High-Throughput misurazione e classificazione di P organici in campioni ambientali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di classificare il fosforo organico idrolizzato enzimaticamente in estratti di campioni di terreno o letame. Ciò si ottiene estraendo prima i campioni con una soluzione di idrossido di sodio EDTA e regolando il pH degli estratti. Quindi incubare questi estratti aggiustati con due diverse soluzioni enzimatiche.

Su una piastra a 96 pozzetti, il passaggio finale consiste nel misurare l'ortofosfato rilasciato dall'enzima utilizzando la colorimetria del blu di molibdeno. In definitiva, la maggior parte delle forme native di ortofosfato monoestere fosforo e diaster fosforo possono essere classificate in campioni di terreno o letame in base al rilascio differenziale di ortofosfato mediante il metodo dell'idrolisi enzimatica. Questo metodo può essere eseguito a basso costo in qualsiasi laboratorio standard.

Il vantaggio principale che ha rispetto ai metodi esistenti come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare al fosforo 31, è che può misurare il potenziale degli enzimi nativi del suolo di rilasciare ortofosfato dai composti organici dei piselli in futuro. Pertanto, i dati ottenuti con questo metodo possono aiutare a prevedere la fertilità del suolo o il potenziale per il suolo di rilasciare quantità dannose di ortofosfato algale disponibile. Aggiungere 30 millilitri della soluzione di idrossido di sodio 0,25 molare a due grammi di campione umido o essiccato in una provetta conica da 50 millilitri.

Incubare agitando per 16 ore a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni 3000 volte G per 30 minuti, quindi trasferire 100 microlitri in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri che contiene già tampone acetato. Il campione aggiustato ha un volume totale di un millilitro e un pH di 5,0.

Preparare due soluzioni madre contenenti 0,5 unità per millilitro di fosfatasi acida in 10 millilitri di acetato di sodio molare 0,1 appena preparato pH cinque. Ora aggiungere la nucleasi liofilizzata ricostituita NP one di Penicillium Citron in una delle provette da 10 millilitri di stock di fosfatasi acida ad una concentrazione finale di 2,5 unità NP una per millilitro miscelata delicatamente invertendo più volte, centrifugare le due soluzioni enzimatiche a 3000 volte G per 30 minuti. Per costruire una curva di calibrazione, iniziare aggiungendo un millilitro di una soluzione madre di fosfato di potassio millimolare a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri ed eseguire sette diluizioni di cereali da 0,5 millilitri, scartare la prima provetta in modo che la diluizione finale vada da 20 a 0,625 nm di fosforo.

Ora trasferire gli standard ORTHOPHOSPHATE nelle ultime due colonne della piastra, iniziando con zero NM di ortofosfato nella riga A e terminando con 20 nm di ortofosfato nella riga H fino ai primi tre pozzetti della colonna 10. Aggiungere 40 microlitri di soluzione enzimatica PP più GP ai tre pozzetti successivi della colonna 10. Aggiungere 40 microlitri di PP plus GP plus NP una soluzione enzimatica.

Infine, aggiungere 40 microlitri di tampone acetato da 100 millimolari a tutti e sei i pozzetti. Ora ciascuno dei primi sei pozzetti della colonna 10 dovrebbe contenere 80 microlitri di soluzione per i due pozzetti successivi. Aggiungere 40 microlitri di soluzione di acetato di sodio contenente 10 M di glucosio, sei fosfati e 40 microlitri di PP più soluzione enzimatica GP.

Per ogni campione da testare, distribuire 40 microlitri di estratti di campioni a pH regolato nei pozzetti da uno a nove in un massimo di otto file dopo che tutti i campioni sono stati distribuiti. Utilizzare una pipetta multicanale per distribuire la soluzione enzimatica PP più GP alle colonne da uno a tre, PP più GP più NP, da uno alle colonne da quattro a sei e tampone molare di acetato di sodio 0,1 alle colonne da sette a nove. Eseguire rapidamente questo passaggio per garantire che tutti i campioni ottengano un tempo di incubazione equivalente.

Coprire la piastra a 96 pozzetti con un coperchio e incubare i campioni, le soluzioni enzimatiche, i controlli e la curva di calibrazione esattamente per un'ora a 37 gradi Celsius in acqua deionizzata. Preparare 50 millilitri di ciascuna delle quattro soluzioni madre. A deve essere preparato quotidianamente utilizzando rapidamente una pipetta multicanale.

Aggiungere 25 microlitri di SDS, 100 microlitri di soluzione A, 20 microlitri di soluzione B e 50 microlitri di soluzione C a tutti i pozzetti del 96. Bene, copri la piastra e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente. Infine, misurare l'assorbanza a 850 nanometri in qualsiasi lettore di micropiastre sintonizzabile T utilizzando un'applicazione per fogli di calcolo.

Innanzitutto, tracciare la curva di calibrazione del fosforo inorganico con fosforo da zero a 20 nanomoli sull'asse x e la media delle misure di assorbanza duplicata sull'asse Y, eseguire una regressione lineare e trovare l'equazione della linea di miglior adattamento. Quindi, calcola il fosforo inorganico di fondo facendo la media dei valori nelle colonne da uno a tre e quindi applicando la curva di calibrazione al set di dati. Successivamente, per determinare il fosforo derivato da monoesteri di fosforo idrolizzati, calcolare la media dei valori del campione triplicato dalle colonne da quattro a sei e sottrarre la soluzione enzimatica di controllo più il fosforo inorganico di fondo.

Quindi, per calcolare il contenuto di fosforo dal fosforo idrolizzato, i DER calcolano la media dei valori del campione triplicato dalla colonna sette alla nona e sottraggono la soluzione dell'enzima di controllo più il fosforo inorganico di fondo più il fosforo monoestere idrolizzato dalla colonna quattro alla sei. Una tipica piastra a 96 pozzetti mostra i risultati per otto campioni e una curva di calibrazione. I controlli si trovano nella colonna 10.

L'aumento dell'intensità del colore tra le colonne da uno a tre e da quattro a sei è dovuto al monoestere idrolizzato I composti del fosforo tra le colonne da quattro a sei e da sette a nove sono dovuti ai composti del fosforo del dietere idrolizzato. Qui il metodo dell'idrolisi enzimatica ad alto rendimento è stato utilizzato per analizzare con successo la distribuzione delle classi di fosforo in un estratto di EDTA 0,25 molari di idrossido di sodio 0,05 molari di un campione di terreno del Vermont. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i composti nativi di ortofosfato, monoestere e pisello diastere in estratti di terreno o letame utilizzando l'idrolisi enzimatica.

Questa tecnica può aiutare a spianare la strada ai ricercatori nei campi della chimica ambientale e della gestione dei nutrienti per esplorare il comportamento organico del P nei sistemi del suolo o del letame.