Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l'analisi delle interazioni proteina-lipide

Questo esperimento è progettato per identificare le proteine leganti i lipidi e per analizzare l'interazione tra le proteine lipidiche in un ambiente di membrana definito di particelle lipidiche di cellule omogenee sono incubate con le vescicole lipidiche appena preparate da fosfato da sciabica fosfato e ceramide. La miscela di reazione viene quindi integrata con una microsfera magnetica coniugata Xin V per ancorare la proteina associata alle vescicole lipidiche alle microsfere magnetiche. Successivamente, le vescicole lipidiche proteiche vengono purificate mediante smistamento cellulare attivato magneticamente.

Per identificare i risultati dimostrati dalla proteina legata ai lipidi, utilizzare il Western blotting della pagina SDS per mostrare la purificazione della lyx di PKC atipica endogena e ricombinante e di uno specifico dominio di legame della ceramide espresso nelle cellule MDCK. Il vantaggio principale di questa nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti come Eliza o la spettroscopia di risonanza plasmatica come il legame superficiale, è che l'interazione tra le proteine lipidiche si ottiene in un ambiente simile a una membrana e che le proteine leganti possono essere purificate e analizzate. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi delle malattie che coinvolgono i lipidi perché in queste malattie l'interazione fisiologica delle proteine lipidiche è compromessa.

Per alcune di queste malattie, i bersagli proteici non sono nemmeno noti e devono essere identificati Per progettare una terapia a base di lipidi, iniziare con sles lipidici preparati da una miscela essiccata di equimolare, quantità di fosfatidilseina e ceramide C 16 in 100 microlitri di tampone sicale. Sonicare per un'ora dopo aver aggiunto 300 microlitri di tampone iCal, integrato con 0,1 millimolari di cloruro di manganese, centrifugare i campioni a 12.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius, quindi risospendere il pellet di grandi vescicole lipidiche in 100 microlitri di tampone sicale. Aggiungere un nanomolare di colorante fluorescente vibrante cm DII e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per facilitare la visualizzazione della frazione di LES dopo la massima separazione, recuperare un pellet rosa di fosfato colorato vibrante cm dai, un ceramide siriana sles mediante centrifugazione e Resus spendere in 100 microlitri di tris buffer.

Successivamente, per preparare un lisato cellulare privo di detergenti, sonicare le cellule in 300 microlitri di tampone ipertonico di tris da 10 millimolari, acido cloridrico contenente proteasi e inibitori della fosfatasi e centrifugare. Per rimuovere i detriti membranosi, aggiungere ora il lisato cellulare chiaro alla sospensione fisica lipidica e incubare la miscela per due ore a quattro gradi Celsius. Poiché i lisati cellulari possono contenere membrane endogene con aerina fosfato, si raccomanda di eliminare il lisato da queste membrane mediante ulteriori fasi di centrifugazione.

Integrare la miscela di reazione con 20 microlitri di un tampone legante XNV e 50 microlitri di una soluzione contenente perle magnetiche coniugate a un incubato XNV per un'ora a quattro gradi Celsius, eseguire la selezione cellulare attivata magneticamente come raccomandato dal protocollo del produttore. Successivamente, monitorare la fluorescenza vibrante CM DII nel flusso attraverso e nelle frazioni di eluizione utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre per determinare la presenza e la quantità di lipidi in un test di competizione anticorpale. Per verificare la specificità della reazione di legame di A PKC per le vescicole della sciabica fosfo ceramide, incubare un microgrammo di anticorpo policlonale di coniglio anti P KC Zeta con un lisato cellulare per un'ora a quattro gradi Celsius, seguito da incubazione con le vescicole lipidiche.

Continuare con la pagina SDS e l'analisi immuno blotting della proteina che si lega alle sles di ceramide fosfato serin nell'eluato massimo per la ricostituzione in vitro di un complesso di polarità proteica lipidica iniziare con una preparazione di pellet rosa di vibranti vescicole di ceramide seriana fosfato colorate cm DII come mostrato in precedenza, reus sospendere le vescicole in 100 microlitri di tri tampone, integrato con 100 micromolari gamma S, GT, P, un millimolare, GDP e una combinazione di proteine ricombinanti di interesse. Quindi incubare la reazione a quattro gradi Celsius per tre ore. Quindi, aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre 20 x di un tampone X in V e 50 microlitri di un X in V sfere magnetiche coniugate.

Incubare la miscela in leggera agitazione per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius. Continuare a eseguire lo smistamento delle celle attivate magneticamente NX NV come raccomandato dal protocollo del produttore per facilitare la precipitazione. Integrazione della frazione di eluizione con 10 microgrammi di albumina elettronica pura.

Concentrare le proteine mediante precipitazione di gommapiuma. La fase inferiore è costituita da metanolo cloroformio con cm dii vibranti arricchiti. L'interfase brunastra contiene le microsfere magnetiche e la proteina precipitata.

Quantificare le vescicole lipidiche di ellu rilevando cm dii rosa e vibranti nella fase di metanolo di cloroformio organico della reazione influenzale di weyl. Utilizzare quantità uguali di vescicole lipidiche per normalizzare le quantità di proteine tra i campioni e analizzare tramite pagina SDS. Immunoblotting.

Un lisato privo di detergenti di cellule MDCK che esprimono PKC Zetta C a lunghezza intera legata terminalmente a una proteina fluorescente verde o a un dominio di legame della ceramide. Nel capolinea C di pkc. Zetta è stato incubato con fosfoscia.

Vescicole di ceramide dopo elucian della colonna max, le proteine sono state analizzate mediante immuno blotting. Il frammento legante la ceramide C 20 Zeta, EGFP e l'intera lunghezza P KC Zeta sono stati recuperati dall'EIT della colonna max, coerentemente con la specificità e l'efficacia della procedura di lyx. Il controllo negativo EGFP, che non si legava al fosfato, le nostre vescicole di ceramidi siriane, non era rilevabile nell'eit.

Quando Linx viene integrato con altri metodi come la pagina SDS e il western blotting o l'analisi proteomica, è possibile rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proteine si trovano nel complesso proteico legante i lipidi. Dopo il suo sviluppo, LabX ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sui lipidi singoli S per esplorare l'apoptosi indotta da ceramidi e la polarità cellulare nelle cellule staminali neuro ed epiteliali.