Name: Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri la microscopia a due fotoni per osservare in tempo reale la fagocitosi e la formazione di NET da parte dei neutrofili nei polmoni infetti. Questa tecnica consente analisi ad alta risoluzione delle risposte immunitarie in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Lars Philipsen aiuto per ottimizzare il film intravitale, il Dr. Jonathan Lindquist per leggere attentamente il manoscritto, e tutti i membri del laboratorio Gunzer per utili discussioni e commenti durante lo sviluppo del metodo. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) a MG

1. Infezione <ol><li> Conidi Gonfiore della muffa Aspergillus fumigatus (ceppo ATCC 46645) sono generati da pre-incubazione in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlino, Germania) arricchito con 5% FCS (v / v). 2x10 7 riposo conidi sono risospesi in 5 ml di mezzo e incubato in un 6-pozzetti di coltura tissutale (TPP AG; Trasadingen, Svizzera, catalogo # 92006) per 7 ore a 37 ° C. </li><li> Dopo il periodo di gonfiore, le spore sono fluorescente aggiungendo 10 ml di soluzione calcofluor fondo bianco (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Germania, catalogo # F3543, [25 mg / ml] in DMSO) per ogni Aspergillus contiene bene in 6-bene piastra, raggiungendo una concentrazione finale calcofluor di 50 mg / ml RPMI. A seguito di miscelazione gentile, le spore vengono incubate per altri 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Nella fase successiva, le spore vengono raccolte mediante filtrazione attraverso una cella di 70 micron filtro (BD Biosciences, Heidelberg, Germania). Dopo il lavaggio, una volta con 10 ml di PBS (centrifugare a 900xg per 5 minuti a temperatura ambiente) il pellet è risospeso in 2 ml di PBS e il numero totale di conidi gonfie determinata contando con una camera di Neubauer. Infine la sospensione di spore è filato giù al 900xg per 5 minuti a temperatura ambiente, il supernatante viene accuratamente rimosso e il pellet risospeso alla concentrazione finale della 1x107 spore per 100 l di PBS. </li><li> Per l'infezione, 100 ml di soluzione di spore è applicata intratracheally in topi di sesso femminile (C57/BL6, 8-10 settimane, Harlan, Germania). Se neutrofili devono essere osservate pure, l'uso di Lys-EGFP topi, portando EGFP sotto il promotore lisozima 1 è consigliata. Inizia l'anestesia l'animale con una sola iniezione ip di 150 microlitri Ketamin / Rompun soluzione (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germania (Ketamin) e Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germania (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml di NaCl sterile [0.9%]). 5 minuti più tardi il mouse anestetizzato può essere fissato con un elastico per i suoi denti alla rampa (cioè una superficie inclinata) per facilitare l'intubazione (supplementare figura 1). Utilizzando pinze, la lingua è tirata da un lato e un 22G catetere venoso a permanenza (B. Braun AG, Melsungen, Germania, Vasofix Braunüle) può essere delicatamente inserito nella trachea sotto illuminazione permanente con una lampada a collo d'oca. L'inserimento di successo del catetere è verificata osservando il movimento regolare del torace dell'animale con la frequenza del ventilatore meccanico. Quando l'intubazione di successo è stato confermato, 100 microlitri della sospensione di spore si applica con un 100 microlitri micropipetta. Questo volume deve essere inalato con l'animale, senza alcun aiuto supplementare in 1-2 s. Una migliore distribuzione delle particelle di funghi all'interno del polmone è ottenuto meccanicamente ventilazione l'animale infetto per 2 minuti con un respiratore piccolo animale (Minivent, Hugo Sachs, marzo-Hugstetten, Germania) al tasso di 250 respiri al minuto e un volume inalazione di 300 microlitri per ogni respiro (supplementare figura 2). Dopo gli animali infezione sono tornati alle loro gabbia e osservato ogni 5 minuti fino ambulatoriale di nuovo. I topi non mostrano alcuna evidenza di dolore o disagio durante il periodo di incubazione successivo. </li></ol> 2. Preparazione del polmone <ol><li> 7 ore dopo l'infezione con le spore, l'animale è eutanasia da una dose eccessiva di isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Germania) fino a quando i movimenti e la respirazione hanno smesso per più di 30 secondi. Questo viene poi seguita da toracotomia come metodo secondario per assicurare la morte clinica e consentire la visualizzazione e l'accesso della trachea e polmoni. Poi il petto è aperta con cura per esporre i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Poi un altro 22G catetere venoso a permanenza viene inserito nella trachea a partire dalla epiglottide esposti. Attraverso questo tubulo i polmoni sono pieni di 1 ml preriscaldata fusione agarosio bassa (2% w / v, Promega, Mannheim, Germania) con un 1 ml Omnifix siringa (B. Braun). Non appena i polmoni sono pieni della trachea è legato con un breve pezzo di filo per cucire e l'intero animale viene messo in frigorifero a 4 ° C. </li><li> 15 minuti più tardi, quando l'agarosio si è solidificato, il polmone intero è escisse a partire dalla trachea. Utilizzando un paio di forbici taglienti a punta, il lobo del polmone destro è successivamente rimosso, la superficie inferiore è brevemente asciugato su un foglio di carta velina e poi l'intero lobo è incollato al blocco preparazione di un (Campden Instruments, Regno Unito, vibratome 752M Vibroslice ) utilizzando una goccia di adesivo per il fissaggio del tessuto (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania, Roti-Coll 1). Dopo 1 min il blocco è installato nella camera di taglio del vibratome, che è pieno di pre-raffreddata (4 ° C) PBS. Il vibratome è impostato su un mid-range di vibrazione (5 su 10 max.) E anche la velocità moderata (5 su 10 max.) Tale che una sezione orizzontale delpolmone è prodotta. La metà superiore del organo è poi trasferito in un piccolo piatto di plastica Petri (5 cm di diametro), dove è invertita e fissata con un self-made rondella piatta (1 cm di diametro interno) che è coperto da un insieme di fili di nylon in parallelo, ogni 1 mm l'una dall'altra (supplementare figura 3). Infine il piatto di Petri è riempito con 10 ml di PBS supplementato con 10 ml di colorante DNA Sytox Arancio [5 mm] (Invitrogen, Germania), con conseguente concentrazione finale di tintura di 5 micron. </li></ol> 3. 2-fotone microscopia laser <ol><li> La piastra di Petri contenente il campione del polmone viene poi installato sotto il microscopio obiettivo in modo che il buffer può essere riscaldato a 37 ° C da un sensore di temperatura controllata riscaldamento (supplementare figura 4). 2-fotone microscopia viene poi effettuata sulla superficie di taglio tutto utilizzando un microscopio Zeiss LSM 710 NLO su un palco eretto Axio Examiner dotata di un obiettivo 20xNA1.0 acqua immersione (Zeiss, Jena, Germania). Per l'imaging, diverse aree lungo la sezione vengono sottoposti a scansione fino a 400 micron di profondità con una lunghezza d'onda di 800 nm illuminazione rilevazione verde (530 nm) e rosso (580 nm) fluorescenza, così come la generazione di seconda armonica (SHG)-segnale e il blu calcofluor fluorescenza (emissione a 400-470 nm) con rilevatori esterni non descanned (NDD). Oltre 2-D immagini e filmati lasso di tempo (1 immagine ogni 5-10 secondi), singoli o ripetitivi 3-dimensionale pile foto può essere successivamente reso come rendering voxel o singole immagini messa a fuoco estesa o 4-D di dati (3D nel tempo) con differenti pacchetti software. Questa configurazione permette l'osservazione microscopica del comportamento cellulare in un ambiente quasi intatto, che, in quanto costituisce la porta di ingresso per una varietà di agenti patogeni aerodispersi, è di enorme rilevanza immunologica. Motilità cellulare, fagocitosi e la produzione endogena NET da parte dei neutrofili dopo l'infezione con la muffa Aspergillus fumigatus può essere facilmente studiato in queste condizioni in situ. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Se fatto correttamente l'imaging genererà 2 - o 3-colore diapositive o filmati. Anche se la colorazione è fatto in una procedura di post-elaborazione ed è quindi liberamente adattabile, generalmente selezionare uno schema di colorazione che riflette il colore naturale del colorante / segnale, che viene rilevato nel canale relativo. Così, i coloranti Sytox sono rappresentati in rosso, il fungo così come il segnale SHG è mostrato in blu e, se presente, EGFP-etichettati cellule sono colorate in verde. Nel primo esempio (Fig. 1) il segnale SHG blu raffigura le fibre di un tessuto non infetto del polmone e il segnale rosso Sytox è prodotto da nuclei di cellule del polmone residenti taglio aperto dal vibratome. Nel secondo esempio (Fig. 2) un polmone infetto viene mostrato, dove entrambi, strutture alveolari così come masse fungine, appaiono in blu, mentre i nuclei e reti sono macchiate di rosso. Il terzo esempio (Fig. 3) è da un Lys-EGFP animale transgenico dove oltre alle strutture blu e rosso i neutrofili verde può anche essere visto. La migrazione dei neutrofili e la loro fagocitosi dei singoli elementi fungini in sequenze lasso di tempo viene mostrato nel film supplementare. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. L'aspetto di un non-infetti fetta di polmone in 2 colori 2-fotone microscopia. Una fetta del polmone è stato preparato da un non-infetti C57/BL6 mouse e ripreso come descritto nel protocollo. Qui presentate sono il segnale SHG della struttura del tessuto alveolare (A), il segnale Sytox dei nuclei cellulari taglio aperto durante la preparazione della fetta del polmone (B), e una sovrapposizione dei due canali (C). L'area in scatola (C) è visto ampliato (D). Si prega di notare il tessuto fibroso alla base del polmone fetta rispetto alla organizzazione chiaramente all'interno della respirazione alveolare-attiva aree del polmone di cui sopra. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La comparsa di una fetta del polmone di un animale infetto tipo Aspergillus selvatici in 2-color 2-fotone microscopia. Una fetta del polmone da un mouse C57/BL6 infettato 7 ore prima con A. fumigatus è stato preparato e immaginato come descritto nel protocollo. Indicato è la struttura combinata fungine e SHG del tessuto alveolare (A), il segnale di Sytox NET DNA così come i nuclei delle cellule taglio aperto durante la preparazione della fetta del polmone (B), e una sovrapposizione dei due canali (C) . L'area in scatola (C) è visto ampliato (D). Si prega di notare, le aree ben distinte delle masse fungine, alveoli, e NET-strutture sono contrassegnate con le lettere F, A e N, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La comparsa di una fetta di un polmone infetto Aspergillus Lys-EGFP animale in 3-color 2-fotone microscopia. Una fetta di un polmone Lys-EGFP topo infettato 7 ore prima conA. fumigatus è stato preparato e immaginato come descritto nel protocollo. Indicato è la struttura combinata fungine e SHG del tessuto alveolare (blu), il segnale Sytox dei nuclei delle cellule e NET (rosso), così come pure numerosi neutrofili (verde). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Supplementare figura 1. Fissazione del mouse per l'intubazione. Sotto Ketamin / Rompun anestesia l'animale è fissato con un elastico al suo denti al fine di facilitare l'intubazione con un catetere venoso 22G interiore. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Supplementare figura 2. Ventilazione meccanica del mouse. Il mouse intubato è stato infettato da un Qualora l'applicazione delle 1x10 7 spore risospesi in 100 l di PBS. Una migliore distribuzione delle particelle di funghi all'interno del polmone è ottenuto meccanicamente ventilazione il mouse infettato da un respiratore piccolo animale. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Supplementare figura 3. Fissazione del lobo del polmone. Dopo la preparazione del lobo del polmone destro l'organo è fissato in una capsula di Petri con l'uso di una rondella di laboratorio fatte piatto che è coperto da un insieme di fili di nylon paralleli. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Supplementare figura 4. 2-fotone configurazione imaging. La piastra di Petri contenente il lobo destro del polmone è installato su una stuoia di riscaldamento sotto il 2-fotone microscopio dopo l'aggiunta del colorante DNA Sytox Orange. Supplementare film:. Neutrofili migrazione e phagocytosing elementi fungine da Aspergillus nei polmoni infettati visto dal lasso di tempo 2-fotone microscopia di una fetta di vita del polmone 7 ore dopo l'infezione con il fungo neutrofili sono verdi, elementi fungini e SHG sono blu, e nuclei delle cellule come così come NET-strutture sono rappresentate in rosso. Il tempo reale di questo esperimento viene mostrato in basso a destra. La barra di scala rappresenta 50 micron. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1%20-%20supplemental.mpg">Clicca qui per guardare il video</a>

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</ol>

In tempo reale 2-fotone microscopia in vivo o in organi intatti ha assunto un&#39;importanza profonda negli studi che fare con la fisiologia delle cellule immunitarie negli ultimi 10 anni. E &#39;con questa tecnica che eventi importanti come le dinamiche di attivazione delle cellule T all&#39;interno dei linfonodi prima divenne visibile 2-4. Più di recente, i ricercatori hanno anche iniziato ad analizzare specifiche funzioni cellulari, come i primi passi nella generazione di cellule effettrici nei tessuti linfatici utilizzando questo approccio 5. Tuttavia, anche se un certo numero di nuovi concetti biologici sono stati rivelati con questo metodo, ci sono ancora sfide e questioni importanti per i quali non esistono studi di visualizzazione intravitale sono stati pubblicati finora. In particolare questo vale per i polmoni dei mammiferi. L&#39;aspetto interessante di questo organo, come porta di ingresso per una varietà di agenti patogeni nell&#39;aria, la rende una delle superfici più cruciale in cui i processi immunologici hanno luogo nel corpo dei mammiferi. Con ogni respiro nel corso della vita intera, particelle indesiderate vengono inalate, alcune delle quali hanno il potenziale di indurre in pericolo di vita infezioni 6. E si spiega da sé che in un sito sensibile e in via di estinzione una fitta rete di meccanismi di difesa deve essere presente esibendo tutto il repertorio di risposte immunitarie. D&#39;altra parte è molto importante che la lotta contro i patogeni immunologico indotto potenziale in un posto così &quot;sporco&quot; è strettamente controllato. Reazioni esagerate del sistema immunitario sopportare un elevato rischio di danneggiare il proprio corpo in maniera massiccia da ferire i tessuti degli organi dopo la stimolazione di azioni non specifica delle cellule immunitarie 7,8. Alla luce di questi pensieri sarebbe estremamente interessante ed utile avere la possibilità di studiare il comportamento delle cellule nei polmoni dei mammiferi in vere condizioni in vivo. Tuttavia, il fatto che un tale sistema finora non è stato attuato con successo in modo chiaro i punti per le enormi difficoltà che devono essere risolti nella creazione di un protocollo di lavoro. La sfida più impegnativa è probabilmente la stabilità fuoco. Il polmone come organo responsabile per la respirazione è in movimento costante in tutte e tre le direzioni dello spazio per realizzare l&#39;inalazione. Questa sola circostanza provoca gravi problemi di immagine e può essere considerato un intravitale imager &quot;incubo&quot;. Già un leggero movimento a qualsiasi dimensione nello spazio ha un effetto enorme sul deterioramento della vista microscopico, che deve essere stabile con precisione micrometrica al fine di generare immagini significative 9. Dato il suo accento intrinsecamente stretto locale 10, 2-fotone microscopia è ancora più sensibile alle instabilità focale, come una lussazione di una certa struttura della gamma di appena pochi micrometri nella direzione Z è equivalente a una completa perdita di messa a fuoco e così un esperimento fallito. Il protocollo presentato in questo studio per l&#39;osservazione delle cellule immunitarie all&#39;interno del polmone murino non è ancora in applicazione in vivo, ma una buona approssimazione la situazione in un polmone funzionalmente integro 11. Approcci ex vivo dei linfociti immagini, ad esempio in linfa espiantati nodi, hanno dimostrato di produrre risultati equivalenti a vere osservazioni in vivo in 12 e quindi sono molto importanti 5. Le osservazioni in situ a fette polmone, che sono possibili solo con il nostro approccio, si svolgono in un polmone infetto poco dopo l&#39;escissione. L&#39;integrità 3D durante il processo di taglio è garantita dalla matrice di agarosio, un passo essenziale per consentire un processo controllato con precisione il taglio del polmone. Anche se è necessario raffreddare il polmone espiantati per un breve periodo per consentire una solidificazione della matrice di agarosio, è possibile tornare a condizioni quasi fisiologiche per le cellule e rewarming dopo il taglio del tessuto. Questo è chiaramente dimostrato dai nostri dati, che dimostrano che in queste condizioni neutrofili sono molto attivi e mostrano il loro pieno potenziale come fagociti agile, che sono necessari per la liquidazione effettiva di una infezione da Aspergillus fumigatus. Pattugliano il tessuto polmonare passando attraverso le barriere epiteliali per raggiungere le parti interne degli alveoli e inoltre si occupano attivamente spore fungine 11. Un risultato chiave di questo lavoro è stato la comparsa di strutture simili neutrofili trappole extracellulare (NET) nel Aspergillus organo infetto. NET sono una scoperta molto recente di un nuovo meccanismo di difesa nei neutrofili 13. Tuttavia, sin dalla sua prima descrizione nel 2004, il numero di condizioni fisiologiche o patologiche in modelli animali e nell&#39;uomo dove questo fenomeno è stato osservato che manca o è stato esplosivo aumento 14-16. Curiosamente, sebbene tanto lavoro è stato speso per queste strutture da parte di gruppi così diversi, la maggior parte i rapporti sono ancora ad un livello molto descrittivo e non molto èsa del meccanismo di rilascio NET e la sua regolazione. Con il nostro protocollo siamo stati in grado per la prima volta a mostrare le fibre NET in un polmone infetto. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare l&#39;importanza di neutrofili appena reclutati così come le strutture molecolari funghi per il loro verificarsi o inibizione 11. Questo mostra chiaramente il potenziale del nostro metodo per indagare i singoli passaggi della formazione NET in modo più dettagliato. Si potrebbe pensare ad esempio per utilizzare neutrofili da topi knock-out adatto per osservare la loro capacità di formazione NET negli esperimenti di trasferimento adottivo. Quindi, anche se l&#39;osservazione diretta di immigrazione neutrofili dal sangue periferico non è possibile con questo sistema a causa della mancanza di afflusso di sangue dopo espianto dell&#39;organo, continuiamo a credere che il nostro protocollo è un approccio importante e relativamente facile da gestire che permette l&#39;imaging di passi presto o tardi nella difesa immunitaria contro le infezioni polmonari. Questo è, dunque, un passo importante verso indagare questo fenomeno all&#39;interno del polmone respirazione di animali vivi.

osservazione diretta di fagocitosi e net-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni microscopia

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Dopo il tratto gastrointestinale, il polmone è il secondo più grande superficie per l&#39;interazione tra il corpo dei vertebrati e l&#39;ambiente. Qui, un efficace scambio di gas deve essere mantenuto, e al tempo stesso evitare il contagio da agenti patogeni multipli che vengono inalati durante la respirazione normale. Per raggiungere questo obiettivo, una serie di strategie di difesa superba combinazione di meccanismi immunitari umorali e cellulari esiste. Una delle misure più efficaci per la difesa acuta del polmone è il reclutamento dei neutrofili, che o fagocitare i patogeni inalati o ucciderli rilasciando sostanze citotossiche. Una recente aggiunta all&#39;arsenale di neutrofili è il loro rilascio esplosivo di DNA extracellulare-NET da cui i batteri o funghi possono essere catturati o inattivato, anche dopo che le cellule rilasciando NET sono morti. Vi presentiamo qui un metodo che permette di osservare direttamente neutrofili, la migrazione all&#39;interno di un polmone recentemente infettati, phagocytosing patogeni fungini e visualizzare i NET estesa che hanno prodotto in tutto il tessuto infetto. Il metodo descrive la preparazione di spesse fette di polmone vitale 7 ore dopo l&#39;infezione endotracheali di topi con conidi della muffa Aspergillus fumigatus e il loro esame da multicolore time-lapse 2-fotone microscopia. Questo approccio permette di studiare direttamente difesa antifungina nel tessuto polmonare nativa e apre così una nuova strada per lo studio dettagliato di immunità polmonare.

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l&#39;osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Dopo il tratto gastrointestinale, il polmone rappresenta la seconda superficie più ampia per l'interazione tra l'organismo dei vertebrati e l'ambiente. Qui, un...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare neutrofili granulociti viventi e reti di DNA extracellulare in un polmone recentemente infettato da un agente patogeno fungino. Innanzitutto, topi positivi per EGFP nella loro popolazione di neutrofili vengono infettati con Candida, anch'essa marcata con fluorescenza. Successivamente, l'infezione viene lasciata progredire per sette ore, al termine delle quali l'animale infetto viene sacrificato.Successivamente, i polmoni dell'animale infetto vengono riempiti con agar a basso punto di fusione per facilitare il sezionamento mediante beome. Infine, una fetta spessa di tessuto polmonare infetto viene ottenuta tramite viome e neutrofili polmonari. Vengono acquisite immagini di reti di DNA ed elementi fungini.Alla fine, è possibile ottenere immagini fisse ad alta risoluzione o sequenze video di granulociti in tessuto polmonare vivo mediante microscopia a due fotoni multicolore. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto alle tecnologie esistenti è che le cellule immunitarie responsabili dell'eliminazione dell'infezione possono essere osservate direttamente nel loro ambiente naturale. Questo può essere fatto durante il processo di formazione delle reti e di uccisione dei funghi, consentendo così un'analisi della fisiologia dei neutrofili molto meno influenzata da artefatti.Ho inventato questa tecnica quando Mathias mi ha infastidito con le sue domande insistenti riguardo alla rilevanza in vivo dei miei precedenti risultati ottenuti in vitro, e presenterò questa tecnica nei prossimi minuti. Per generare conidi gonfi dell'ascomicete ambientale Aspergillus fumigatus, aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti, quindi trasferire due volte 10 alla settima conidi in riposo nella piastra e incubare le spore per sette ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica, in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2.Dopo il periodo di rigonfiamento, etichettare in modo fluorescente le spore aggiungendo 10 microlitri di soluzione di calcior bianco a ciascun pozzetto, seguiti da un'accurata miscelazione. Incubare la piastra per ulteriori 15 minuti nelle stesse condizioni per raccogliere le spore marcate in modo fluorescente; posizionare un filtro cellulare da 70 micrometri sulla sommità di un tubo conico da 50 millilitri. Raccogliere le spore dalla piastra mediante pipetta, quindi far passare la soluzione attraverso il filtro cellulare nel tubo.Successivamente, centrifugare le cellule a 900 G per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il mezzo. Quindi, lavare le spore con 10 millilitri di PBS nelle stesse condizioni di centrifugazione. Ri-sospendere il pellet di spore in due millilitri di PBS e determinare il numero totale di canadia gonfie mediante contatore cellulare; centrifugare nuovamente la sospensione di spore nelle stesse condizioni di prima e, successivamente, rimuovere con attenzione il soprannatante.Sospendere il kedia sedimentato a una concentrazione finale di un miliardo di cellule per 100 microlitri di PBS per preparare il topo all'infezione con la soluzione di spore; l'animale viene anestetizzato e la sedazione viene confermata dall'assenza di risposta alla pinzatura delle dita dei piedi. In questo video, vengono utilizzati topi lys EGFP, che portano EGFP sotto il promotore della lisozima e presentano quindi neutrofili positivi per eeg FP. Cinque minuti dopo la somministrazione dell'anestetico e la conferma della sedazione, utilizzare un laccio elastico per sospendere il topo narcotizzato a testa in giù per i denti sotto una lampada flessibile. Usare una pinza per spostare la lingua da un lato e inserire un catetere venoso permanente da 22 gauge nella trachea dell'animale.Dopo l'inserimento corretto di questo tubicino, utilizzare una micropipetta da 100 microlitri per somministrare 100 microlitri della sospensione di spore. Successivamente, per favorire la distribuzione delle particelle fungine in tutto il polmone, ventilare meccanicamente l'animale infetto per due minuti con un respiratore per piccoli animali a una frequenza respiratoria di 250 atti al minuto e un volume di inspirazione di 300 microlitri per atto. Infine, rimuovere il catetere e riposizionare il topo nella sua gabbia per sette ore, durante le quali l'infezione progredisce.Osservare il recupero dell'animale ogni cinque minuti fino a quando non riesce a camminare di nuovo, poco prima della fine del periodo di infezione. Sciogliere 20 millilitri di agarosio a basso punto di fusione in un forno a microonde e mantenerli caldi in modo che l'agarosio non si solidifichi prima dell'iniezione. Raffreddare in frigorifero una bottiglia di PBS a quattro gradi Celsius in questo momento.Alla fine del periodo di infezione, l'animale viene soppresso. Utilizzare aghi per fissare il topo a un tappetino di silicone e aprire con cura il torace mediante forbici e pinzette per esporre i polmoni e le vie respiratorie superiori. A partire dall'epiglottide esposta, inserire un altro catetere venoso indwelling da 22 gauge nella trachea.Utilizzando un ago da cucito, si avvolge un comune filo da cucito attorno alla trachea come preparazione per il successivo passaggio di riempimento polmonare con aros. Successivamente, riempire una siringa da un millilitro con l'aros preriscaldato ed amministrare la soluzione attraverso il catetere per riempire i polmoni. Non appena i polmoni sono completamente riempiti, chiudere la trachea legandola con il filo da cucito precedentemente predisposto, rimuovendo contemporaneamente il catetere, quindi collocare l'intero animale in un refrigeratore a quattro gradi Celsius per 15 minuti.Dopo che l'aro si è solidificato, a partire dalla trachea, asportare l'intero polmone dal torace aperto e lavarlo con PBS pre-raffreddato utilizzando un paio di forbici appuntite. Rimuovere il lobo polmonare destro. Asciugare brevemente la base del lobo su un foglio di carta da filtro, quindi fissare il lobo a un blocco di preparazione per vibram utilizzando una goccia di adesivo tissutale per un minuto.Successivamente, installare il blocco nella camera di taglio del vibratome e riempire la camera con PBS preraffreddato. Impostare il rasoio su una vibrazione media con un'impostazione di avanzamento mediale e praticare una sezione trasversale orizzontale del polmone. Quindi posizionare la metà superiore del tessuto polmonare tagliato capovolto in una piastra di Petri di plastica di cinque centimetri di diametro.Fissare il tessuto polmonare alla piastra di Petri posizionando una rondella piatta sulla sua superficie. Riempire la piastra con 10 millilitri di PBS e aggiungere 10 microlitri di colorante citotossina. Infine, posizionare la piastra contenente il tessuto polmonare sotto l'obiettivo del microscopio in modo che il buffer possa essere riscaldato da un riscaldatore controllato da un sensore di temperatura a 37 gradi Celsius per l'acquisizione delle immagini.Diverse aree lungo la dissezione vengono analizzate fino a una profondità di 400 micrometri utilizzando una lunghezza d'onda di illuminazione di 800 nanometri, rilevando la fluorescenza verde a 530 nanometri e rossa a 580 nanometri, nonché il segnale di generazione di armonica secondaria o SHG. In blu, la fluorescenza a 400-470 nanometri emessa mediante rivelatori esterni non-DSD (NDD) mostrati qui in blu è il segnale SHG della struttura tissutale alveolare di un polmone non infetto di un topo C57BL/6. Si noti il tessuto fibroso alla base della sezione polmonare rispetto all'organizzazione chiaramente alveolare nelle aree attive per la respirazione situate nella parte superiore del polmone.In questa figura, il segnale di citotalk dei nuclei delle cellule polmonari, tagliati durante la preparazione della sezione polmonare, è visualizzato in rosso. Questa immagine mostra una sovrapposizione dei due canali con un ingrandimento dell'area delimitata dal riquadro del tessuto mostrato qui. Il segnale SHG blu indica le strutture alveolari e fungine presenti in una sezione polmonare di un topo C57BL/6 infettato sette ore prima con afu tis.In questa figura, il segnale rosso di Cyt talk mostra non solo i nuclei delle cellule polmonari tagliate durante la preparazione della sezione polmonare, ma anche le reti di DNA presenti qui. Un sovrapposizione dei due canali è visibile in questa immagine ingrandita dell'area delimitata dal riquadro della figura precedente. Aree distinte di masse fungine, alveoli e strutture a rete sono indicate rispettivamente con le lettere FM e R, mentre la struttura fungina combinata e la SHG del tessuto alveolare sono in blu.Il segnale di citotalk dei nuclei cellulari e delle reti appare rosso, così come numerosi neutrofili infiltrati nel polmone. Il verde può essere osservato qui in una sezione di tessuto polmonare di un topo lis EGFP. Sette ore dopo l'infezione con afu dea, neutrofili in verde possono essere visti migrare e fagocitare elementi fungini in blu nei polmoni infettati da aspergillo, come mostrato da microscopia a intervalli di tempo.Microscopia a due fotoni di una fetta di polmone vivente. Sette ore dopo l'infezione, i nuclei cellulari e le strutture reticolari sono mostrati in rosso. Il tempo reale dell'esperimento è indicato in basso a destra e la barra della scala rappresenta 50 micrometri.Ora questo metodo può fornire informazioni sulle infezioni fungine. Potrebbe inoltre essere applicato ad altri sistemi, come le infezioni virali o batteriche, e potrebbe offrire spunti sul funzionamento di altre cellule immunitarie residenti nel polmone.

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Qui descriviamo una tecnica basata sul microscopio per visualizzare e quantificare le prime cascate di eventi durante la fagocitosi di agenti patogeni come i funghi Candida albicans e particolati che sono più grandi di 0,5 μm, inclusi zimosani e perle rivestite di IgG.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

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Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

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Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Presentato qui è un protocollo per l'induzione e l'analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell'attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

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Scopri la microscopia a due fotoni per osservare in tempo reale la fagocitosi e la formazione di NET da parte dei neutrofili nei polmoni infetti. Questa tecnica consente analisi ad alta risoluzione delle risposte immunitarie in vivo.

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia (Video) | JoVE Journal

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

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