Name: Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per lanalisi delle interazioni proteina-lipide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri la cromatografia di affinità mediata da vescicole lipidiche con separazione magnetica delle cellule attivate per analizzare le interazioni proteina-lipide in un ambiente simile alla membrana.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH R01NS046835 e R01AG034389, e il March of Dimes concedere 6FY08-322. Un ringraziamento speciale è dedicata alla signora Eleonora Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) che ha contribuito enormemente con la sua comprensione della tecnologia MACS. Miltenyi ha generosamente fornito il materiale utilizzato per la dimostrazione degli esperimenti senza alcun costo. Sono anche grato al Dr. Guanghu Wang (Medical College della Georgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), che ha generato il PKCζ esprimere linee cellulari. Supporto per l&#39;Istituto di Medicina Molecolare presso il Medical College of Georgia / Georgia Health Sciences University (in direzione del Dott. Lin Mei) è anche riconosciuto.

1. Introduzione La vescicola-mediata cromatografia di affinità dei lipidi utilizzando magnetica attivata cell sorting (LIMACS) tecnica è stata sviluppata nel nostro laboratorio di isolare ceramide associate complessi proteici 1-3. In origine, le vescicole lipidiche erano fatti di ceramide e fosfatidilserina, che ha consentito di MACS utilizzando particelle magnetiche coniugate annessina V (molto affine a fosfatidilserina) per isolare le vescicole e le proteine ​​associate. Abbiamo usato la tecnica LIMACS per la ricostituzione in vitro di un complesso di ceramidi associato polarità e l'isolamento di ceramide-proteine ​​che legano da lisati cellulari 3. LIMACS possono essere modificati utilizzando l'interazione di altri partner per l'isolamento delle vescicole (ad esempio, glicolipide-specifc lectine o anticorpi lipidi). 2. Le procedure sperimentali Preparazione di vescicole lipidiche e saggi aPKCBinding <ol><li> Vescicole lipidiche sono ottenuti da miscele secche di quantità equimolare di fosfatidilserina (105 mg) e C16-ceramide (85 mcg) a seguito di procedure di modifica per la grande preparazione liposomi 1,4-7. </li><li> Le miscele di lipidi vengono poi risospese e sonicato per 1 h in 100 ml di buffer di vescicole composto da 50 mM Tris / HCl (pH 7,5) e 150 mM NaCl. </li><li> Dopo aver aggiunto 300 ml di tampone vescicola integrato con 0,1 mM MnCl 2, i campioni sono centrifugati a 12,000 g μ per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Il pellet (vescicole lipidiche grande) è risospeso in 100 ml di buffer di vescicole e incubate con 1 nmol di Vybrant CM-dii per 1 ora a 37 ° C per visualizzare la frazione vescicola dopo la separazione MACS. Vybrant CM-dii è un colorante rosso fluorescente specificamente inserire in membrane lipidiche. </li><li> Un detergente senza lisato cellulare è preparato mediante ultrasuoni / omogeneizzazione di cellule in 300 ml di tampone ipotonico (10 mM Tris / HCl (pH 7,0) con inibitori della proteasi e fosfatasi), seguita da rimozione dei detriti membranosa per centrifugazione. Una fase di centrifugazione a 100.000 xg per 1 ora deve essere aggiunto per evitare la contaminazione del lisato cellulare con membrane endogena contenente fosfatidilserina. </li><li> Il lisato eliminato viene aggiunta alla sospensione delle vescicole lipidiche, e la miscela è incubata per 2 ore a 4 ° C. </li><li> La miscela di reazione è completata con 20 ml di tampone 20x annessina V vincolante e 50 ml di una soluzione contenente microsfere magnetiche coniugato con annessina V seguita da incubazione per 1 ora a 4 ° C. </li><li> MACS è effettuata secondo le istruzioni del produttore (Miltenyi Biotec, Inc.) protocollo. La presenza e la quantità di vescicole lipidiche è determinata monitorando i Vybrant CM-dii fluorescenza nel flow-through e eluizione frazioni utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre. </li><li> La correlazione lineare tra la quantità di lipidi vescicolare e intensità di fluorescenza di vescicole legato Vybrant CM-dii è verificato da quantitativa ad alte prestazioni cromatografia su strato sottile (HPTLC) della miscela lipidica applicato annessina V-Mac basati su. </li><li> La specificità della reazione di legame di proteine ​​o altri aPKC alla ceramide / fosfatidilserina vescicole è verificata mediante un test degli anticorpi concorrenza con 1 mg di anti-PKCζ anticorpo policlonale di coniglio per incubare il lisato cellulare per 1 ora a 4 ° C prima dell'incubazione con le vescicole lipidiche. </li><li> Il legame con le proteine ​​di ceramide / fosfatidilserina vescicole nell'eluato MACS è analizzata mediante SDS-PAGE e immunoblotting. </li></ol> In vitro dei lipidi-proteina complessa polarità <ol><li> La ricostituzione in vitro di un complesso proteina-lipide polarità viene eseguito seguendo la procedura LIMACS come descritto nella sezione precedente. In breve, fosfatidilserina (420 mg) e C16-ceramide (107 mcg) viene essiccato da solvente organico. </li><li> I lipidi secchi sono risospesi in sonicazione in 500 ml di buffer di vescicole (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl). </li><li> Cinque ml di 10 mM MnCl2, 1 l di Vybrant CM-dii, e 500 ng di PKCζ (ricombinante umano) è aggiunto e la miscela di reazione incubata undergentle agitazione per 60 minuti a 4 ° C. </li><li> Vybrant CM-dii macchiato fosfatidilserina / ceramide vescicole sono recuperati per centrifugazione a 12.000 xg per 60 min a 4 ° C. </li><li> Il pellet (rosa) è risospese in 100 microlitri di buffer Tris e integrato con γS-GTP (100 mM), il PIL (1 mm), GST-Par6 (100 ng), o GST-Cdc42 (500 ng) e ulteriormente incubate per 3 ore a 4 ° C (qualsiasi altra combinazione di proteine ​​ricombinanti di interesse può essere utilizzato qui). </li><li> Annessina V-buffer (5 ml di una soluzione di 20x stock) e sfere magnetiche annessina V-coniugato (50 ml) vengono aggiunti e la miscela di reazione incubata in agitazione per altri 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Annessina V-MACS viene eseguita seguendo il protocollo del fornitore come descritto in precedenza. </li> La frazione di eluizione (1 ml) è integrato con 10 mcg di ovoalbumina pura come aiuto precipitazioni. La proteina è concentrata da Wessel-Flugge precipitazione e analizzati da SDS-PAGE/immunoblotting come descritto in precedenza 8. <li> La quantità di vescicole lipidiche eluito viene quantificato il rilevamento di Vybrant CM-dii (rosa) nella (cloroformio / metanolo) fase organica della reazione Wessel precipitazioni Flugge. La quantità di proteine ​​analizzate è normalizzata sulla stessa quantità di vescicole lipidiche. </li></ol> 3. Risultati Purificazione LIMACS di PKCζ-EGFP e il dominio ceramide vincolante C20ζ-EGFP Un detergente senza lisato di cellule che esprimono MDCK lunghezza PKCζ C-terminale legato alla proteina fluorescente verde (FLζ-EGFP) o un dominio ceramide vincolante nel C-terminale della PKCζ (C20ζ-EGFP) è stato incubato con fosfatidilserina / vescicole ceramide come descritto nelle procedure sperimentali. Dopo l'eluizione della colonna MACS, la proteina è stata analizzata con immunoblotting e gli anticorpi contro PKCζ e EGFP per la rilevazione della proteina eluita 2. <img src="/files/ftp_upload/2657/2657fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> LIMACS Figura 1. EGFP di marcato PKCζ e il suo frammento C-terminale C20ζ utilizzando fosfatidilserina / ceramide vescicole. Detergente senza lisati di cellule che esprimono MDCK EGFP (come non vincolante di controllo), a figura intera PKCζ-EGFP, o il legame ceramide, frammento C-terminale C20ζ-EGFP sono stati incubati con fosfatidilserina / vescicole ceramide, come descritto nella sezione sperimentale Procedure . Dopo aver utilizzato LIMACS, proteina è stata eluita con tampone campione SDS e analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Il pannello di sinistra mostra che EGFP non si sono legati al vescicole mantenuto con il V-linked perline annessina magnetico. Il pannello centrale e di destra mostra che la lunghezza totale PKCζ-EGFP e C20ζ-EGFP sono stati mantenuti dovuto al legame di ceramide.

<ol><li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li>
<li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li>
<li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li>
<li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+C%2816%29-ceramide+between+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li>
<li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+%28and+sociology%29+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Symp%22%5BJournal%5D)">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li>
<li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per testare l&#39;interazione specifica tra un lipide e il suo legame con le proteine ​​è ostacolata dalla incorporazione di lipidi nella membrana cellulare. La membrana cellulare è costituita da una miscela di lipidi e proteine ​​diverse, ed è organizzato in microdomini lipidici o zattere. Pertanto, il co-purificazione di proteine ​​microdomini e non è possibile distinguere se una proteina che si lega direttamente a un lipidi o è solo arricchito in una struttura microdomini. Altri metodi utilizzando lipidi definito riv...

Annessina sfere magnetiche V-coniugati e MACS micro e minicolonne sono stati forniti da Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). Tutti i lipidi sono stati di altissima purezza e ottenuti da Avanti Polar Lipids (alabastro, AL).

vescicole lipidiche-mediata cromatografia di affinità mediante magnetic separazione delle cellule attivate (limacs): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

L&#39;analisi delle interazioni lipidi proteine ​​è difficile perché i lipidi sono incorporati nelle membrane cellulari e quindi inaccessibili alla maggior parte delle procedure di purificazione. In alternativa, i lipidi possono essere rivestiti su superfici piane come usato per lipidi ELISA e Plasmon spettroscopia di risonanza. Tuttavia, lipidi rivestimento superficiale non formano strutture microdomini, che possono essere importanti per le proprietà dei lipidi vincolanti. Inoltre, questi metodi non consentono per la purificazione di grandi quantità di proteine ​​leganti i lipidi alla loro destinazione. Per superare queste limitazioni dei test interazioni lipidi e proteine ​​per purificare lipidi proteine ​​leganti abbiamo sviluppato un nuovo metodo chiamato vescicola lipidica mediata cromatografia di affinità utilizzando magnetica attivata cell sorting (LIMACS). In questo metodo, vescicole lipidiche sono preparati con i lipidi di destinazione e fosfatidilserina come lipidi di ancoraggio per annessina V MACS. Fosfatidilserina è un fosfolipide onnipresente membrana cellulare che mostra alta affinità per la proteina annessina V. Utilizzando sfere magnetiche annessina V coniugata con la fosfatidilserina contenenti vescicole lipidiche si legano al sfere magnetiche. Quando le vescicole lipidiche sono incubati con una cella lisato il legame proteico al lipidi obiettivo sarà anche legato ai talloni, possono essere co-purificato con MACS. Questo metodo può essere utilizzato anche per verificare se le proteine ​​ricombinanti ricostituire un complesso proteina legante al lipidi di destinazione. Abbiamo usato questo metodo per mostrare l&#39;interazione di atipica PKC (aPKC) con la ceramide sfingolipidi e di co-purificare risposta apoptosi prostata 4 (PAR-4), una proteina vincolante per ceramide associati aPKC. Abbiamo inoltre usato questo metodo per la ricostituzione di un complesso di ceramidi associato di aPKC ricombinante con la cella polarità proteine ​​correlate Par6 e Cdc42. Dal momento che le vescicole lipidiche possono essere preparati con una varietà di sphingo o fosfolipidi, LIMACS offre un test versatile per lipidi-proteina in un ambiente lipidico che ricorda da vicino quella della membrana cellulare. Ulteriori lipidi complessi proteici possono essere identificati mediante l&#39;analisi proteomica di proteine ​​lipidi legame co-purificato con le vescicole lipidiche.

Per verificare l&#39;interazione di una proteina con la sua lipidi obiettivo abbiamo utilizzato MACS e sfere magnetiche annessina V-coniugati e vescicole lipidiche sintetizzato dal lipidi target e annessina V-binding fosfatidilserina. Le proteine ​​legate alla lipidi target sono co-purificati e analizzati dopo eluizione dal perline.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

L'analisi dell'interazione tra lipidi e proteine è difficoltosa poiché i lipidi sono incorporati nelle membrane cellulari e, di conseguenza, sono inaccessibili alla maggior parte delle procedure di purificazione...

Questo esperimento è progettato per identificare proteine leganti i lipidi e per analizzare l'interazione tra proteine e lipidi in un ambiente di membrana definito. Le proteine di lisati cellulari sono incubate con vescicole lipidiche appena preparate da fosfatidilserina e ceramide. La miscela di reazione viene quindi integrata con delle microsferette magnetiche coniugate a Xin V per ancorare le proteine associate alle vescicole lipidiche alle microsferette magnetiche. Successivamente, le vescicole lipidiche-proteina vengono purificate mediante il metodo di separazione cellulare attivata da campo magnetico.Per identificare i risultati dimostrati della proteina legata al lipide, utilizzare la SDS-PAGE e il Western blotting per mostrare la purificazione di PKC atipica endogena e ricombinante e di un dominio specifico di legame alla ceramide espressi in cellule MDCK. Il principale vantaggio di questa nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti come ELISA o la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie per il legame superficiale è che l'interazione tra lipide e proteina avviene in un ambiente simile a una membrana e che le proteine leganti possono essere purificate e analizzate

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