Name: High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Scopri come rilevare e quantificare 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nel tessuto cerebrale di Balb/C utilizzando il kit EpiMark con reazioni enzimatiche e qPCR. Questo metodo consente di distinguere le modifiche epigenetiche con elevata sensibilità.

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Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Chin Gyeong, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, laboratorio di Steven E. Jacobsen s, UCLA. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH 1R44GM095209-01.

1. DNA Glucosylation e controllare le reazioni <ol><li> In un tubo di reazione 1,5 millilitri su ghiaccio, mescolare 5-10 microgrammi di DNA genomico (per una concentrazione finale di 30 microgrammi / millilitro), il 12,4 microlitri di UDP-glucosio (per una concentrazione finale di 80 micromolari), 31 microlitri di NEBuffer 4 e fino a 310 microlitri di nucleasi senza acqua per portare il volume totale a 310 microlitri. </li><li> Split questa miscela di reazione in due tubi di 155 microlitri ciascuno. </li><li> Quindi aggiungere 30 unità, o 3 microlitri, di T4-β-glucosiltransferasi a un tubo. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. Il secondo tubo è la reazione di controllo, in modo da aggiungere 3 microlitri di acqua, invece di T4-BGT. </li><li> Incubare entrambi i tubi a 37 gradi centigradi per 12 a 18 ore, durante il quale il T4-BGT aggiungerà glucosio per il gruppo ossidrile di 5-hydroxymethylcytosine gruppi del campione. </li></ol> 2. Digestione degli enzimi di restrizione <ol><li> Etichetta tre 0,2 millilitri PCR-strip numeri tubi da 1 a 3. Aliquota 50 ul della miscela di reazione in ogni. </li><li> Etichetta tre 0,2 millilitri PCR-strip numeri tubi da 4 a 6. Aliquota 50 ul della miscela di controllo in ciascuno. </li><li> Aggiungere 100 unità, o 1 microlitro, di MspI in tubi 1 e 4. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Aggiungere 50 unità, o 1 microlitro, di HpaII in tubi 2 e 5. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Non aggiunge nulla ai tubi 3 e 6, in quanto sono controlli. </li><li> Incubare tutte le 6 tubi a 37 ° C per almeno 4 ore. </li><li> Aggiungere 1 microlitro di proteinasi K in ciascuna provetta e incubare a 40 ° C per 30 minuti. </li><li> Inattivare il proteinasi K incubando a 95 gradi centigradi per 10 minuti. </li></ol> 3. Analizzare il DNA mediante PCR / qPCR Questo protocollo utilizza NEB è LongAmp Taq per end-point PCR che ha dimostrato di funzionare bene. Altri protocolli di PCR può essere sostituito. <ol><li> Aggiungere i seguenti componenti di una reazione di 0,2 tubo millilitro PCR in ghiaccio: 10 microlitri di tampone di reazione 5X LongAmp Taq, 1,5 microlitri di 10 dNTPs millimolare, 1 microlitro di 10 Primer micromolari Forward, 1 microlitro di 10 Primer Reverse micromolari, 3 microlitri di template DNA dai passaggi precedenti, 1 microlitro di Taq DNA polimerasi LongAmp e acqua priva di nucleasi fino a 50 microlitri. Questi volumi possono cambiare in base al protocollo di PCR utilizzato. </li><li> Mescolare delicatamente la reazione. Se necessario, raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta da un giro veloce. </li><li> Sovrapposizione del campione con olio minerale se si utilizza un termociclatore senza coperchio riscaldato. </li><li> Trasferire i tubi PCR dal ghiaccio ad un termociclatore con il blocco preriscaldato a 94 gradi Celsius e avviare il programma di ciclismo. Per una routine 3-step PCR, ci dovrebbe essere un passo denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 secondi, seguita da 30 cicli di 94 gradi Celsius denaturazione per 15 secondi, da 55 a 65 gradi Celsius ricottura per 30 secondi, e 65 gradi Celsius estensione per 20 secondi, o 50 secondi per kb. Questo dovrebbe essere seguito da una estensione finale a 65 ° C per 5 minuti. Real-time PCR può essere eseguita anche per quantificare quantità di 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine. Si prega di fare riferimento al manuale del prodotto, che si trova sulla neb.com per informazioni specifiche. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Confronto di 5-hydroxymethylcytosine ammonta a 12 nel locus diversi topo Balb / C campioni di tessuto. (A), End-point PCR. (B), Real time PCR. DNA da quattro tessuti del mouse è stato analizzato. Ai fini comparativi, PCR in tempo reale i dati sono stati normalizzati al DNA non tagliato. Una curva standard è stato utilizzato per determinare il numero di copia. I campioni potrebbero essere normalizzati dividendo il numero di copie di campioni Nessun 1-6 dal numero di copie del controllo che viene digerito (n. 5). Corsia gel Boxed mostra variazione in 5-HMC presente.

<ol><li>Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li>
<li>Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).</li>
<li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li>
</ol>

Sia Ted e rom, autori di questo articolo, sono dipendenti della ONA; rom è lo sviluppatore principale del kit, con Ted è il Direttore del Dipartimento Applicazioni &amp; Sviluppo che ha supervisionato lo sviluppo di questo kit.

Ci sono parecchie cose fondamentali da considerare nella creazione di questo esperimento. In primo luogo, è importante che il glucosylation di DNA genomico procede al completamento. La specificità sequenza di T4-BGT non è nota, e sembra non avere altra scelta per la sequenza di substrato. Pertanto, in alcuni casi, i tempi di incubazione più lungo può essere necessario. In secondo luogo la digestione, MspI e HpaII deve essere completa in modo da evitare segnale di fondo. Per questi enzimi di restrizione, si consiglia un tempo di incubazione di 4 ore, ma più incubazioni può essere eseguita quando scissione incompleta è osservato. In terzo luogo, il DNA quantità di ingresso può essere regolata a seconda della disponibilità, dal 20 NGS del DNA può essere usato per end-point PCR. Infine, si consiglia l&#39;uso del DNA di controllo in dotazione, che può essere eseguito in parallelo con il DNA genomico per 5 e 5-MC-HMC quantificazione.

<table><tbody><tr><td>EpiMark&amp;#8482; 5-hmC e 5-mC Analysis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3317</td><td></td></tr><tr><td>Primers specifici per locus, che delimitano un sito CCGG di interesse</td><td></td><td></td><td>Personalizzati per ogni esperimento; forniti dall'utente</td></tr><tr><td>LongAmp&amp;#174; &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0323</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>acqua di grado per biologia molecolare</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in balb / c tessuto cerebrale

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Hydroxymethylation DNA è una modificazione del DNA da tempo, ma recentemente è diventato un focus di ricerca epigenetica. DNA dei mammiferi è enzimaticamente modificati nella posizione di carbonio 5 ° della citosina (C) residui a 5-MC, prevalentemente nel contesto di dinucleotidi CpG. 5-MC è suscettibile di ossidazione enzimatica a 5-HMC dalla famiglia Tet di enzimi, che si ritiene siano coinvolti nello sviluppo e nella malattia. Attualmente, il ruolo biologico di 5-HMC non è pienamente compreso, ma sta generando molto interesse a causa della sua potenzialità come biomarker. Ciò è dovuto a diversi studi innovativi di identificazione 5-hydroxymethylcytosine nel topo staminali embrionali (ES) e le cellule neuronali. Tecniche di ricerca, compresi i metodi di sequenziamento bisolfito, non sono in grado di distinguere facilmente tra i 5-MC e 5-HMC. Un protocolli esistono pochi in grado di misurare quantità globale di 5-hydroxymethylcytosine nel genoma, tra cui la cromatografia liquida accoppiata con l&#39;analisi di spettrometria di massa e cromatografia su strato sottile di nucleosidi singolo digerito dal DNA genomico. Gli anticorpi che colpiscono 5-hydroxymethylcytosine esistono anche, che può essere utilizzato per l&#39;analisi dot blot, immunofluorescenza, o precipitazione del DNA hydroxymethylated, ma questi anticorpi non hanno singola aggiunta resolution.In di base, la risoluzione dipende dalle dimensioni del DNA immunoprecipitato e per esperimenti di microarray, dipende dal disegno della sonda. Dal momento che non si sa esattamente dove 5-hydroxymethylcytosine esiste nel genoma o il suo ruolo nella regolazione epigenetica, nuove tecniche, sono necessari in grado di identificare hydroxymethylation specifico locus. Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Analisi Kit offre una soluzione di distinzione tra questi due modifiche a loci specifici. Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Analisi Kit è un metodo semplice e robusto per l&#39;identificazione e quantificazione di 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all&#39;interno di un locus DNA specifico. Questo approccio enzimatica utilizza la sensibilità metilazione differenziale dei MspI isoschizomers e HpaII in un semplice 3-step del protocollo. DNA genomico di interesse è trattato con T4-BGT, aggiungendo un moeity glucosio al 5-hydroxymethylcytosine. Questa reazione è sequenza-indipendente, quindi tutti i 5-HMC sarà glucosilati, non modificato o 5-mC DNA contenente non saranno interessati. Questo glucosylation è poi seguita dalla digestione di restrizione endonucleasi. MspI e HpaII riconoscere la stessa sequenza (CCGG), ma sono sensibili a diversi stati di metilazione. HpaII si unirà solo un sito completamente modificato: ogni modifica (5-mC, 5-HMC o 5-ghmC) sia a scissione citosina blocchi. MspI riconosce e si unirà a 5 mC e 5-HMC, ma non 5-ghmC. La terza parte del protocollo è interrogatorio del locus mediante PCR. Appena 20 ng di DNA di ingresso possono essere utilizzati. Amplificazione della sperimentazione (glucosilati e digerito) e di controllo (finto glucosilati e digerito) DNA bersaglio con primer che fiancheggiano un sito CCGG di interesse (100-200 bp) viene eseguita. Se il sito CpG contiene 5-hydroxymethylcytosine, una band viene rilevato dopo glucosylation e la digestione, ma non nel non-glucosilati reazione di controllo. PCR in tempo reale darà un&#39;approssimazione di quanto hydroxymethylcytosine è in questo particolare sito. In questo esperimento, analizzeremo il 5-hydroxymethylcytosine quantità in un Babl / C campione di cervello di topo per punto PCR finale.

Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all&#39;interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l&#39;aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

L'idrossimetilazione del DNA è una modificazione del DNA nota da tempo, ma è diventata recentemente un punto focale della ricerca epigenetica. Il DNA dei mammiferi viene enzimaticamente...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare e quantificare cinque metil citosine e cinque idrossietil citosine all'interno di un locus specifico del DNA genomico. Questo viene ottenuto bloccando il gruppo idrossile della cinque idrossietil aina, che converte un sito di MSP scindibile in un sito non scindibile. Come secondo passaggio, il DNA genomico viene digerito con gli enzimi di restrizione MSP uno e HPA due, che sfruttano le loro diverse sensibilità alla metilazione per identificare i siti di cinque idrossietil citosina correlati al glucosio.Successivamente, la PCR viene utilizzata per analizzare il locus. I risultati ottenuti mostrano la presenza di cinque idrossietil citosina in un locus specifico. La qPCR può essere utilizzata per quantificare la quantità di cinque metil citosina e cinque idrossietil citosina.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il sequenziamento con bisolfito, è che è possibile discriminare tra cinque metilammina e cinque idrossietilammina. Gli esperimenti di oggi saranno eseguiti da Romas Vice Villa, Romas è stato uno sviluppatore principale di questo kit presso New England Biolabs. Prima dell'inizio di questo protocollo, purificare il DNA genomico dal tessuto cerebrale di B. Sea come descritto nella procedura scritta in un tubo da reazione da 1,5 millilitri. Mescolare il DNA genomico, UDP-glucosio, buffer NEB 4 e acqua priva di nucleasi in quantità sufficiente da portare il volume totale a 310 microlitri.Dividere questa miscela di reazione in due provette da 155 microlitri ciascuna. Aggiungere quindi 30 unità o tre microlitri di T4 beta-glucosiltransferasi a una provetta. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù.Non aggiungere il T four BGT al secondo tubo poiché si tratta della reazione di controllo, ma assicurarsi di aggiungere tre microlitri di acqua. Incubare entrambi i tubi a 37 gradi Celsius per 12-18 ore, periodo durante il quale la BGT aggiungerà glucosio al gruppo ossidrilico di cinque gruppi citosina idrossietilici nel campione. Per iniziare la digestione con enzimi di restrizione, aliquotare 50 microlitri della miscela di reazione in ciascuno di tre tubi PCR a striscia da 0,2 millilitri etichettati da uno a tre.Quindi aliquotare 50 microlitri della miscela controllo in ciascuna di tre provette a strip per PCR etichettate da quattro a sei. Aggiungere 100 unità di msp, una nelle provette uno e quattro. Successivamente, aggiungere 50 unità di HPA due nelle provette due e cinque e mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù.Non aggiungere nulla ai tubi tre e sei poiché sono controlli. Incubare tutti e sei i tubi a 37 gradi Celsius per almeno quattro ore. Quindi aggiungere un microlitro di proteinasi K in ciascun tubo e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti.Infine, inattivare la proteinasi K incubando a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Questa procedura viene dimostrata utilizzando NE B'S long amp TAC per PCR endpoint. Tuttavia, altri reagenti e procedure per PCR possono essere sostituiti in un tubo per reazione PCR da 0,2 millilitri posto sul ghiaccio.Aggiungere il buffer di reazione TAC lungo 5x, dNTP, primers diretti e inversi, il template di DNA ottenuto in precedenza, DNA lungo AMP T DNA polimerasi e acqua priva di nucleasi in quantità sufficiente per ottenere un volume finale di 50 microlitri. Mescolare delicatamente la reazione se necessario e raccogliere tutto il liquido sul fondo del tubo mediante una breve centrifugazione. Trasferire i tubi PCR dal ghiaccio a un termociclatore con il blocco preriscaldato a 94 gradi Celsius e avviare il programma di ciclaggio per una PCR standard a tre passaggi.Deve essere previsto un unico passaggio iniziale di denaturazione a 94 gradi Celsius per 30 secondi, seguito da 30 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 15 secondi, ricottura a 55-65 gradi Celsius per 30 secondi e allungamento a 65 gradi Celsius per 20 secondi o 50 secondi per kb. A ciò deve seguire un unico allungamento finale a 65 gradi Celsius per cinque minuti. La PCR in tempo reale può essere inoltre eseguita per quantificare le quantità di cinque metilcitosina e cinque idrossietilcitosina.Si prega di fare riferimento al manuale del prodotto disponibile su nb.com per informazioni specifiche. È stato effettuato un confronto di cinque quantità di idrossietil amina nel Locus 12 mediante PCR endpoint e PCR in tempo reale; sono stati analizzati quattro diversi campioni di tessuto BSY di topo, inclusi cervello, fegato, cuore e milza.La variazione della cinque idrossietil citosina è evidente nella corsia del gel racchiusa in un riquadro dei campioni di PCR endpoint a scopo comparativo. I dati di PCR in tempo reale sono stati normalizzati rispetto al DNA non tagliato ed è stata utilizzata una curva standard per determinare il numero di copie. I campioni sono stati normalizzati dividendo il numero di copie dei campioni per il numero di copie del controllo non digerito.Qui, la variazione della cinque idrossietil citosina può essere osservata confrontando le barre gialle. Alcune note sulla realizzazione della tecnica. È fondamentale che tutte le reazioni enzimatiche vengano portate a termine. Per la BGT, è importante che la reazione prosegua per tutta la notte in modo da poter isolare completamente tutti i siti del DNA per Ms.P uno; per HEPA due, è importante che le reazioni durino almeno quattro ore per assicurare il completamento.E infine, forniamo controlli di DNA e controlli di primer in modo che è possibile eseguire reazioni di controllo in parallelo.

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Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l'arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l'arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

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