Name: Elettrofisiologia di Scorpion Peg sensilli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Impara la tecnica di registrazione extracellulare a punta per studiare la fisiologia chemiosensoriale dei sensilli peg degli scorpioni. Questo metodo permette di isolare la stimolazione chimica a singoli sensilli.

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Ringraziamo il fondo di Vita, Università di Oklahoma Undergraduate Research Program Opportunità, e il Dipartimento di Zoologia per finanziare questo lavoro. Ringraziamo anche il Dott. Hoefnagels Marielle aiuto editoriale.

1. Pre-registrazione, di preparazione degli animali dal vivo <ol><li> Rimuovere lo scorpione dalla sua casa vaso e metterlo in un pre-raffreddata contenitore di vetro; prossimo, posizionare il vaso contenente lo scorpione in un ambiente freddo (-5 ° C) per un minimo di due minuti. Questo tempo può variare a seconda dell&#39;età, le dimensioni, specie, ecc scorpione dello specifico oggetto di studio. Ma in generale, la fase di congelamento ambiente è completo una volta che l&#39;animale è immobile. </li><li> Dopo due minuti, togliere il immobilizzato scorpione del contenitore in vetro freddo, e posizionarlo lato ventrale su un vetrino da microscopio. Fissare il pungiglione, la coda, le gambe e pedipalpi con argilla modellabile (a base di olio, Van Aken Plastalina). </li><li> Fai una piattaforma su cui mettere le scorpione pectine. Regolare la lunghezza della piattaforma e la larghezza in base alle dimensioni del pecten. Tipicamente, le nostre piattaforme sono costruite in vetro microscopio copertura e sono circa 10 (L) x 18 (W) mm. </li><li> Aderire a doppia faccia nastro adesivo alla piattaforma pecten, taglio del nastro (se necessario) per adattarsi. </li><li> Per effettuare una camera pectinal, mettere tre dei quattro lati piattaforma in pre-cera fusa (usiamo chip di cera d&#39;api 100%) ad una profondità di 3-4 mm. Noi sciogliere la cera mettendo il chip all&#39;interno di un piatto di vetro di Petri, che si trova su un piatto caldo. Una volta che la cera sui bordi della camera pectinal viene raffreddato a temperatura ambiente, questo dovrebbe creare muri di cera di circa 1 mm di altezza. </li><li> Sull&#39;animale, individuare il punto di inserimento pectinal, e posto il non-cerata bordo della piattaforma (lato nastro-up) appena posteriormente ad essa. In seguito, stabilizzare la piattaforma (in modo che non si sposta più avanti) premendo delicatamente la sua destra e di sinistra bordi periferici contro l&#39;argilla utilizzata per contenere le gambe dell&#39;animale. </li><li> Usa punta sottile pinzetta per posizionare accuratamente il pecten o pectine all&#39;interno della camera. In particolare, utilizzando pinze, tenere premuto il pecten lungo la spina dorsale pectinal, e delicatamente portare i pecten fuori da sotto il vetro di copertura e abbassarlo sul pavimento della piattaforma adesivo. Stabilire un pecten-to-tape legame con attenzione pressione sulla colonna vertebrale pectinal. </li><li> Ora applicare cera fusa (usiamo un pre-riscaldato spatola metallica) per il non-cerata bordo della piattaforma. Lo scopo è duplice, per fissare il pecten e da includere completamente la camera per la futura introduzione di olio minerale. Prestare attenzione quando si applica la cera sopra pecten dell&#39;animale, in quanto è possibile danneggiare il pettine con la cera che è troppo caldo. </li><li> La costruzione della camera pecten è completa. Quindi, stabilire una connessione con elettrodo indifferente emolinfa dell&#39;animale inserendo un filo d&#39;argento tra due segmenti della coda. </li></ol> 2. Registrazione simultanea extracellulare e stimolazione chimica <ol><li> Prepariamo le 24 h animale prima di effettuare extracellulare, in punta di registrazioni, che, tra le altre ragioni (regolazione animale cioè in posizione fissa), permette ora di fare su misura pipette stimolante di uno specifico (sensillum-dipendente) in punta di diametro. Usiamo un estrattore micropipetta per raggiungere tali specifiche. Idealmente, il diametro delle pipette è ≈ 2 micron più grande del diametro dei pori sensillar. Noi regolare le nostre specifiche micropipetta di conseguenza per ogni animale. </li><li> 1 prima registrazione h, si aggiungono 5 ml di olio minerale per la camera pectinal, sommergendo il pecten sott&#39;olio. Poi, abbiamo la posizione dell&#39;animale sotto un potente microscopio, che da tempo gli obiettivi di lavoro a distanza e epi-illuminazione. </li><li> Per stimolare chimicamente piolo sensilli, introduciamo tastants acquosa (es. acido citrico e sale) per mezzo di olio. In primo luogo, si usa un riempitivo micropipetta per iniettare il stimolante nella pipetta stimolante. Nota: tutte le soluzioni stimolante dovrebbe contenere un elettrolita per la conduttanza elettrica. </li><li> Successivamente, dopo aver posizionato la pipetta stimolante su un micromanipolatore (nella registrazione rig), inserire l&#39;elettrodo di registrazione nel smussato, estremità aperta della pipetta stimolante. E &#39;importante per assicurare il contatto tra l&#39;elettrodo metallico e la soluzione stimolante elettrolitico. </li><li> Una volta che la preparazione è a massa (tramite l&#39;elettrodo indifferente), abbasseranno la pipetta attraverso il mezzo del petrolio e su un poro sensillar. La durata della stimolazione chimica per sensillum pectinal può variare da fino a trenta minuti per non più di un secondo. In generale, possiamo campione spine multiple (&gt; 30) per ogni pipetta. Nel caso in cui la pipetta stimolante si intasa di detriti minuti, semplicemente scambiare la pipetta intasato per un nuovo, pipetta inutilizzato. </li></ol> 3. Preparazione di un animale per più giorni di sperimentazione <ol><li> Se l&#39;animale deve essere usato per un periodo di tempo prolungato, si consiglia di riutilizzare la camera pectinal e sostituendo la goccia di olio minerale per ogni sessione di registrazione. Dopo la sessione di registrazione di un dato giorno, rimuovere l&#39;animale dalla registrazione di set-up ed effettuare un lavaggio con olio minerale. </li><li> Specifically, aggiungere un&#39;altra goccia (5 mL) di olio minerale per la camera, e rimuovere tutto l&#39;olio. Questo aiuta a minimizzare la presenza di residui stimolante, che può avere trapelato della pipetta durante la sessione di registrazione. </li><li> Prima della prossima sessione, aggiungere una goccia di olio, come descritto in precedenza. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: A seconda dell&#39;apparecchio di controllo utilizzato (ad esempio l&#39;amplificatore particolare, la digitalizzazione di hardware, ecc), un risultato rappresentativo è una registrazione extracellulare con un S: rapporto N di almeno 3:1. Costruzione di successo della camera di olio minerale è necessario per isolare stimolazione chimica per sensilli singoli, in quanto fornisce un mezzo per la distribuzione di tastants chimici polari (a base d&#39;acqua) 8. Se c&#39;è l&#39;olio troppo poco o niente, la soluzione stimolante si diffonderà dal sensillum registrato al suo sensilli vicini, che rischia di causare un prolungato attacco incontrollata di stimolazione chimica 8.

<ol><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+Primary+Chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a Primary Chemoreceptor unit.</a> Science. 12, 417-418 (1955).</li>
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<li>Cate, H. S., Derby, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooded+Sensilla+Homologues%3A+Structural+Variations+of+a+Widely+Distributed+Bimodal+Chemomechanosensillum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum.</a> J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).</li>
</ol>

Abbiamo già pubblicato questi metodi in due riviste, Knowlton e Gaffin (2009) e Knowlton e Gaffin (in stampa).

Il protocollo sopra descritto come preparare un deserto prateria scorpione (Paruroctonus utahensis) per lo studio elettrofisiologico. In particolare, si mostra come costruire una camera di controllo extracellulare punta-registrazioni di pectinal neuroni chemosensoriali sott&#39;olio. Perché l&#39;olio e l&#39;acqua non si mescolano, è possibile isolare stimolazione chimica (con acqua a base di stimolanti) per sensilli singoli. Va sottolineato che P. utahensis, è un animale relativamente piccolo (≈ 2,5-5 cm) e l&#39;applicazione di questo protocollo per animali più grandi dimensioni possono richiedere un aggiustamento molti, come le dimensioni della piattaforma dell&#39;animale, da camera, e la quantità di olio applicato. Si consiglia la realizzazione di studi pilota per testare la minima quantità di olio necessario per la consegna controllata a base d&#39;acqua stimolanti chimici. Inoltre, abbiamo riscontrato alcun effetto di olio sulla linea di base dell&#39;attività neurale all&#39;interno pectinal sensilli 8. Questo dovrebbe essere confermata per sistemi modello anche altri, prima di valutare chemoresponsiveness. Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con un altro metodo per testare gli effetti di interazione tra chemoresponse sensilli nel campo sensoriale. Per esempio, è possibile punta di record (in olio) da un sensillum come base-record (tramite un elettrodo di tungsteno) da un sensillum vicina 9. Tale configurazione di registrazione possono essere utilizzati per valutare anche di costituzione chimica stimolante sensillum influenza l&#39;attività neurale della base-registrato sensillum. Ad oggi, nessuno ha testato questa per pectinal sensilli scorpione, e resta una questione aperta per gli altri sistemi chemosensoriali pure. Per riassumere, pensiamo che la punta di registrazione metodo del petrolio sotto i progressi nel campo di applicazione indagini elettrofisiologiche nelle basi neurali di gustazione artropodi. In questo manoscritto, mettiamo a disposizione un protocollo per la preparazione degli animali per questo metodo, e speriamo che fornisce una solida base per ulteriori studi di sistemi sensoriali nervoso periferico.

<table><tbody><tr><td>Scheda Lift-N-Press</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16082</td><td>Adesivo bifacciale</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G</td><td>Pipettatore per micropipette</td></tr><tr><td>Capillari in vetro standard</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-6</td><td>Pipette di vetro</td></tr><tr><td>Portaelettrodo micr&amp;#8211;lettrico</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3SBW10</td><td></td></tr></tbody></table>

elettrofisiologia di scorpion peg sensilli

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

Descriviamo una modifica di una esistente punta-registrazione 1,2 tecnica elettrofisiologico per indagare breve, come il peg-sensoriale sensilli 3,4. Sulla revisione a medio ventrale superficie di tutti gli scorpioni sono due appendici chiamate pectine, che hanno campi densi di meccano-e chemosensoriali peg sensilli 5,6. Un metodo per la valutazione chemoresponsiveness di questi sensilli utilizza un elettrodo di tungsteno per extracellulare registrare l&#39;attività neurale all&#39;interno di un sensillum come odorizzante volatile è introdotto nel campo sensoriale 5,7. I limiti di questo metodo sono lento i dati raccolti e stimolante introduzione incontrollata di, e la rimozione da, il campo piolo. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato una nuova punta-registrazione tecnica che utilizza l&#39;olio minerale non polare come un mezzo attraverso il quale fornire a base d&#39;acqua tastants a singoli peg sensilli 8,9. Noi abbiamo applicato con successo questo metodo per ottenere chemoresponses sensillar di acido citrico, etanolo, e sale. Qui descriviamo il protocollo sperimentale per uno studio 9. Pensiamo che questo nuovo metodo può essere utile per lo studio delle proprietà di risposta di altri sistemi artropodi chemosensoriali, compresi quelli degli insetti 10, 11 e crostacei 12.

Questo articolo descrive un metodo per isolare elettrofisiologico stimolazione chimica per i singoli sensilli via extracellulare, in punta di registrazioni in olio minerale.

Elettrofisiologia di Scorpion Peg sensilli

Descriviamo una modifica di un'esistente tecnica di registrazione con punta1,2 per l'indagine elettrofisiologica di sensilli sensoriali brevi e a forma di piolo3,4. Su...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la fisiologia chemosensoriale di singole peg illa presenti sul pectine di uno scorpione. Questo viene ottenuto immobilizzando innanzitutto uno scorpione anestetizzato con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vetrino. Utilizzando argilla modellabile, l'allestimento richiede l'immersione dei pectini in una camera appositamente realizzata riempita di olio e la preparazione di elettrodi riempiti con uno stimolante chimico.Le risposte chemosensoriali vengono registrate a livello di singole illa sul pettine, che alla fine producono profili di risposta simili a quelli dei chemostimolanti acquosi. Abbiamo utilizzato la registrazione alla base delle illa soffiando stimolanti volatili attraverso i pori. Il vantaggio principale della tecnica di registrazione alla punta è che consente di isolare lo stimolo a un singolo centino senza influenzare l'attività dei centini adiacenti.Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia chemosensoriale, ad esempio: perché gli animali utilizzano così tanti silli ripetuti nella rilevazione e nella percezione chimica? Gli scorpioni potrebbero non sembrare gli animali più sicuri da studiare, tuttavia, non tutte le specie sono pericolose o difficili da gestire. Ad esempio, gli scorpioni delle praterie desertiche sono lunghi solo quattro-cinque centimetri, sono facili da mantenere in laboratorio e raramente pungono se manipolati correttamente.Se punto, il veleno attiva artificialmente i neuroni sensoriali, alcuni dei quali trasmettono informazioni relative al dolore. La sensazione di solito si attenua dopo circa 15 minuti. Gli scorpioni sono soggetti resistenti e possono sopportare diversi giorni di sperimentazione, spesso venendo restituiti ai loro alloggi.Al termine dell'esperimento, per immobilizzare lo scorpione, riporlo in un contenitore di vetro precedentemente raffreddato. Successivamente, mettere il barattolo contenente lo scorpione in un ambiente congelante per almeno due minuti ed estrarlo dal congelatore quando l'animale è immobile. A questo punto, posizionare lo scorpione immobilizzato con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vetrino per microscopio.Fissare le zampe della coda dell'aculeo e i pedipalpi con argilla modellabile. I pettini dello scorpione sono strutture accoppiate simili a pettini, situate vicino agli organi sessuali, ed sono unici di questi animali. È necessario creare una camera per contenere un singolo pettine senza rimuoverlo dall'animale.Per prima cosa, preparare una piattaforma per la pectina da adattare a un'ampolla di vetro ritagliata a circa cinque millimetri per 18 millimetri. Di solito funziona bene. In secondo luogo, applicare nastro adesivo doppia faccia sulla piattaforma e tagliare il nastro per adattarlo, se necessario.In terzo luogo, sciogliere alcune scaglie di cera d'api al 100% in un contenitore di vetro utilizzando una piastra riscaldante. Immergere ora tre dei quattro bordi della piattaforma nella cera fusa fino a una profondità di tre-quattro millimetri. La cera raffreddata funge da parete per formare una camera.Ora, posizionare il bordo non fissato della piattaforma appena posteriormente al punto di inserzione della pinna pettorale sull'animale. Stabilizzare la piattaforma premendo delicatamente i suoi bordi periferici destro e sinistro contro l'argilla utilizzata per immobilizzare le zampe dell'animale, usando pinzette a punta fine. Tenere con cura una delle pettine lungo la spina pettorale e sollevarla delicatamente da sotto il vetrino, quindi abbassarla sul fondo adesivo della piattaforma.Fissare la pectina applicando con attenzione pressione sulla spina pettinale. Completare la camera utilizzando una spatola metallica preriscaldata per applicare cera fusa sul bordo libero della piattaforma. L'animale è ora quasi pronto per effettuare registrazioni di elettrofisiologia.Ora è un momento semplice per creare un collegamento con un elettrodo indifferente. Inserire un filo di argento tra due segmenti della coda nell'emolinfa dello scorpione. Premere una parte del filo che esce dall'animale nell'argilla per fissarlo, lasciando una lunghezza sufficiente da raggiungere l'amplificatore.Ora mettere da parte il preparato per almeno un'ora prima di effettuare le registrazioni, in modo da permettere al preparato di stabilizzarsi. Utilizzare un estrattore di micropipette per fabbricare pipette con un diametro interno di circa due micron superiore al diametro del poro del sensore, il quale varia da animale ad animale. Un'ora prima della registrazione, riempire la camera di pectina con cinque microlitri di olio minerale.Quindi posizionare l'animale al di sotto del microscopio ad alta potenza dotato di obiettivi con lunga distanza lavorativa e illuminazione epi per stimolare chimicamente il peg illa. Caricare la pipetta dello stimolante con sapori acquosi mescolati in una soluzione elettrolitica. Utilizzando un riempitore per micropipette, quindi collegare la pipetta dello stimolante caricata a un micromanipolatore.Inserire ora l'elettrodo di registrazione nell'estremit&agrave; aperta della pipetta dello stimolante. &Egrave; importante assicurare il contatto tra l'elettrodo metallico e la soluzione elettrolitica dello stimolante. Collegare i cavi degli elettrodi di registrazione e indifferente a un amplificatore differenziale.L'amplificatore è collegato a un oscilloscopio per visualizzare l'attività elettrica e a un altoparlante per rilevare in modo udibile il cambiamento elettrico. L'allestimento è ora pronto per effettuare le registrazioni. Utilizzando il micromanipolatore, abbassare con attenzione la pipetta su un poro sensoriale.Un cambiamento verso frequenze più elevate sarà percepito quando viene stabilito il contatto elettrico tra l'elettrolita della pipetta e il fluido all'interno del peg sens. In questo momento si potranno inoltre udire chiaramente gli scoppi caratteristici dei potenziali d'azione neurali. La durata della stimolazione chimica per ogni sens perpetuo può variare da un massimo di 30 minuti a un minimo di un secondo.Generalmente, una pipetta può prelevare da più di 30 perni. Sostituire le pipette intasate con pipette pulite. Le pipette sono facili da preparare e l'intasamento non è raro, quindi tenere sempre a disposizione pipette di riserva.È possibile effettuare la registrazione da un singolo animale per diverse ore in una singola sessione prima di dover sostituire l'olio minerale. Un singolo animale può essere mantenuto in posizione nell'apparato di registrazione per più sessioni di registrazione in diversi giorni consecutivi. Per le sessioni successive, riutilizzare la camera pettorale, ma sostituire l'olio minerale.Rimuovere semplicemente tutto l'olio vecchio con una pipetta e aggiungere una goccia fresca. Questo aiuta a minimizzare la presenza di stimolante residuo, che potrebbe essersi disperso dalla pipetta dello stimolante durante la sessione di registrazione. Di seguito sono riportate registrazioni rappresentative delle punte in risposta a diversi stimolanti.Questo tracciato mostra una risposta relativamente costante a cloruro di potassio 0,01 M. Questo picco mostra una risposta all'acido citrico 0,1 M che inizia molto intensamente, per poi attenuarsi in intensità nell'arco di una frazione di secondo, seguita da una certa diminuzione in frequenza. In una risposta tipica all'etanolo al 30%, il tracciato mostra scariche con multipli picchi intervallati da brevi pause di inattività. Quando si confrontano le registrazioni apicali delle risposte di diversi sensori allo stesso stimolo, come l'acido citrico 0,1 M.Le risposte sono molto simili. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di riempire la pipetta con uno stimolante a base acquosa, che non si mescola con il mezzo oleoso e consente di stimolare chimicamente un lum alla volta. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stimolare in modo controllato singoli CIN su un pectine di scorpione utilizzando l'olio minerale come mezzo.

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