Name: Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Scopri come valutare la citotossicità delle cellule NK contro cellule T CD4+ infettate da HIV-1. Questo metodo utilizza l'isolamento di blasti T infetti e saggi di degranulazione per studiare le risposte immunitarie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Se fatto correttamente il test descritti in questo protocollo dovrebbe fornire un quadro rappresentativo della capacità delle cellule NK di degranulano contrari e lisare HIV-1 cellule infette (vedi Figura 5). Degranulazione delle cellule NK in risposta ad infezione da HIV delle cellule e le cellule NK lisi cellule infettate da HIV dovrebbe essere direttamente proporzionale 10. Risultati affidabili per i due test funzionale delle cellule NK di misurare le risposte citotossiche per le cellule infettate da HIV dipendono l&#39;isolamento delle cellule NK altamente purificato, nonché una popolazione altamente purificata delle cellule infette. Dopo aver purificato le cellule NK e HIV-1 le cellule infettate sono fondamentali per il raggiungimento di un effettore abbastanza preciso bersaglio rapporto cellulare. Allo stesso modo, la rimozione delle cellule morte e dalle popolazioni di cellule apoptotiche l&#39;obiettivo è importante prima di 51 Cr etichettatura o l&#39;incubazione con le cellule effettrici. 51 Cr possono essere internalizzati dalle cellule che sono in fase di apoptosi come la presenza di cellule morte o apoptosi durante la fase di etichettatura isotopo si tradurrà in un comunicato alta spontaneo e distorcere la lisi% calcolato specifici. Inoltre, la presenza di cellule morte o apoptosi può scatenare la degranulazione delle cellule NK con conseguente livelli anormalmente elevati di espressione CD107a. Pipettaggio preciso è necessario quando si rimuove la cellula senza sopranatanti dopo l&#39;incubazione delle cellule NK e cellule bersaglio nei 51 saggi rilascio Cr, come le differenze nel volume del sopranatante rimosso da ogni replica e si tradurrà in alto deviazioni standard. Modifiche possono essere apportate a tali protocolli per valutare il ruolo di specifici recettori NK nello scatenare la lisi delle cellule NK di infezione da HIV delle cellule tramite l&#39;incubazione del effettori o obiettivi prima di co-coltura con anticorpi antagonista ai recettori specifici o ligandi 6,11. Citochine trattati con cellule NK (ad esempio, IL-2, IL-15) può essere utilizzato per valutare la funzionalità delle cellule NK stimolate 12. Allo stesso modo, anticorpo-dipendente saggi di citotossicità delle cellule potranno essere eseguiti usando questi protocolli. Anticorpi anti-HIV (es. anti-gp120) possono essere aggiunti alle cellule bersaglio per il riconoscimento da parte delle cellule NK bassa affinità per il recettore Fc CD16 13. Questi test, pur essendo stato creato per misurare le risposte delle cellule NK citotossiche per le cellule infettate da HIV, possono anche essere modificati per misurare la capacità delle cellule NK per la produzione di citochine dopo infezione da HIV riconoscimento delle cellule. Anche se abbiamo descritto in questo protocollo l&#39;uso di cellule in vitro le cellule infette come obiettivo abbiamo recentemente descritto la generazione di cellule bersaglio da pazienti infettati con HIV. Ciò richiede l&#39;isolamento di cellule CD4 + T-cellule seguita dalla dilatazione delle cellule nel corso di un periodo di due settimane dopo stimolazione con mitogeni in presenza di interleuchina-2 11. Dopo il periodo di due settimane di espansione, i protocolli descritti in questo articolo sono utilizzati per isolare le cellule bersaglio.

<table><tbody><tr><td>Tubi Vaccutainer (eparina sodica)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'isolamento delle cellule T CD4+ RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di separazione dei linfociti</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Streptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'espansione delle cellule T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>HBSS CMF (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'isolamento negativo delle cellule NK</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'isolamento positivo CD4+</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la rimozione delle cellule morte</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Chromium</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per contatore gamma</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>Contatore gamma automatico 2470</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e utilizzo di hiv-1 cd4 infetti primaria + t-cells come cellule bersaglio nei test di cellule natural killer citotossici

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) sono una componente vitale della risposta immunitaria innata di cellule infettate da virus. E &#39;importante capire la capacità delle cellule NK di riconoscere e lisare HIV-1 le cellule infettate a causa individuare eventuali aberrancy nella funzione delle cellule NK contro le cellule infettate da HIV potrebbe portare a terapie che potrebbero aumentare la loro attività citolitica. Vi è la necessità di utilizzare con infezione da HIV primario delle cellule T esplosioni come cellule bersaglio piuttosto che infetta-linee di cellule T nel test di citotossicità. Linee di cellule T, anche in assenza di infezione, sono molto sensibili alla lisi delle cellule NK. Inoltre, è necessario l&#39;utilizzo di cellule autologhe primarie per evitare grandi complessi di istocompatibilità di classe I squilibri tra il bersaglio e cellule effettrici che si tradurrà in lisi. I primi studi valutare le risposte delle cellule NK citolitica di primari di HIV-infettate le cellule non è riuscito a mostrare l&#39;uccisione significativa del 1,2 cellule infette. Tuttavia, con HIV-1 infetti primarie cellule T come cellule bersaglio nei test funzionali delle cellule NK è stata difficile a causa della presenza di contaminanti cellule non infette 3. Questa cellula infettata incoerente rapporto tra cellule non infette si tradurrà in una modifica uccidendo cellule NK tra i campioni che non può essere dovuto alla variabilità in funzione dei donatori di cellule NK. Pertanto, sarebbe utile per lavorare con una popolazione purificata cellule infette al fine di standardizzare le effettrici delle cellule di indirizzare i rapporti tra esperimenti 3,4. Qui mostriamo l&#39;isolamento di una popolazione altamente purificata di HIV-1 le cellule infettate sfruttando la capacità di HIV-1 di down-modulare CD4 su cellule infettate e la disponibilità di kit commerciali per rimuovere le cellule morte o morenti 3-6. L&#39;infezione primaria purificato di cellule T esplosioni possono poi essere utilizzati come bersagli sia in un degranulazione o test citotossico con purificato le cellule NK, come la popolazione effettore 5-7. L&#39;uso di cellule NK come effettori in un test di degranulazione valuta la capacità di una cellula NK per la diffusione del contenuto litica dei lisosomi specializzate 8 chiamata &quot;granuli citolitica&quot;. Con la colorazione con un anticorpo fluorocromo coniugato contro CD107a, una proteina di membrana lisosomiale che diventa espresso sulla superficie delle cellule NK, quando i granuli citolitica fusibile alla membrana plasmatica, siamo in grado di determinare la percentuale di cellule NK degranulano in risposta al riconoscimento delle cellule bersaglio. In alternativa, l&#39;attività delle cellule NK litica può essere valutata in un test citotossico che consente la determinazione della percentuale di cellule bersaglio lisate dal rilascio di 51 Cr all&#39;interno della cellula bersaglio in presenza di cellule NK.

Saggi di citotossicità per misurare le risposte delle cellule naturali litici killer per le cellule infettate da HIV è limitata dalla purezza delle cellule bersaglio. Dimostriamo qui l&#39;isolamento di una popolazione altamente purificata di infezione da HIV-1 primario a cellule T colpi sfruttando la capacità di HIV-1 s di down-modulare CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

Le cellule natural killer (NK) rappresentano una componente vitale della risposta immunitaria innata contro le cellule infettate da virus. È importante comprendere la capacità delle NK...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la risposta citotossica delle cellule NK nei confronti di cellule infette da HIV-1. Questo viene ottenuto isolando ed infettando prima le cellule T positive per CD4 provenienti da sangue venoso. Successivamente, le cellule natural killer vengono isolate dallo stesso donatore.Successivamente, i linfociti T CD4 positivi non infetti vengono isolati dalle cellule infette. Infine, le cellule infette e le cellule NK vengono utilizzate rispettivamente come bersagli ed effettori in uno dei due saggi per valutare la citotossicità delle cellule NK. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come le cellule NK possano rispondere a cellule infette da HIV-1 attraverso la regolazione positiva di CD107a, un'espressione determinata mediante analisi citofluorimetrica, oppure attraverso il rilascio di cromo-51 rilevato da un contatore gamma.Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo dell'HIV-1, come ad esempio se le cellule NK rispondono alle cellule infette da HIV-1, quali interazioni recettore-legante sono importanti nelle interazioni tra cellule NK e T, e se le proteine virali dell'HIV-1 modulano la risposta delle cellule NK alle cellule infette da HIV-1. Dopo aver stimolato le cellule T CD4-positive isolate dal sangue periferico umano mediante perle accoppiate ad anti-CD3 e anti-CD28 per 72 ore, contare la popolazione risultante di cellule T mediante emocitometro, quindi suddividere la coltura in due gruppi: circa 2 × 10⁶ cellule T in un tubo conico da 15 millilitri da utilizzare come gruppo di controllo non infetto, e il resto della sospensione di cellule T CD4-positive in un tubo conico da 50 millilitri destinato al gruppo di infezione.Centrifugare entrambi i gruppi a 300 ×g a 22 gradi Celsius per 10 minuti, quindi aspirare il surnatante. Sospendere le cellule T CD4 positive dal tubo da 50 millilitri direttamente in fluidi di coltura contenenti virioni e aggiungere polibrene a una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro. Successivamente, centrifugare per infettare le cellule a 1200 ×g per due ore a 20-25 gradi Celsius.Qui le cellule vengono infettate con DHIV tre a una molteplicità di cinque. Al termine dell'infezione mediante centrifugazione, rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule infette a una densità di tre per 10 alla sesta per millilitro in RPMI completo integrato con 100 unità per millilitro di IL-2.Quindi coltivare le cellule non infette e le cellule appena infette per 72 ore in una piastra a sei pozzetti. Se è stato utilizzato un virus non replicante per infettare le cellule, oppure per cinque-sette giorni se è stato utilizzato un virus replicante, raccogliere il sopranatante contenente le colture di linfociti T CD4 positivi infetti e centrifugare le cellule a 300 ×g per 10 minuti a 22 °C con la frenata attiva; aspirare il sopranatante e risospendere. Sospendere il pellet in due millilitri di PBS con 2% di FBS e due millimoli di EDTA e contare le cellule mediante emocitometro utilizzando un kit di isolamento CD4 positivo.Rimuovere le cellule T CD4 positive non infette. Seguire le istruzioni del produttore per l'isolamento delle cellule T CD4 positive, con l'eccezione che viene utilizzato un rapporto di una molecola anti-CD4 per cellula. Successivamente, rimuovere le cellule morte dalla popolazione cellulare purificata contenente il virus mediante un kit per l'eliminazione delle cellule morte.Secondo le istruzioni del produttore, raccogliere la popolazione di linfociti T vivi e centrifugare le cellule purificate a 300 G per 10 minuti. Con la frenata attivata, rimuovere il soprannatante, sospendere il pellet e risospendere in un millilitro di RPMI completo, quindi contare le cellule. I linfociti NK del sangue periferico vengono isolati per primi dallo stesso donatore da cui sono stati ottenuti i linfociti T positivi per CD4.Dopo la coltura notturna, contare le cellule NK con un emocitometro, centrifugare a 300 G per 10 minuti con la frenata attivata, quindi risospendere le cellule in RPMI completo, aggiustando la concentrazione finale a 10⁶ cellule per millilitro. Successivamente, raccogliere e centrifugare le sospensioni di linfociti T purificati, infetti e di controllo non infetti a 300 G per 10 minuti. Con la frenata attivata, rimuovere il SANE e risospendere i pellet.In RPMI completo a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro per un controllo positivo, circa due volte 10 alla sesta di cellule K562 suscettibili alla lisi da NK vengono utilizzate in questo video. Centrifugare le cellule K562 a 300 ×g per 10 minuti con la frenata attivata, quindi rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in RPMI completo a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro.Dopo aver lavato tutte le popolazioni cellulari e risospese alle loro concentrazioni sperimentali, mettere insieme le cellule NK con cellule K 5 62, cellule T non infette o cellule T infette da HIV. In pozzetti singoli di una piastra a fondo a V da 96 pozzetti, verrà utilizzato un solo replicato per tipo di cellula bersaglio per misurare la degranulazione aspecifica delle cellule NK. Aggiungere 100 microlitri di cellule effettrici NK e 100 microlitri di solo mezzo in uno.Aggiungere in ogni pozzetto 10 microlitri di anticorpo anti-CD107a coniugato con fluorocromo e centrifugare la piastra a 20 ×g per due minuti con la frenata attiva a 22 °C. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C e 5% di anidride carbonica per quattro ore. Dopo l'incubazione, centrifugare la piastra a 400 ×g per cinque minuti con la frenata attiva a 22 °C, quindi rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta aspirante da 2 millilitri dotata di punta P200.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di buffer per citofluorimetria in ogni pozzetto e quindi incubare le cellule con gli anticorpi anti CD3 14 20 Pacific blue e anti CD56 A PC su ghiaccio per 20 minuti. Dopo la marcatura cellulare, aggiungere 200 microlitri di buffer per citofluorimetria in ogni pozzetto e centrifugare la piastra a 400 ×g per cinque minuti. Con il freno attivo a 22 gradi Celsius, aspirare con attenzione il buffer per citofluorimetria da ogni pozzetto.Utilizzando una pipetta aspirante da due millilitri dotata di una punta da 200 microlitri, assicurandosi di non disturbare il pellet, lavare nuovamente le cellule e quindi risospendere i pellet in 200 microlitri di paraformaldeide al 1% in PBS privo di calcio e magnesio. Infine, trasferire le sospensioni cellulari in provette per citofluorimetria e portare il volume totale nelle provette a 300 microlitri aggiungendo circa 100 microlitri di paraformaldeide al 1% in PBS privo di calcio e magnesio a ciascuna. Successivamente, acquisire due volte 10 alla quarta eventi di cellule NK mediante citofluorimetria utilizzando il software FACSDiva e analizzare i dati con il software FlowJo. Etichettare cellule T bersaglio purificate, infette e non infette da HIV V1, con 125 microcurie di cromo 51 in soluzione salina per 10 alla sesta cellule per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in una provetta conica da 15 millilitri come controllo positivo; etichettare anche 10 alla sesta cellule K562 con 100 microcurie di cromo 51 per due ore.Nelle stesse condizioni di coltura. Utilizzare RPMI completo per portare il volume finale della soluzione di marcatura per ciascuna popolazione cellulare a 500 microlitri. Il volume di cromo 51 aggiunto alle cellule bersaglio viene calcolato utilizzando il calcolatore universale del decadimento radioattivo disponibile sul sito web di PerkinElmer, mentre le cellule bersaglio vengono marcate.Rimuovere le cellule NK precedentemente isolate dalla coltura e contarle; centrifugare le cellule NK a 300 G per 10 minuti con freno attivato e risospendere i pellet in RPMI completo; suddividere le sospensioni cellulari ottenute in tre provette coniche da 15 millilitri. Regolare la densità cellulare a 10 alla quinta per millilitro nella prima provetta, 2,5 volte 10 alla quinta per millilitro nella seconda provetta e cinque volte 10 alla quinta per millilitro. Nella terza provetta, le cellule NK verranno utilizzate come cellule effettrici in rapporto 1:1, 2,5:1 e 5:1 rispettivamente nel saggio di rilascio del cromo 51.Rimuovere le cellule bersaglio ora marcate dall'incubatore e aggiungere 4,5 millilitri di RPMI completo in ogni provetta. Centrifugare le provette a 300 ×g per 10 minuti. Quindi versare con attenzione il soprannatante in un contenitore per rifiuti liquidi radioattivi senza disturbare il pellet.Lavare le cellule bersaglio altre due volte per rimuovere tutto il cromo 51 non assorbito. Il soprannatante del terzo lavaggio può essere smaltito in un contenitore per rifiuti liquidi non radioattivi. A questo punto, risospendere nuovamente i bersagli in RPMI completo fino alla densità cellulare finale di 10 alla quinta per millilitro, mostrata come esempio di un tipico allestimento per un saggio di rilascio del cromo 51.Si noti che ogni gruppo viene eseguito in triplice aliquota, aggiungendo 100 microlitri di bersagli marcati in ciascuna delle pozzette indicate di una piastra a 96 pozzette con fondo a V, per un numero finale di cellule bersaglio pari a 10 alla quarta per pozzetta. Successivamente, aggiungere 100 microlitri delle sospensioni di NK alle cellule bersaglio nei rapporti cellule effettrici:cellule bersaglio opportunamente indicati. Quindi, aggiungere 100 microlitri di bersagli nelle pozzette corrispondenti in cui le cellule effettrici sono assenti, per i gruppi di rilascio massimo e spontaneo.Aggiungere al gruppo di rilascio spontaneo ulteriori 100 microlitri di RPMI completo, centrifugare la piastra a 20 G per due minuti con freno attivato, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore. Al termine dell'incubazione di quattro ore, aggiungere cinque microlitri di una diluizione 1:10 di globuli rossi umani in RPMI completo in ogni pozzetto, esclusi i pozzetti di rilascio massimo; quindi aggiungere 100 microlitri di solfato di sodio ESAL al 10% nei pozzetti di rilascio massimo e centrifugare la piastra a 400 G per cinque minuti. Per separare le cellule, etichettare un tubo per contatore gamma per ciascuno dei pozzetti sperimentali e di controllo.Nella piastra a 96 pozzetti, raccogliere 100 microlitri di surnatante privo di cellule da ogni pozzetto e trasferire il surnatante di ogni pozzetto nei tubi prelivello. Misurare la quantità di cromo 51 in ogni tubo mediante un contatore gamma automatico PerkinElmer 24 70. I seguenti diagrammi a dispersione mostrano una tipica strategia di gating citofluorimetrico per l'analisi dei risultati di un CD 1 0 7.Un saggio di degranulazione. Innanzitutto, le singole cellule vengono selezionate, escludendo aggregati o doppietti in un grafico di FSCA rispetto a FSCH. Successivamente, la popolazione di singole cellule viene analizzata in un grafico di FSCA rispetto a SSC, selezionando la popolazione di linfociti indicata nuovamente dal cerchio rosa.La finestra dei linfociti viene quindi rappresentata come CD 3 14 20 contro CD 56, selezionando la popolazione CD 56 positiva e CD 3 14 20 negativa, come indicato dall'ovale rosa verticale. Qui l'NK GA è rappresentato come CD 1 0 7 A contro CD 56 per visualizzare le cellule NK che hanno degranulato; nelle due figure seguenti sono mostrati risultati rappresentativi della valutazione della risposta citotossica delle cellule natural killer contro cellule infette da HIV uno. Le cellule NK sono state valutate per la loro capacità di degranulare in assenza di bersagli e in risposta alle cellule K 5 62, alle cellule T primarie CD quattro positive e alle cellule T primarie infette da HIV, come determinato dalla percentuale di cellule NK che esprimono sulla superficie CD 1 0 7 A. I numeri in ciascun quadrante rappresentano la percentuale di cellule NK totali in questa figura.I linfociti NK sono stati valutati per la loro capacità di lizzare cellule K562, cellule T CD4 positive non infette e cellule T infette da HIV-1 in un saggio di rilascio di cromo 51 a rapporti tra cellule effettrici e cellule bersaglio di 2,5:1, 5:1 e 7,5:1 dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha contribuito ad aprire la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'HIV-1 per esplorare come le cellule uccisore naturale rispondano alle cellule infette da HIV-1 in pazienti affetti da HIV.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di...

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

Questo video mostra l'esecuzione di un test di rilascio di lattato deidrogenasi per determinare la citotossicità delle cellule natural killer (NK) contro le cellule tumorali bersaglio. Il test quantifica il rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi citoplasmatico dalle cellule tumorali misurando l'assorbanza del prodotto di colore rosso formato.

Un test in vitro per la valutazione della citotossicità delle cellule natural killer contro le cellule tumorali

CD4+ Le cellule T regolatorie sono potenti immunomodulatori e svolgono importanti funzioni nell'omeostasi immunitaria. La scarsità di queste cellule nel sangue periferico rende difficili gli studi funzionali, in particolare nel contesto dell'infezione da HIV-1. Qui descriviamo un metodo per isolare ed espandere le Treg CD4+ funzionali dal sangue periferico di individui con infezione da HIV-1.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

A differenza privi di cellule HIV-1 particelle, cellule T CD4 + infetti siano effettivamente rilevati dalle cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC). Questo manoscritto descrive un metodo in cui le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) o pDCs isolate sono co-coltura con HIV-1 le cellule T infette di valutare sensing innato da pDCs valutata dal rilascio di tipo I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

L'obiettivo di questo studio era quello di formulare le tecnologie che permettono per la trasduzione del gene successo in primarie cellule natural killer (NK). La trasduzione lentivirale destrano-mediata di umani o risultati primari di cellule NK del mouse in una maggiore efficienza di espressione genica. Questo metodo di trasduzione del gene migliorerà notevolmente la manipolazione genetica delle cellule NK.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Un metodo semplice per ottenere cloni delle cellule T e NK dai pazienti CAEBV è stato sviluppato con alta efficienza, una piccola quantità di sangue periferico e una basso-dose del-2.

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

Descriviamo qui un saggio di uccisione a base di citometria in vivo che consente di esaminare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T (CTL) a un antigene tumorale modello. Forniamo esempi di come questo saggio elegante può essere impiegato per gli studi meccanicistici e per i test di efficacia dei farmaci.

Sartoria in vivo saggi di citotossicità per studiare l'Immunodominanza nelle risposte delle cellule CD8+ T specifiche del tumore

Qui, descriviamo alcuni metodi consolidati per determinare lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e l'attivazione della risposta proteica dispiegata (UPR), con particolare enfasi sull'infezione da HIV-1. Questo articolo descrive anche una serie di protocolli per studiare l'effetto dello stress ER/UPR sulla replicazione dell'HIV-1 e sull'infettività del virione.

Misurazione dello stress del reticolo endoplasmatico e della risposta proteica dispiegata nelle cellule T infette da HIV-1 e analisi del suo ruolo nella replicazione dell'HIV-1

Scopri come valutare la citotossicità delle cellule NK contro cellule T CD4+ infettate da HIV-1. Questo metodo utilizza l'isolamento di blasti T infetti e saggi di degranulazione per studiare le risposte immunitarie.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici (Video) | JoVE Journal

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

Esplora altri video