Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

L'elettro-ionizzazione secondaria, la spettrometria di massa o CS EMS consentono l'analisi di volatili batterici senza la necessità di alcun campione. Pre-trattamento. Lo spazio di testa della coltura batterica viene spostato dall'anidride carbonica nella camera di reazione cssi. Quando i volatili attraversano la camera di reazione SSI, passano attraverso la nuvola di elettrospruzzo e si ionizzano.

Una volta ionizzati, i volatili vengono inseriti nello spettrometro di massa per l'analisi. Il gas di trasporto in eccesso e i volatili batterici non reattivi vengono fatti passare attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere eventuali agenti batterici come misura aggiuntiva di sfiato di protezione di una cappa chimica. In definitiva, questo protocollo CSI MS offre impronte digitali batteriche volatili in pochi minuti.

Prevediamo che questa tecnologia potrebbe essere utilizzata in molte applicazioni, tra cui l'espirazione, l'analisi del respiro per le malattie infettive o persino applicata ai sistemi alimentari in cui potremmo essere in grado di rilevare rapidamente gli agenti patogeni che si trovano sul nostro cibo. Ci sono diversi vantaggi principali in questa tecnica. Rispetto ai metodi esistenti come GCMS sift, MS e PT, RM S first, i volatili non richiedono alcun pretrattamento prima dell'analisi.

In secondo luogo, è possibile frammentare ioni specifici nella miscela volatile, il che facilita l'identificazione del composto. E terzo, è rapido. In genere ci vogliono meno di cinque minuti.

Per analizzare ogni campione, scegli il recipiente appropriato per la coltivazione della tua coltura, considerando le esigenze di crescita della specie, nonché l'efficiente consegna di sostanze volatili allo spettrometro di massa. In questa dimostrazione, abbiamo selezionato flaconi standard da 100 millilitri. I volatili batterici vengono consegnati allo spettrometro di massa da un flusso di gas di trasporto per assemblare il vettore.

Le linee del gas si adattano alle bottiglie di coltura con tappi filettati che hanno almeno due porte per esche. Inserire le linee di ingresso e uscita del gas attraverso le porte dell'esca e collegare eventuali porte aggiuntive prima di coltivare i campioni. Pressurizzare i recipienti e immergerli in acqua per verificare la presenza di perdite.

Le fughe di gas sono una causa primaria di risultati atipici sotto forma di debole o assente. I segnali di ioni volatili crescono durante la notte. Colture di e coli, K 12 e pseudomonas aerogen, PAO uno in LB Lennox che prepara due repliche biologiche per ogni specie.

Preparare nove flaconi sterili per colture contenenti 50 millilitri di LB Lennox e un flacone non inoculato da utilizzare come inoculato in bianco, ogni coltura notturna in due flaconi per campioni. Creando repliche tecniche, incubare le colture e il bianco per 24 ore a 37 gradi Celsius. Poiché il CEMS è specificamente progettato per campionare sostanze volatili, limitare l'uso di prodotti profumati per la cura personale prima di utilizzare lo strumento in modo stretto.

Ostruire tutte le sostanze chimiche volatili in laboratorio e controllare il più possibile le correnti d'aria durante i test per evitare la contaminazione dello strumento e delle linee di trasferimento del gas. In caso di agenti biologici vitali, installare filtri della dimensione dei pori appropriata nella linea del gas di trasporto. I filtri non interferiscono con il trasferimento dei volatili alla camera di reazione sesi, ma possono influire leggermente sull'efficienza del trasferimento dell'aerosol.

Per verificare che la tensione di alimentazione sia interrotta e che il sistema sia scarico di elettricità, controllare le spie luminose sul voltage fornitore spento. Assicurarsi che la tensione sul multimetro sia zero e mettere a terra i cavi elettrici. A questo punto, installare la soluzione elettrospray per l'analisi.

In modalità ioni positivi, utilizziamo una soluzione elettrospray di acido formico allo 0,1%, 5% di metanolo e 94,9% di acqua Per ottenere un'intensità e una stabilità ottimali del segnale, accendere il gas di trasporto dell'anidride carbonica e impostare la portata su due litri al minuto. Applicare pressione al serbatoio dell'elettrospray per avviare l'erogazione della soluzione dell'elettrospray alla camera di reazione a una velocità di flusso di cinque nanolitri al secondo. Quindi attivare l'alimentazione di tensione e regolare la tensione a 2,5 kilovolt.

La tensione applicata influisce sull'intensità degli ioni del segnale e sulla stabilità del cono Tailor spray per le tensioni del nostro sistema comprese tra due e cinque kilovolt. Fornire i migliori risultati nell'esercizio in modalità ioni positivi Attenzione poiché a questo punto le superfici metalliche della sorgente di ionizzazione sono in grado di erogare uno shock pericoloso. Ora imposta un metodo di sintonizzazione per il monitoraggio dello spettro SEMS.

Deselezionare la casella di controllo Acquisizione a più canali o MCA. Impostare il tempo di acquisizione su 10-15 minuti e avviare l'acquisizione dei dati. Osservare gli spettri del fondo del gas di trasporto e apportare regolazioni precise alla tensione applicata per ottenere un cromatogramma ionico totale stabile e scansioni riproducibili.

Continuare a raccogliere spettri e A TIC per cinque minuti per assicurarsi che lo strumento sia stabilizzato con lo strumento assicurato. Immettere i parametri di acquisizione appropriati per l'esperimento. Registrare uno spettro di fondo del gas di trasporto per esperimenti futuri.

Per raccogliere uno spettro vuoto. Dirigere il flusso di gas di trasporto attraverso le linee di bypass, quindi collegare il campione bianco con le valvole chiuse alle linee di trasferimento dello strumento. Aprire le valvole del flacone del campione e chiudere le valvole delle linee di bypass.

Per spettri riproducibili. Lasciare che il sistema si equilibri per 30 secondi, durante i quali l'umidità nella camera di reazione si stabilizza. Per assicurarsi che il sistema sia equilibrato, monitorare la TIC, che cambierà durante il periodo di equilibrio seguito dalla stabilizzazione.

Una volta che il sistema è equilibrato, avviare la raccolta dello spettro. Dopo aver raccolto lo spettro, rimuovere la bottiglia del campione aprendo prima le linee di bypass del gas di trasporto. Quindi chiudendo le valvole del campione.

E infine, la rimozione del flacone del campione. Lavare il sistema con il gas di trasporto per due-quattro minuti per rimuovere l'umidità e i volatili assorbiti dalle linee di trasferimento e prevenire il trascinamento da campione a campione. Raccogli i dati delle impronte digitali volatili per ogni campione batterico, raccogliendo in modo intermittente spettri bianchi aggiuntivi per garantire una sottrazione completa del bianco.

Le impronte digitali volatili in modalità ioni positivi per e coli e p aerogen. Coltivato aerobicamente in LB Lennox per 24 ore a 37 gradi Celsius sono distinti. Lo spettro volatile di E coli è dominato da indu con un rapporto massa/carica di 118, mentre lo spettro di Pseudomonas aerogen contiene una varietà più ampia di picchi di proteine aggiungibili.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante registrare i parametri strumentali ottimizzati per l'analisi, come la tensione applicata, la composizione della soluzione elettrospray e la portata del gas di trasporto. È anche importante conservare le registrazioni degli spettri rappresentativi in modo da poter riprodurre le analisi in futuro. Non dimenticare che lavorare con batteri patogeni e alta tensione potrebbe essere estremamente pericoloso.

Pertanto, è necessario prendere sempre precauzioni come limitare l'accesso a css CMS durante l'esperimento. Quindi ora dovresti essere in grado di ottenere in modo riproducibile un CSS, spettri EMS per i volatili batterici nel tuo sistema. Buona Fortuna.