High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale
1 febbraio 2011
Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare e quantificare cinque metil citosine e cinque idrossietil citosine all'interno di un locus specifico del DNA genomico. Questo viene ottenuto bloccando il gruppo idrossile della cinque idrossietil aina, che converte un sito di MSP scindibile in un sito non scindibile. Come secondo passaggio, il DNA genomico viene digerito con gli enzimi di restrizione MSP uno e HPA due, che sfruttano le loro diverse sensibilità alla metilazione per identificare i siti di cinque idrossietil citosina correlati al glucosio.
Successivamente, la PCR viene utilizzata per analizzare il locus. I risultati ottenuti mostrano la presenza di cinque idrossietil citosina in un locus specifico. La qPCR può essere utilizzata per quantificare la quantità di cinque metil citosina e cinque idrossietil citosina.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il sequenziamento con bisolfito, è che è possibile discriminare tra cinque metilammina e cinque idrossietilammina. Gli esperimenti di oggi saranno eseguiti da Romas Vice Villa, Romas è stato uno sviluppatore principale di questo kit presso New England Biolabs. Prima dell'inizio di questo protocollo, purificare il DNA genomico dal tessuto cerebrale di B. Sea come descritto nella procedura scritta in un tubo da reazione da 1,5 millilitri. Mescolare il DNA genomico, UDP-glucosio, buffer NEB 4 e acqua priva di nucleasi in quantità sufficiente da portare il volume totale a 310 microlitri.
Dividere questa miscela di reazione in due provette da 155 microlitri ciascuna. Aggiungere quindi 30 unità o tre microlitri di T4 beta-glucosiltransferasi a una provetta. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù.
Non aggiungere il T four BGT al secondo tubo poiché si tratta della reazione di controllo, ma assicurarsi di aggiungere tre microlitri di acqua. Incubare entrambi i tubi a 37 gradi Celsius per 12-18 ore, periodo durante il quale la BGT aggiungerà glucosio al gruppo ossidrilico di cinque gruppi citosina idrossietilici nel campione. Per iniziare la digestione con enzimi di restrizione, aliquotare 50 microlitri della miscela di reazione in ciascuno di tre tubi PCR a striscia da 0,2 millilitri etichettati da uno a tre.
Quindi aliquotare 50 microlitri della miscela controllo in ciascuna di tre provette a strip per PCR etichettate da quattro a sei. Aggiungere 100 unità di msp, una nelle provette uno e quattro. Successivamente, aggiungere 50 unità di HPA due nelle provette due e cinque e mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù.
Non aggiungere nulla ai tubi tre e sei poiché sono controlli. Incubare tutti e sei i tubi a 37 gradi Celsius per almeno quattro ore. Quindi aggiungere un microlitro di proteinasi K in ciascun tubo e incubare a 40 gradi Celsius per 30 minuti.
Infine, inattivare la proteinasi K incubando a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Questa procedura viene dimostrata utilizzando NE B'S long amp TAC per PCR endpoint. Tuttavia, altri reagenti e procedure per PCR possono essere sostituiti in un tubo per reazione PCR da 0,2 millilitri posto sul ghiaccio.
Aggiungere il buffer di reazione TAC lungo 5x, dNTP, primers diretti e inversi, il template di DNA ottenuto in precedenza, DNA lungo AMP T DNA polimerasi e acqua priva di nucleasi in quantità sufficiente per ottenere un volume finale di 50 microlitri. Mescolare delicatamente la reazione se necessario e raccogliere tutto il liquido sul fondo del tubo mediante una breve centrifugazione. Trasferire i tubi PCR dal ghiaccio a un termociclatore con il blocco preriscaldato a 94 gradi Celsius e avviare il programma di ciclaggio per una PCR standard a tre passaggi.
Deve essere previsto un unico passaggio iniziale di denaturazione a 94 gradi Celsius per 30 secondi, seguito da 30 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 15 secondi, ricottura a 55-65 gradi Celsius per 30 secondi e allungamento a 65 gradi Celsius per 20 secondi o 50 secondi per kb. A ciò deve seguire un unico allungamento finale a 65 gradi Celsius per cinque minuti. La PCR in tempo reale può essere inoltre eseguita per quantificare le quantità di cinque metilcitosina e cinque idrossietilcitosina.
Si prega di fare riferimento al manuale del prodotto disponibile su nb.com per informazioni specifiche. È stato effettuato un confronto di cinque quantità di idrossietil amina nel Locus 12 mediante PCR endpoint e PCR in tempo reale; sono stati analizzati quattro diversi campioni di tessuto BSY di topo, inclusi cervello, fegato, cuore e milza.
La variazione della cinque idrossietil citosina è evidente nella corsia del gel racchiusa in un riquadro dei campioni di PCR endpoint a scopo comparativo. I dati di PCR in tempo reale sono stati normalizzati rispetto al DNA non tagliato ed è stata utilizzata una curva standard per determinare il numero di copie. I campioni sono stati normalizzati dividendo il numero di copie dei campioni per il numero di copie del controllo non digerito.
Qui, la variazione della cinque idrossietil citosina può essere osservata confrontando le barre gialle. Alcune note sulla realizzazione della tecnica. È fondamentale che tutte le reazioni enzimatiche vengano portate a termine. Per la BGT, è importante che la reazione prosegua per tutta la notte in modo da poter isolare completamente tutti i siti del DNA per Ms.P uno; per HEPA due, è importante che le reazioni durino almeno quattro ore per assicurare il completamento.
E infine, forniamo controlli di DNA e controlli di primer in modo che è possibile eseguire reazioni di controllo in parallelo.
Panoramica
Il kit di analisi EpiMark 5-hmC e 5-mC consente l'analisi e la quantificazione di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina in specifici loci genomici. Questo metodo sfrutta reazioni enzimatiche per differenziare tra queste due modifiche, fornendo informazioni sui modelli di metilazione del DNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genomica
- Biologia Molecolare
Sfondo
- La 5-metilcitosina (5-mC) e la 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) sono importanti modificazioni epigenetiche.
- Comprendere la loro distribuzione nel genoma è fondamentale per lo studio della regolazione genica.
- Il kit EpiMark fornisce un metodo affidabile per distinguere tra queste modificazioni.
- Le reazioni enzimatiche facilitano l'analisi di specifici loci del DNA.
Scopo dello studio
- Analizzare e quantificare 5-mC e 5-hmC all'interno di specifiche regioni genomiche.
- Utilizzare il kit EpiMark per un miglior rilevamento di queste modifiche.
- Confrontare l'efficienza di questo metodo con le tecniche tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Conversione enzimatica del 5-hmC in un sito non scindibile mediante β-glucosiltransferasi.
- Digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione MspI e HpaII.
- Reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare le regioni bersaglio.
- PCR quantitativa (qPCR) per misurare i livelli di 5-mC e 5-hmC.
Risultati principali
- Differenziazione riuscita tra 5-mC e 5-hmC in loci specifici.
- Dati quantitativi che dimostrano la presenza di 5-hmC in vari campioni di tessuto.
- Confronto dei risultati ottenuti con PCR endpoint e PCR in tempo reale.
- Variazione nei livelli di 5-hmC osservata in diversi tessuti di topo.
Conclusioni
- Il kit EpiMark è efficace per analizzare le modifiche della metilazione del DNA.
- Questo metodo offre un vantaggio significativo rispetto al sequenziamento tradizionale con bisolfito.
- Studi futuri possono sfruttare questa tecnica per ottenere informazioni più approfondite sulla regolazione epigenetica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il rilevamento preciso a livello locus-specifico di 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) supporta la validazione di target epigenetici nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze, distinguendo l'idrossimetilazione funzionale dal rumore di metilazione. Questo metodo enzimatico consente una valutazione quantitativa degli stati epigenetici in siti genomici definiti, migliorando la fiducia predittiva negli studi di interazione con il target e di modulazione delle vie metaboliche. Tale approccio colma una lacuna fondamentale nello sviluppo di biomarcatori epigenetici, in cui i metodi basati sul bisolfito non riescono a discriminare la 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) dalla 5-metilcitosina (5-mC).
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi epigenetiche distinguendo la 5-hmC dalla 5-mC in loci specifici, chiarificando i ruoli meccanicistici nella regolazione genica.
- Valore operativo: Fornisce una risoluzione a livello di singolo locus senza richiedere il sequenziamento, riducendo la complessità nei test epigenetici iniziali.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio sui bersagli confermando gli stati di modificazione epigenetica associati all'attività trascrizionale in tessuti rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative basate sull'amplificazione (endpoint o qPCR) che consentono l'analisi comparativa dei livelli di 5-hmC tra diverse condizioni sperimentali.
- Valore operativo: Utilizza infrastrutture PCR standard, permettendo la standardizzazione e la scalabilità del saggio tra diversi laboratori.
- Valore di riproducibilità: Reazioni di controllo interne (mock-glucosilate) normalizzano l'efficienza di digestione, migliorando l'affidabilità dei dati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: L'applicabilità dimostrata in tessuti cerebrali, epatici, cardiaci e splenici del topo supporta l'esplorazione di biomarcatori trasversali ai tessuti.
- Continuità preclinica: Permette il monitoraggio longitudinale della dinamica di 5-hmC nei modelli di malattia, collegando i cambiamenti epigenetici agli esiti fenotipici.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Aiuta a correlare l'idrossimetilazione specifica per locus con l'attivazione del percorso, riducendo l'ambiguità nel meccanismo del bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel flusso di lavoro della scoperta epigenetica dopo l'identificazione del bersaglio e precede la validazione funzionale, fornendo un fenotipaggio molecolare degli stati epigenetici in loci candidati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi determinando se un sito CpG di interesse contiene 5-hmC, guidando la selezione dei bersagli in base all'attività epigenetica.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi e specifici per locus, compatibili con screening di media capacità di modulatori epigenetici.
- Analisi: L'output di qPCR consente la stima del numero di copie e la normalizzazione, facilitando il confronto statistico tra gruppi sottoposti a diversi trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Il rilevamento tissuto-specifico nel cervello e negli organi periferici supporta la valutazione della rilevanza dei biomarcatori in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo utilizza reagenti e attrezzature standard di biologia molecolare, consentendo un'ampia adozione tra gruppi di ricerca in epigenetica, neuroscienze e genomica funzionale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi epigenetici fornendo una discriminazione inequivocabile tra 5-mC e 5-hmC.
- Valore operativo: Elimina la necessità di conversione con bisolfito o di sequenziamento, semplificando il flusso di lavoro e riducendo i tempi di analisi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di bersagli epigenetici fornendo dati quantitativi affidabili sulle modifiche.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli adeguata al rischio, basata su un'effettiva partecipazione epigenetica validata in loci rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di biologia molecolare, inclusa la digestione con enzimi di restrizione e la PCR.
- Dipende dall'accesso alla glucosiltransferasi (T4-BGT) e agli isoschizomeri sensibili alla metilazione (MspI/HpaII).
- Necessita di una progettazione accurata dei primer adiacenti ai siti CCGG per garantire un'ampificazione specifica.
- Per un rendimento ottimale sono richieste reazioni enzimatiche complete (glucosilazione notturna, digestione ≥4 ore).
- Limitato ai loci contenenti CCGG; non applicabile per l'analisi a livello genomica o per siti non contenenti CCGG.
