Name: Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Scopri il saggio delle cellule che formano colonie neurali per distinguere le cellule staminali neurali autentiche dalle cellule progenitrici. Questo metodo quantifica accuratamente le cellule staminali in coltura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.

1. Elementi che devono essere preparate prima di procedere alla placcatura Cell: <ol><li> Volume appropriato di completo media NSC è preparata mescolando NeuroCult medio basale NSC e NeuroCult NSC Supplementi proliferazione con un rapporto 9:1, rispettivamente. </li><li> Un'aliquota di NeuroCult NCFC mezzo privo di siero senza citochine è scongelato. </li><li> Il mezzo è riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Soluzioni stock di fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita fibroblastico base (b-FGF) alla concentrazione di 10 mg / ml ed eparina a 0,2% sono preparati in anticipo. </li><li> A seconda delle dimensioni esperimento, 35 millimetri diversi piatti colture di tessuti sono necessari per la piastra di cellule e un piatto 150-200cm plastica Petri è necessario anche per tenere i piatti duplicare 35mm e un piatto terza 35mm per l'acqua. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule: A seconda del vostro esperimento, le cellule possono essere preparati da una fonte adulte o embrionali (primaria del tessuto dissociati o neurosfere dissociato). Sezionare tessuti di adulti / embrionale del mouse sistema nervoso centrale (SNC) o dissociarsi neurosfere adulto / embrionali derivate, come descritto prima 1,2 e poi: <ol><li> La sospensione singola cellula viene fatta passare attraverso un 40-micron di dimensioni filtro a rete in modo da eliminare non dissociati grumi. </li><li> 10μl di sospensione cellulare viene miscelato con 90μl di Blu tripano per eseguire una conta cellulare. Nota: altre diluizioni cella appropriata può anche essere usato. </li><li> Se si utilizza embrionale primario o adulto cellule derivate neurali, diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 6,5 x 10 5 cellule / ml in totale medio NSC. Se si utilizzano le cellule dissociate da neurosfere derivate da cellule neurali adulte o embrionali, diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 2,2 x 10 5 cellule / ml in totale medio NSC. </li></ol> 3. Cellule placcatura in semi-solido N-ACCP Media: <ol><li> Il volume appropriato di seguenti componenti è mescolato in ordine, a seconda del numero di repliche. Qui mescolare la quantità necessaria per due repliche o duplicare i piatti. Per gli altri numeri delle repliche, si prega di fare riferimento alla tabella 1. <ul><li> 1,7 ml di NeuroCult NCFC mezzo privo di siero senza Citochine </li><li> 330 ml di NeuroCult NSC Supplementi proliferazione </li><li> 6,6 ml di EGF (10μg/mL) </li><li> 32 ml di penicillina / streptomicina </li><li> 3,3 ml di b-FGF (10μg/mL) necessaria solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte. </li><li> 3,3 ml di eparina (0,2%) hanno richiesto solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte. </li><li> 25μL di sospensione cellulare (di 2,2 x 10 5 cellule / ml cellule da neurosfere dissociati o 6,5 x 10 5 cellule / ml cellule primarie da dissociato tessuto del SNC). Nota: I numeri di cellulare placcato finale dovrebbe essere circa 2500 cellule per 35 millimetri piatto cultura per neurosfere cellule derivate e 7500 cellule per 35 mm per piatto cultura cellule primarie. In alcuni casi, la densità finale delle cellule placcatura deve essere regolato eseguendo un esperimento di titolazione delle cellule. Per le analisi statistiche, il numero totale di colonie rilevate dopo 21 giorni di cultura dovrebbe essere entro l'intervallo di almeno 50-150 colonie. </li></ul></li><li> Il mezzo che contiene le cellule si mescola delicatamente e poi 1,3 mL di soluzione di collagene freddo è trasferito alla sospensione cellulare e mescolato bene pipettando delicato per evitare l'introduzione di eventuali bolle. </li><li> La soluzione mista è dispensato al centro di ogni piatto cultura 35mm (~ 1,5 ml / piatto) ei piatti sono punta delicatamente con un movimento circolare per lasciare che la miscela diffuse uniformemente sulla superficie del piatto. . </li><li> Il duplicato 35 piatti cultura mm sono poste in un piatto di 100 mm Petri. Il coperchio del piatto nuovo 35 mm è rimosso e il piatto è aperto anche messo nel piatto stessi 100 millimetri Petri. Acqua sterile viene aggiunto a questo open piatto 35 mm a mantenere l'umidità ottimale durante il periodo di incubazione. Piastre di test biologico piazza (245 mm) vengono utilizzati quando più replicare piatti 35 mm sono stati istituiti. Ancora una volta, comprendono 2 o 3 piatti aperta 35 mm contenente acqua sterile. </li><li> Le piastre sono trasferiti in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO2 e il 95% di umidità. Il rapprende collagene da aumento della temperatura e la formazione di gel avverrà entro circa un'ora. Le culture non deve essere disturbato durante questo periodo. </li><li> Cellule coltivate vengono incubate per 21 giorni (differenze di dimensioni della colonia può essere chiaramente distinta dopo 21 giorni). </li></ol> 4. Preparazione media di ricarica e di alimentazione della Cultura: Come N-ACCP culture vengono incubate per un lungo periodo di tempo (21 giorni), le colture devono essere alimentati con il NeuroCult appropriato completo medio di riempimento preparato fresco come segue: <ul><li> 4,5 ml di Medium NeuroCult NSC basale è mescolato con 0,5 mL di NeuroCult NSC Supplementi proliferazione e poi i fattori di crescita si aggiunge: </li><li> 250 microlitri di 10μg/mL EGF (per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mg / ml FEG) </li><li> 125 ml di 10μg/mL b-FGF (per ottenere una concentrazione finale di 0.25μg/mL b-FGF) richiesto solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte. </li><li> 125 ml di eparina 0,2%, necessario solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte. </li><li> 60 ml di Medium appropriato completa Replenishment NeuroCult (per le cellule embrionali o adulte) viene aggiunto al centro di ogni piatto saggio NCFC una volta ogni 7 giorni durante l'incubazione intero NCFC cultura Assay (21 giorni). </li></ul> 5. Punteggio N-CFC Colonie Assay derivati ​​e calcolo della frequenza di bona fide NSCs e cellule progenitrici neurali: <ul><li> Ogni piatto 35 mm è la cultura messo su un piatto punteggio griglia con la dimensione della griglia di 2,0 mm x 2,0 mm e poi entrambi i piatti sono immessi sul palco microscopio. </li><li> Utilizzando bassa potenza (2.5X - 5X) lente dell'obiettivo, ogni piatto viene sottoposto a scansione e le colonie sono segnati in base alle loro dimensioni. </li><li> Le colonie sono classificati in due categorie principali: <ol><li> Meno di 2 mm di diametro </li><li> ≥ 2 mm di diametro </li></ol></li></ul> 6. Rappresentante dei risultati: Come in test neurosfere, le cellule placcato in N-CFC test iniziano a proliferare e fare piccole colonie di cellule entro 3 - 7 giorni dopo la placcatura (Figura 1). Tra due settimane, le colonie di diverse dimensioni si possono distinguere. Mentre la maggior parte delle colonie tendono a smettere di crescere dopo 14 giorni, alcune colonie continuano a crescere di dimensione. Dopo 21 giorni, le colonie possono essere classificati in una delle quattro categorie: 1) meno di 0,5 mm di diametro, 2) 0.5 - 1 mm di diametro, 3) 1 - 2 mm di diametro e 4) ≥ 2 mm di diametro. In pratica, le colonie di dimensioni inferiori a 2 mm di diametro sono indicati come progenitrici derivate (Figura 2) e colonie ≥ 2 millimetri di diametro sono indicati come NSC derivati ​​(Figura 3). Il numero di colonie ≥ 2 millimetri di diametro per cellule totali placcato, rappresenta la frequenza del reale in buona fede le cellule staminali neurali a lungo termine di auto-rinnovamento e multi-potenziali capacità. Le neurosfere totale formando frequenza in una popolazione di cellule particolare dopo 7-8 giorni in un esperimento parallelo NSA è stata stimata essere simile al totale delle colonie che formano la frequenza della popolazione stessa cella dopo 21 giorni in un N-ACCP esperimento. L'N-ACCP tuttavia, costituisce una condizione più permissivo in modo che ogni cellula può mostrare tutto il suo potenziale proliferativo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> 2 si replica </td><td> 3 repliche </td><td> 4 repliche </td></tr><tr><td> NeuroCult NCFC mezzo privo di siero senza Citochine </td><td> 1700 </td><td> 2550 </td><td> 3400 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferazione Supplementi </td><td> 330 </td><td> 495 </td><td> 660 </td></tr><tr><td> EGF (10 mg / ml) </td><td> 6,6 </td><td> 9,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> bFGF (10 mg / ml), solo per le cellule adulte </td><td> 3,3 </td><td> 4,95 </td><td> 6,6 </td></tr><tr><td> Soluzione di eparina (0,2%), solo per le cellule adulte </td><td> 3,3 </td><td> 4,95 </td><td> 6,6 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (1:100) </td><td> 32 </td><td> 48 </td><td> 64 </td></tr><tr><td> Celle a: 2,2 x 10 5 colture di cellule / ml O 6,5 x 10 5 cellule primarie / mL </td><td> 25 </td><td> 37,5 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Collagene Soluzione </td><td> 1300 </td><td> 1950 </td><td> 2600 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Componenti di completo N-CFC cultura test. <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Colonie Rappresentante in N-ACCP cultura di passaggio uno E14 NSCs del mouse 7 giorni dalla placcatura. Le colonie potrebbe visualizzare la morfologia e dimensioni diverse. Originale ingrandimento; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Colonie progenitrici derivate rappresentante di diverse dimensioni in N-ACCP cultura di passaggio del mouse uno E14 NSCs 21 giorni dopo placcatura. Come si vede, le colonie hanno una morfologia diversa, ma tutti sono 2 mm in meno di dimensione. Originale ingrandimento; 4x <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Rappresentante Figura 3. Bona fide di cellule staminali derivate colonia in N-ACCP cultura di passaggio del mouse uno E14 NSCs 21 giorni dopo placcatura. Colonie di cellule staminali potrebbe visualizzare diversa morfologia (vediil video) ma tutti sono ≥ 2 millimetri di diametro. Originale ingrandimento; 4x

<ol><li>Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22%5BJournal%5D)">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li>
</ol>

Uno degli autori, Louis A. Sharon, è affiliata con StemCell Technologies Inc, produttore di alcuni reagenti usati in questo studio.

Sebbene saggio neurosfere 3,1,2 è il metodo più comune per isolare ed espandere cellule staminali neurali da una varietà di fonti come adulto che embrionale del tessuto nervoso centrale, non può misurare con precisione la frequenza di NSC in una popolazione mista di cellule precursori neurali (staminali e progenitori), come non c&#39;è una relazione uno a uno tra il numero di neurosfere e il numero di cellule staminali in buona fede 4. Per far fronte a questa limitazione, l&#39;originale NSA è stato adattato in modo da consentire il staminali neurali e cellule progenitrici di crescere la loro capacità di proliferazione pieno per tre settimane 5-7. A differenza del liquido NSA, in N-ACCP le colonie sono in realtà clonale derivati, come il semi-solida matrice di collagene impedisce la migrazione delle cellule singole placcato e l&#39;aggregazione delle colonie. Per ottenere risultati coerenti con questa analisi si consiglia: <ol><li> Garantire una sospensione singola cella della sospensione cellulare originale. Far passare la sospensione singola cellula con un 40-micron di dimensioni filtro a rete in modo da eliminare non dissociati grumi. </li><li> Conservare la soluzione di collagene su ghiaccio o in frigorifero C ° +4. Il collagene è l&#39;ultimo elemento da aggiungere alla miscela di sospensione cellulare come si congela aumentando la temperatura. </li><li> Non dimenticare di alimentare la cultura ogni settimana. Aggiunta del supporto di rifornimento che contiene il fattore di crescita (s) una volta ogni 7 giorni permette alle cellule di continuare a proliferare nel lungo periodo la cultura. </li><li> La densità finale delle cellule placcatura sono stati ottimizzati per le cellule derivate da cellule neurali primarie o coltivate in modo che il numero totale di colonie rilevate dopo 21 giorni di cultura nel NCFC-A è nel range di almeno 50-200 colonie. Questa gamma permette di individuare le rare colonie NSC derivati&gt; 2mm di diametro, in campioni, fornendo un numero sufficiente di colonie per analisi statistiche. A seconda della sorgente di cellule di partenza, un numero significativamente inferiore (&lt;50) e un numero maggiore di colonie (&gt; 250) sono a volte ottenuti. Colonie troppo pochi comporterà l&#39;&gt; colonie 2mm di diametro al di sotto dei livelli di rilevamento, mentre le colonie troppi si tradurrà in anddepletion sovraffollamento dei componenti mezzo di crescita con un conseguente conteggio delle colonie inesatte. Pertanto la densità delle cellule placcatura dovranno essere adeguati di conseguenza (cioè aumentando o diminuendo il numero totale di cellule placcato) </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Mezzo basale NeuroCult NSC</td><td>Mezzo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>Supplementi per la proliferazione NeuroCult NSC</td><td>Supplemento per mezzo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo NeuroCult NCFC</td><td>Mezzo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05720</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina da soia</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>Setaccio</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Flacone T25</td><td>Attrezzatura per colture</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>Flacone T80</td><td>Attrezzatura per colture</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>Collagene</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Fattore di crescita</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Fattore di crescita</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Fattore di crescita</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>Ricostituita in PBS</td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>Attrezzatura per colture</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>Attrezzatura per colture</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 35 mm</td><td>Attrezzatura per colture</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27100</td><td></td></tr><tr><td>Piastre graduate per valutazione</td><td>Attrezzatura per colture</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr></tbody></table>

neural-formanti colonia saggio cell: un test per discriminare bona fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Il test neurosfere (NSA) è uno dei metodi più frequentemente utilizzati per isolare, espandere e anche calcolare la frequenza di cellule staminali neurali (NSC). Inoltre, questo siero privo di sistema di coltura è stato utilizzato per espandere le cellule staminali e determinare la loro frequenza da una varietà di tumori e tessuti normali. E &#39;stato dimostrato recentemente che uno-a-uno non esiste tra formazione neurosfere e NSC. Questo suggerisce che la NSA come attualmente applicato, sovrastima la frequenza di NSCs in una popolazione mista di cellule precursori neurali isolate dal cervello sia embrionali che adulte dei mammiferi. Questo video dimostra praticamente un romanzo a base di collagene semi-solido saggio, il neuro-formanti colonia test delle cellule (N-ACCP), che ha la capacità di discriminare staminali da cellule progenitrici in base al loro lungo termine potenziale proliferativo e, quindi, fornisce un metodo per enumerare frequenza NSC. Nella N-ACCP, colonie ≥ 2 mm di diametro sono derivati ​​da celle che soddisfano tutti i criteri funzionali di NSC, mentre le colonie &lt;2mm sono derivati ​​da progenitori. L&#39;N-ACCP procedura può essere utilizzata per le cellule preparate da fonti diverse tra cui adulti primarie e colta o embrionali sistema nervoso centrale del mouse cellule. Qui usiamo le cellule preparate dal passaggio uno neurosfere generato dal primo giorno 14 embrionale del cervello nei topi per eseguire N-ACCP. Le culture sono rifornito con la proliferazione di media ogni sette giorni per tre settimane per consentire alle cellule placcato ad esporre il loro pieno potenziale proliferativo e quindi la frequenza delle progenitrici neurali e in buona fede le cellule staminali neurali è calcolato rispettivamente contando il numero di colonie che sono &lt;2mm e quelli che sono ≥ 2 millimetri in riferimento al numero di cellule che sono stati inizialmente placcato.

Questo protocollo video viene illustrato come discriminare ed enumerare in buona fede le cellule staminali neurali in una popolazione mista di cellule precursori neurali utilizzando il neurali che formano colonie test cell.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

Il saggio delle neurosfere (NSA) è uno dei metodi più frequentemente utilizzati per isolare, espandere e calcolare la frequenza delle cellule staminali neurali (NSC). ...

Lo scopo di questo articolo video è dimostrare come quantificare la frequenza di cellule staminali neurali autentiche in una popolazione mista di cellule precursori neurali utilizzando il saggio di formazione di colonie neurali. Questo saggio può essere impiegato per cellule precursori neurali primarie o coltivate, ottenute dal SNC adulto o embrionale. Le cellule singole vengono seminate a una densità appropriata e successivamente incubate per tre settimane in un incubatore a 37 gradi.La frequenza di progenitori neurali e di cellule staminali neurali vere e proprie viene calcolata rispettivamente contando il numero di colonie di dimensioni inferiori a due millimetri e di dimensioni maggiori o uguali a due millimetri. L'utilizzo del saggio con scala neuros per determinare la frequenza delle cellule staminali neurali vere e proprie in una popolazione cellulare neurale mista sovrastima il numero di cellule staminali neurali, poiché non esiste una relazione uno-a-uno tra la formazione di neurosfere e le cellule staminali neurali. Nel nostro laboratorio abbiamo sviluppato il saggio di colonie neurali per cellule miste.Per superare questa limitazione, questo saggio può facilmente discriminare le vere cellule staminali neurali dalle cellule progenitrici in base al potenziale proliferativo a lungo termine. Oggi vi mostriamo come utilizzare questo saggio basato su collagene semisolido per enumerare la frequenza delle cellule staminali neurali. Le cellule sono state preparate da neurosfere dissociate provenienti da schermo E 14 mile.Ok, iniziamo. Per questo saggio, abbiamo bisogno di proliferazione di cellule staminali neurali, integratore per mezzo basale per saggio di formazione di colonie da cellule staminali neurali, mezzo privo di siero e pipetta al collagene; aggiungere un ml di mezzo completo per cellule staminali neurali in un tubo falcon da 15 ml. Prelevare il volume necessario dalla sospensione cellulare già preparata e filtrare attraverso un filtro mesh da 40 micron, al fine di ottenere una concentrazione di 2,2 × 10⁵ cellule per ml. Piastrare le cellule in duplicato.In 2 piatti di coltura da 35 millimetri. Mescolare 1,7 ml di mezzo privo di siero per saggio di cellule formanti colonie neurali NeuroCult senza citochine con 30 microlitri di integratore per la proliferazione di cellule staminali neurali NeuroCult. Aggiungere quindi 6,6 microlitri di EGF e 32 microlitri di penicillina-streptomicina.Aggiungere 25 microlitri di sospensione cellulare al mezzo preparato. Aggiungere 1,3 ml di soluzione fredda di collagene alla sospensione cellulare e mescolare bene, ma delicatamente, per evitare di introdurre bolle d'aria. Quindi distribuire la soluzione mescolata al centro di ogni piastra da coltura, circa 1,5 ml per piastra, e lasciare che la miscela si espanda uniformemente sulla superficie della piastra.Si aggiungono tre ml di acqua sterile a una piastra aperta da 35 millimetri posizionata accanto alle piastre di coltura nella piastra di Petri grande. Questo aiuta a mantenere un'umidità ottimale durante il periodo di incubazione. Etichettare la piastra e trasferirla in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità.È importante non disturbare la coltura durante le prime ore affinché il collagene possa coagulare e sostenere la formazione della colonia neurale nel saggio di coltura. Prelevare 200 microlitri di mezzo completo per cellule staminali neurali e aggiungere 10 microlitri di EGF a una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro. Aggiungere 60 microlitri di mezzo completo di rinnovo neuroco al centro di ogni piastra una volta ogni sette giorni per tutto il periodo di incubazione.Ogni piastra di coltura viene posizionata su una piastra di valutazione con una griglia di dimensioni due millimetri per due millimetri, quindi viene posta sul tavolino del microscopio utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento. Ogni piastra viene esaminata e le colonie vengono valutate in base alle loro dimensioni. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi del saggio al termine della prima settimana.In questo momento temporale, le colonie derivate da cellule staminali neurali e da cellule progenitrici sono indistinguibili. Dopo tre settimane, le colonie possono essere classificate in due categorie principali: quelle con un diametro inferiore a due millimetri, derivate da cellule progenitrici, e quelle con un diametro maggiore o uguale a due millimetri, derivate da cellule staminali. Le colonie con un diametro maggiore o uguale a due millimetri soddisfano tutti i criteri funzionali per essere considerate autentiche cellule staminali neurali all'interno della colonia.La piastratura delle cellule per il saggio di formazione delle colonie con una densità appropriata è molto importante. Avere troppo poche colonie mantiene le rare colonie di cellule staminali neurali al di sotto dei livelli di rilevamento. D'altra parte, un numero eccessivo di colonie provocherà sovraffollamento e carenza di componenti essenziali del mezzo.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

neural-colony-forming-cell-assay-an-assay-to-discriminate-bona-fide

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

La colonia di cellule che formano (CFC) test è un test in vitro in cui progenitori emopoietici formare colonie in terreno semisolido. Una combinazione di morfologia delle colonie, la morfologia delle cellule, e citometria a flusso sono utilizzati per valutare la capacità dei progenitori di proliferare e differenziarsi lungo le varie linee ematopoietiche.

Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche

Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Un tridimensionale test clonogenica che permette pancreatico-come progenitori di differenziarsi in insulino-colonie che esprimono è descritto. Questo metodo si avvale di semi-solidi supporti contenenti fattori di metilcellulosa, Matrigel e di crescita, in cui progenitori singolo proliferare e...

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Questo video mostra il saggio di migrazione della neurosfera delle cellule precursori neurali, un test in vitro per studiare la risposta migratoria delle cellule precursori neurali della neurosfera, tramite analisi microscopica.

Saggio della neurosfera NPC: un test in vitro per valutare la risposta migratoria delle cellule precursori neurali della neurosfera

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Il midollo spinale adulto dei mammiferi contiene cellule staminali/progenitrici neurali (NSPC) che possono essere isolate ed espanse in coltura. Questo protocollo descrive la raccolta, l'isolamento, la coltura e il passaggio di NSPC generate dalla regione periventricolare del midollo spinale adulto dal ratto e da donatori di trapianto di organi umani.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Le cellule staminali neurali (NSC) si riferiscono alle cellule che possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tre linee neurali. Qui, descriviamo un protocollo per determinare la frequenza NSC in una data popolazione di cellule utilizzando neurosfere formazione e la differenziazione in condizioni clonali.

Conteggio di cellule staminali neurali L&#39;utilizzo clonali Assays

Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Questo protocollo sperimentale fornisce un metodo stabile, economico ed efficiente che combina il knockdown dell'inncRNA con saggi formatori di colonie per quantificare l'effetto dell'inncRNA sulla proliferazione cellulare dell'osteosarcoma.

Test di formazione di colonie che rileva la capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma knockdown di RNA LncRNA

Questo protocollo delinea una procedura per indurre la differenziazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane derivate dal midollo osseo del paziente e dalle cellule mononucleari del sangue periferico. Il test utilizza un mezzo di coltura semisolida che supporta l'impegno della linea eritroide e mieloide e incorpora metriche standardizzate per la classificazione delle colonie riproducibili per la caratterizzazione preclinica dei farmaci.

Test unitario formativo di colonie adattato per cellule mononucleari derivate dal paziente nel midollo osseo e nel sangue periferico

Scopri il saggio delle cellule che formano colonie neurali per distinguere le cellule staminali neurali autentiche dalle cellule progenitrici. Questo metodo quantifica accuratamente le cellule staminali in coltura.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali (Video) | JoVE Journal

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

Esplora altri video