Mappatura e applicazione di Enhancer-trappola Espressione Flippase in larvali e adulti Drosophila SNC

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di affinare l'espressione di GAL four attraverso l'uso di lipasi tessuto-specifica con strumenti di conversione GAL 80. Ciò si ottiene generando una collezione di linee di mosche transgeniche Philippe con trappola enhancer e determinando il modello di espressione della lipasi nel SNC in ciascuna linea. Utilizzando un reporter GFP, IMMUNOCHEMISTRY e GFP reports possono differenziare GL dall'espressione neuronale per intersecare l'espressione di GAL quattro nelle linee di interesse ET flip lines across the moscerini contenenti uno strumento di conversione GAL 80 nella progenie.

L'analisi clonale può essere utilizzata per analizzare l'affinamento dell'espressione di GAL four, ad esempio nell'occhio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le linee basate sul gioco delle tracce di potenziamento insieme agli strumenti di conversione GAL 80 possono essere utilizzati con una rapida raccolta di GAL four alliance già disponibili nella comunità delle mosche. Inoltre, questo concetto può essere esteso ad altri organismi modello emergenti GALI four UAS come il pesce zebra.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella mappatura dei circuiti neurali alla base del comportamento. Sebbene questo protocollo dimostri l'uso della base flip in un sottoinsieme di cellule fotorecettrici, il metodo intersezionale può essere applicato all'analisi di altri tessuti, compresi i tessuti non neuronali. Come più enhancer trappola linee di lipasi sono caratterizzate.

La gotta 4 ecografia è una tecnica importante ampiamente utilizzata dai biologi delle mosche. Un avvertimento della maggior parte delle quattro linee GAL è quello espresso in modo troppo ampio per essere utilizzato per la mappatura del comportamento cerebrale utilizzando i metodi delle dita. Non è possibile regolare con precisione l'espressione di quattro GAL nelle magliette di interesse Prima di utilizzare un transgene di inversione ET per limitare parzialmente l'espressione di quattro linee di espressione di GAL.

È innanzitutto utile conoscere il modello di espressione del transgene ET flip x two nella lava in fase avanzata di sviluppo e negli adulti visualizzare l'espressione di flip a Nel SNC impostare un incrocio tra i maschi con il transgene ET t flip X two di interesse e le femmine vergini che ospitano un reporter GFP per l'espressione di et flip dalla progenie. Raccogli le larve vaganti del terzo stadio F1 per la dissezione. Mettili in un piatto di protezione S pulito e rimuovi eventuali detriti con un pennello e risciacqua il piatto una volta con una volta PBS.

Ora riempi il piatto con ghiaccio freddo una volta PBS per anestetizzare le larve per accedere al SNC di una lava tenere il gancio della bocca con un paio di pinze. Afferra la cuticola vicino alla sferica anteriore che si estende e staccala indietro. Il SNC rimane attaccato al gancio della bocca insieme ad alcune altre strutture.

Ora con il forcipe, rimuovi tutte quelle strutture in eccesso che circondano il SNC mentre sezioni il SNC. Trasferiscili singolarmente in un piatto di Pyrex a tre mondi riempito di PBS. Una volta sezionati tutti i SNC, fissali immergendoli completamente in 200 microlitri di PFA al 4% su ghiaccio.

Se un SNC galleggia, non è stato completamente pulito da tutto il tessuto circostante. In tal caso, utilizzare un paio di pinze per immergere nuovamente il SNC nel fissativo dopo il fissaggio per 15 minuti, lavare il fazzoletto con PB S3 ghiacciato volte e quindi lavare il fazzoletto altre tre volte in PBT ghiacciato. Il tessuto è ora pronto per essere visualizzato o marcato con anticorpi o conservato in PBT a quattro gradi Celsius per un secondo momento.

Colorazione dalla stessa croce utilizzata per far sì che le larve raccolgano gli adulti F1 prima della dissezione. Immergere da cinque a 10 mosche e raffreddare etanolo al 95% per 30 secondi per rimuovere la cera sulla superficie della cuticola. Per rimuovere l'etanolo, lavare gli adulti tre volte con ghiaccio freddo, una volta PBS e dopo il terzo lavaggio, trasferire uno di loro in una capsula di protezione da 35 millimetri riempita con ghiaccio freddo una volta PBS per preparare un adulto alla dissezione.

Posizionalo con il lato ventrale rivolto verso l'alto e inserisci uno spillo da minion a metà dell'addome. Inizia la dissezione usando una pinza per rimuovere le gambe. Quindi rimuovere la cuticola della testa fissando la testa ai puntelli e contemporaneamente staccando la cuticola da sotto l'occhio verso la parte superiore della testa.

Usando con attenzione una pinza affilata, rimuovi, traccia i tessuti che circondano il cervello perché traccia i tuoi tessuti hanno una forte autofluorescenza e fa galleggiare il cervello durante il fissaggio. Il cervello è solo una parte del SNC adulto. L'altra parte è il cordone nervoso ventrale o VNC nel torace e deve essere sezionato.

Per prima cosa, rimuovi la cuticola toracica fissando la mosca alla base della zampa posteriore e tirando delicatamente la cuticola toracica fino alla base del collo. In secondo luogo, per esporre il VNC, allargare delicatamente le due metà della cuticola toracica. In terzo luogo, rimuovere l'addome dal torace fissandolo alla base della seconda gamba e tirando via l'addome vicino alla prima notte di agitazione addominale.

In quarto luogo, pulire il VNC fissandolo nell'area omerale e strappando delicatamente il tessuto che circonda il VNC. Strappa l'anello di tessuto connettivo che circonda il connettivo cervicale e continua a rimuovere il tessuto in eccesso mentre raccogli il cervello. E VNC li trasferisce come pere in un piatto di Pyrex a nove mondi riempito con PBS raffreddato una volta tenuto in ghiaccio.

Per fissare i tessuti adulti, immergerli in PFA al 4% su ghiaccio per 15 minuti. Seguire il bagno con tre lavaggi PBS ghiacciati e tre lavatrici PBT. Il tessuto è ora pronto per essere visualizzato o marcato con anticorpi per analizzare l'espressione transgenica con precisione.

È utile etichettare il SNC con marcatori neuronali o gliali per fornire un quadro di riferimento, iniziare incubando il tessuto a quattro gradi Celsius durante la notte con anticorpi contro i neuroni o la glia il giorno successivo. Lavare il preparato cinque volte con PBT e incubare con l'anticorpo secondario fluorescente a temperatura ambiente per due ore. Avvolgere la piastra e la pellicola per evitare il fotosbiancamento dell'anticorpo al termine dell'incubazione.

Lavare la preparazione con PBS e montare interamente la preparazione su un vetrino. Utilizzare un anello di plastica OSHA per evitare che il tessuto venga schiacciato dal vetrino coprioggetti. Il sistema nervoso è ora pronto per essere esaminato per i pattern di espressione di GFP e LL al microscopio a fluorescenza.

In genere vengono esaminate da tre a cinque repliche per determinare la riproducibilità del modello di espressione del capovolgimento. Il modello di espressione di flip in the flip, una linea può essere utilizzata insieme ad altri transgeni per cambiare il modo in cui viene espresso il repressore GAL 4 GAL 80. La modifica dell'espressione del repressore GAL 80 è un metodo efficace per apportare modifiche.

Nell'espressione di GAL quattro, un metodo consiste nell'eliminare l'espressione di GAL 80 con il transgene GAL 80 che inattiva GAL quattro, che altrimenti sta causando la degenerazione oculare in tutto l'occhio. L'hash 6 88 A della flip line ET viene utilizzato qui per valutare l'efficacia dello strumento di conversione GAL 80 in un sottoinsieme di fotorecettori nella progenie F1, confrontare il fenotipo dell'occhio con il fenotipo dell'occhio dei ceppi parentali. Qualsiasi comparsa di deformità o depigmentazione oculare conferma che il modello di espressione flip è presente nei fotorecettori e GAL 80 flipout ha avuto successo.

Una strategia complementare e non ridondante consiste nel capovolgere l'espressione GAL 80 utilizzando la stessa linea di inversione di interesse. Questa strategia è molto simile all'altra, ma ora la pigmentazione e la degenerazione dell'ID nella progenie F1 sono soppresse. Nel flip X due.

Una volta padroneggiata, la dissezione del SNC può essere eseguita in circa cinque minuti per gli adulti e un minuto per le larve se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare una pinza affilata per rimuovere la trachea e il tessuto che circonda sia l'adulto che il Libre C e Ss.It è importante utilizzare un piatto privo di fissativi per la dissezione. Il flip dello shock termico è attualmente utilizzato per generare cloni casuali.

Al contrario, l'enhancer trap flip consente di generare cloni riproducibili, facilitando l'analisi morfologica e comportamentale. Un altro punto di forza del metodo delle dita è che si potrebbero limitare ulteriormente i quattro modelli di espressione GAL utilizzando ulteriori linee basate su anan trap flip e altre linee gal. Un punto debole della configurazione GAL 80 è che alcune combinazioni di effettori GA quattro e UAS come LAG quattro e U-A-S-K-I-R non sono compatibili perché uccideranno le mosche.

Questo problema può essere facilmente superato utilizzando un effettore UAS condizionale, come UAS Shiri Ts, che consente di esaminare un comportamento a temperature restrittive come previsto. Non tutte le linee di lipasi della trappola enhancer esprimeranno livelli sufficientemente alti di lipasi per essere utili. Ciononostante, la tecnica del dito qui descritta fornisce un nuovo approccio per i ricercatori di drosofila per perfezionare l'analisi del mosaico sia per i circuiti di sviluppo che per il comportamento.