciascun ganglio radicolare dorsale sull'inserzione. Quindi lavare ogni inserzione tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato sterile contenente 1% di penicillina-streptomicina.

Infine, aggiungere 1,5 millilitri di mezzo di crescita al di sotto degli inserti per coltura cellulare e lasciare equilibrare in un incubatore per colture tessutali a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Durante il periodo di incubazione, sottoporre la matrice pura a sonicazione per 30 minuti. Per solubilizzare i peptidi, diluire la soluzione fornita allo 1% fino allo 0,15% in acqua sterile e integrare con un microgrammo per millilitro di laminina solubile.

Dopo 30 minuti, rimuovere le colture dall'incubatore ed aspirare tutto il mezzo in eccesso dall'inserto. Quindi, osservando il vuoto al microscopio, aspirare il mezzo dall'interno dell'area vuota nella costruzione di PEG contenente l'esplanato DRGX, pipettando circa un microlitro di soluzione di matrice pura nel vuoto attorno all'esplanato X. Assicurarsi che la matrice pura non trabocchi dal vuoto del perno.

Quindi pipettare 1,5 millilitri di mezzo di crescita al di sotto dell'inserzione e posizionare nell'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora. Per garantire un'equilibratura completa dopo questo periodo, sostituire il mezzo di crescita e quindi reinserire le colture nell'incubatrice. Il mezzo di crescita viene sostituito ogni 48 ore di coltura.

Esempi di costrutti di idrogel duali contenenti piante DRGX sono mostrati qui. Le piante DRGX sono state marcate per marcatori di crescita e proliferazione. Il costrutto di PEG polimerizzato appare grigio, le NEURITI del ganglio dorsale radicolare marcate con la beta-tubulina tre appaiono verdi e la colorazione DPI evidenzia i nuclei cellulari come visibili in blu.

Si noti che la migrazione cellulare e l'estensione dei reticoli sono limitate alla regione permissiva per le cellule del costrutto idrogel doppio. L'incapsulamento in idrogel doppio è appropriato quando si utilizza qualsiasi gel autocomponente o gel foto-incrociabile. In questo caso, il PEG funge da supporto strutturale per la presentazione geometrica del gel autocomponente.

Ad esempio, matrice pura o aris. Il tipo di gel e la scelta della maschera fotografica dipenderanno dall'applicazione desiderata specifica. Trattare le pareti di un inserto per coltura cellulare in poliestere con rain X come precedentemente dimostrato.

Trasferire l'inserto su un vetrino rivestito con Rain X e posizionarlo sotto il DMD. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di mezzo di polimerizzazione all'inserto. Caricare sulla DMD la maschera appropriata per questo esperimento di sopravvivenza.

Viene utilizzata una presentazione cilindrica di matrice pura per facilitare l'acquisizione delle immagini delle cellule. Esporre l'inserto alla luce UV per 55 secondi per indurre il legame incrociato dei perni dopo il legame incrociato. Lavare il vuoto appena formato con DPBS sterile e penicillina-streptomicina al 1%.

Utilizzare una pipetta microlitrica o un bastoncino sterile in cotone per rimuovere tutto il liquido in eccesso dalla cavità. Preparare Matrixx puro mediante sonificazione per 30 minuti, diluirlo allo 0,15% in acqua sterile, integrato con un microgrammo per millilitro di laminina solubile e 10% di saccarosio. Successivamente, pellettizzare le cellule da coltivare mediante centrifugazione.

Aspirare completamente il mezzo dal pellet cellulare e risospendere il pellet a una concentrazione di circa cinque per 10 alla tre cellule per millilitro nella soluzione di matrice pura allo 0,15%. È fondamentale che tutto il mezzo venga aspirato dal pellet cellulare, poiché la matrice pura inizia l'autoassemblaggio al contatto con la soluzione salina. Successivamente, pipettare circa un microlitro della miscela cellulare di matrice pura arricchita nell'interstizio del perno.

Questo volume è generalmente sufficiente per riempire lo spazio vuoto senza far fuoriuscire 1,5 millilitri di terreno di crescita dalla pipetta al di sotto dell'inserzione. Successivamente, posizionare l'idrogel secondario di matrice pura nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora, al fine di garantire la completa gelificazione. Trascorso questo tempo, aspirare il terreno e aggiungere terreno fresco al di sotto dell'inserzione, avendo cura di non danneggiare la matrice pura, meccanicamente fragile.

Riportare le colture nell'incubatore per colture cellulari e cambiare il mezzo ogni 48 ore. Di seguito sono riportati esempi di neuroni del ganglio della radice dorsale vivi incapsulati all'interno di diverse strutture di idrogel doppio. Dopo 48 ore in mezzo di crescita, le cellule sono state marcate con calcio, un marcatore per cellule vive che appare verde.

Qui, a causa della natura dinamica della maschera foto-litografica DMD, la geometria disponibile per l'incapsulamento è limitata soltanto dalle dimensioni e dalla risoluzione dell'ottica. Un'incapsulazione singola in idrogel è appropriata quando le cellule possono essere esaminate all'interno di un idrogel foto-incrociabile conforme alla coltura cellulare su poliestere. Inserire con rain X e posizionare sotto il DMD su un vetrino rivestito con rain X.

Come in precedenti occasioni, pipettare le cellule da coltivare direttamente nel mezzo di polimerizzazione alla concentrazione desiderata e mescolare bene per garantire una distribuzione omogenea. Quindi pipettare 500 microlitri della miscela cellulare nel mezzo di polimerizzazione nell'apposito inserto. Selezionare la maschera appropriata e caricarla sul DMD, quindi indurre il reticolaggio del PEG esponendo alla luce UV per 55 secondi.

Per studi sulla sopravvivenza cellulare, si utilizza una maschera circolare di base per rappresentare un cilindro: lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e penicillina-streptomicina al 1%, quindi aggiungere con una pipetta 1,5 millilitri di mezzo di crescita al di sotto dell'inserto e una quantità sufficiente di mezzo di crescita al di sopra per immergere completamente l'inserto; incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, con cambi del mezzo ogni 48 ore. Di seguito è riportato un esempio di neuroni corticali dissociati vitali incapsulati all'interno di PEG. Le cellule vive sono marcate con calcio am e appaiono verdi, mentre le cellule morte sono marcate con ethidio homodimer-1 e appaiono rosse.

L'incapsulamento in PEG è indicato solo come esempio, poiché il PEG non rappresenta un ambiente ideale per le cellule neurali. La geometria scelta rappresenta un metodo semplice per studiare la vitalità cellulare, ma potrebbe essere adattata a una vasta gamma di strutture. I gel idratati sotto forma di film sottile possono essere utilizzati per generare specifici modelli di cellule confinate.

Trattare nuovamente l'inserto per coltura cellulare in poliestere con rain X come in precedenza e posizionarlo su un vetrino trattato con rain X. Successivamente, pipettare da 250 a 300 microlitri di mezzo di polimerizzazione sul fondo dell'inserto per coltura cellulare trattato. Questo volume è sufficiente per coprire appena il fondo dell'inserto; incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti per permettere al mezzo di permeare la membrana dell'inserto. Aspirare il mezzo in eccesso dall'inserto con una micropipetta.

Quindi pipettare una quantità sufficiente di olio trasparente ai raggi UV sul fondo dell'inserto in modo da coprire completamente l'area. Incubare l'inserto a temperatura ambiente per 15-30 minuti, tempo sufficiente perché l'olio formi uno strato distinto al di sopra del mezzo di polimerizzazione. Per saturare la membrana dell'inserto, caricare una maschera appropriata sul DMD.

Dopo aver posizionato il frammento e il vetrino sotto il DMD, indurre il cross-linking dei peg mediante esposizione alla luce UV. Lavare il frammento tre volte con DPBS sterile e 1% pen strap; dopo il lavaggio, trasferire il frammento in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti, raccogliere e centrifugare le cellule da coltivare. Aspirare il mezzo e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di crescita alla concentrazione desiderata, compresa tra 10⁴ e 10⁶ cellule per millilitro.

Quindi pipettare un volume sufficiente della sospensione cellulare all'interno dell'inserto per colture cellulari per ottenere la densità cellulare desiderata. Aggiungere un quantitativo sufficiente di mezzo di crescita al di sotto dell'inserto per mantenere completamente la vitalità cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica dopo 48 ore di incubazione.

Lavare l'inserimento tre volte con DPBS sterile e 1% penicillina-streptomicina per rimuovere eventuali cellule non aderite. Quindi aggiungere mezzo di crescita fresco nei pozzetti. Reintrodurre la piastra nell'incubatore per colture cellulari ed eseguire il cambio del mezzo ogni 48 ore.

Qui il PEG restrittivo per le cellule è stato polimerizzato come un sottile film utilizzando un modello di prova per aderire selettivamente le cellule dissociate alla membrana rivestita di collagene dei supporti permeabili. Le cellule sono state marcate dopo 48 ore di incubazione. Le cellule vive marcate con calc am appaiono verdi, mentre le cellule morte sono marcate con atherium homodimer uno e appaiono rosse.

Si può osservare che si verifica un minimo ingobbio cellulare nell'area contenente il sottile film di PEG. Questo è un esempio di risultato indesiderato. Una polimerizzazione parziale del PEG ha prodotto una struttura di PEG inutilizzabile.

Una polimerizzazione inadeguata può verificarsi a causa della presenza di un menisco nel mezzo pre-polimerico, quantità insufficienti di polimerizzazione, mezzo insufficiente, esposizione inadeguata ai raggi UV o messa a fuoco impropria dell'ottica. Questo è un esempio di un'inadeguata incapsulazione tridimensionale in idrogel doppio di colture cellulari vegetali A-D-R-G-X. In questa immagine, si può osservare che i neuriti visibili in verde sono riusciti a crescere al di fuori dei canali dei perni strutturati.

Questo si verifica spesso se la matrice pura trabocca sulla porzione di PEG durante l'iniezione. Seguendo questa procedura, altri metodi standard come il patch clamping o l'immunohistochimica possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio l'elettrofisiologia o l'espressione fenotipica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la fotolitografia con proiezione di maschere dinamiche per definire la presentazione geometrica di sistemi ad idrogel singoli o doppi allo scopo di studiare colture cellulari neuronali.