Misurazione accurata e semplice della citochina pro-infiammatoria IL-1β utilizzando un intero saggio stimolazione del sangue

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le citochine pro-infiammatorie prodotte in un saggio di stimolazione del sangue intero. Innanzitutto, i componenti cellulari del sangue intero vengono isolati dal plasma mediante centrifugazione, e i globuli bianchi vengono enumerati utilizzando la colorazione con arancio acetico. Successivamente, le cellule vengono seminate in piastra e stimolate con LPS seguito da un TP per indurre la produzione di citochine da parte delle cellule che esprimono recettori di riconoscimento dei pattern microbici. I supernatanti di coltura vengono quindi raccolti in specifici punti temporali successivi all'inizio della stimolazione.

Infine, le concentrazioni delle citochine nei soprannatanti vengono misurate mediante un saggio multiplex in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando questo semplice metodo, è possibile valutare rapidamente le variazioni nelle concentrazioni di citochine pro-infiammatorie prodotte da cellule stimolate provenienti da diversi donatori. Questo metodo è particolarmente utile per identificare una malattia infiammatoria mediata da I in pazienti che presentano manifestazioni patologiche anti-infiammatorie, specialmente in condizioni in cui il volume di sangue ottenibile è limitato.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti nella misurazione delle concentrazioni di citochine è che la tecnologia basata su Luminex consente la misurazione simultanea di diverse citochine utilizzando solo un piccolo volume di campione. Ottenere campioni contenenti 10 millilitri o più di sangue venoso da soggetti affetti, nonché da controlli sani abbinati per età e sesso, assicurandosi che i campioni siano raccolti in provette per prelievo di sangue con sodio eparina (vacutainer) e che non vengano aggiunti EDTA o altri anticoagulanti, poiché questi interferirebbero con il saggio. I campioni devono essere processati il più rapidamente possibile dopo il prelievo. Se necessario, i campioni possono essere conservati fino a 24 ore a temperatura ambiente in condizioni di luce fioca.

Centrifugare i campioni di sangue a 3000 RPM per 10 minuti a temperatura ambiente senza freno. Una volta centrifugati i campioni, rimuovere il plasma dalla parte superiore dei tubi avendo cura di non disturbare lo strato del buffy coat contenente le cellule mononucleate. Successivamente, sospendere il buffy coat e il pellet di globuli rossi sottostante in mezzo RPMI senza siero a temperatura ambiente per lavare delicatamente le cellule mediante pipettaggio della miscela.

Quindi trasferire le cellule dal tubo di raccolta in un conico da 50 millilitri. Portare il volume a 50 millilitri con RPMI e capovolgere delicatamente ogni tubo per mescolare. Centrifugare nuovamente le cellule a 3000 g per 10 minuti.

Quindi aspirare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare. Ripetere questo passaggio di lavaggio da due a quattro volte per rimuovere i contaminanti ed eliminare le citochine legate alle cellule. Una volta lavate le cellule, risospendere in RPMI privo di siero fino a un volume totale di 20 millilitri. Per contare le cellule, caricare 20 microlitri di una miscela uno a uno tra campione e colorante orange Aine in una camera di visione monouso. L'orange Aine, utilizzato a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro, colorerà esclusivamente le cellule bianche nucleate, permettendo di distinguerle dai globuli rossi.

Contare solo le cellule D positive una volta ottenuto il numero di cellule. Ripesare i campioni in RPMI privo di siero in modo da raggiungere una concentrazione finale di 2 milioni di cellule per millilitro. Per ogni campione, etichettare pozzetti duplicati di una piastra a 24 pozzetti con le condizioni sperimentali da testare.

In questo caso, le condizioni sono: non stimolato, LPS da solo, un TP da solo e LPS più un TP. Aggiungere un millilitro di cellule diluite in ogni pozzetto e aggiungere LPS nei pozzetti appropriati a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con anidride carbonica al 5% per due ore e 40 minuti. Al termine di questo periodo di incubazione iniziale, aggiungere il TP a una concentrazione finale di due millimolari nei pozzetti con TP soltanto e LPS più TP. Incubare quindi le piastre per ulteriori 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine della seconda incubazione, trasferire le cellule da ogni pozzetto in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-etichettata, centrifugare i campioni a 10.000 RRP M per due minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire il sopranatante da ogni provetta in una nuova provetta EOR pre-etichettata. Il sopranatante può essere sottoposto immediatamente a saggio per citochine oppure conservato congelato per valutare le concentrazioni di IL-1β o di altre citochine. Nei campioni, utilizziamo il Bio-Plex Pro Human Cytokine X-Plex con il sistema Bio-Plex 200.

Secondo le istruzioni del produttore. In questa figura, l'analisi della produzione di IL-1β dopo stimolazione di cellule di sangue intero normale con LPS, ATP o entrambi gli stimoli insieme mostra una risposta a LPS più ATP, la cui entità dipende dal numero di cellule stimolate. Al contrario dei controlli sani, i saggi su sangue intero effettuati su pazienti con patologie autoinfiammatorie rivelano un aumento della produzione di IL-1β dopo stimolazione con LPS, in assenza di ATP aggiunto esogenamente. Non dimenticare che lavorare con fluidi corporei umani come il sangue può essere estremamente pericoloso e si devono sempre adottare misure di precauzione universali quando si esegue questa procedura.