Name: Termodinamica di Folding delle proteine di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Impara a misurare l'energia libera di Gibbs del folding delle proteine di membrana mediante spettroscopia di fluorescenza del triptofano. Questo metodo utilizza vescicole LAR per studiare la termodinamica e la stabilità proteica.

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Ringraziamo Wu Pechino per l&#39;utilizzo dei suoi dati. Questo lavoro è stato supportato da un riconoscimento alla CARRIERA NSF a JEK

1. Preparazione di ~ 50 nm Diametro piccole vescicole unilamellari (SUV) per Folding delle proteine ​​di membrana <ol><li> Una soluzione di 1,2-dimyristoyl-sn-glicero-3-phosphocholine (DMPC) lipidi in cloroformio viene acquistato e aliquotted in fiale di vetro pulita in quantità di 20 mg per fiala per la conservazione. Uno strato di gas azoto viene aggiunto a ogni fiala per prevenire l'ossidazione dei lipidi, e le fiale sono chiusi con tappi e parafilm. I flaconcini sono conservati in un congelatore di -20 ° C fino al momento dell'uso. </li><li> Un singolo flaconcino che contiene una aliquota di 20 mg di lipidi in cloroformio viene utilizzato per ogni esperimento. Il contenuto della fiala vengono essiccati utilizzando un flusso di azoto per 1 ora fino a quando non rimane solvente. </li><li> Lipidi secchi sono risospesi in 1 ml di tampone fosfato di potassio 20 mM (pH = 7,3) con un sonicatore bagnomaria per circa 30 secondi. Questa soluzione di lipidi sospesi apparirà nuvoloso, e viene trasferito in una plastica da 15 ml tubo con un fondo conico. Un altro 1 aliquota mL di tampone fosfato viene aggiunta al flacone di vetro vuote che in origine conteneva dei lipidi, e sonicazione si ripete, la soluzione viene quindi aggiunto allo stesso tubo da 15 ml. Questo processo viene ripetuto per un totale di 4 volte fino a quando il volume finale nel tubo è di 4 ml, con una conseguente concentrazione dei lipidi di 5 mg / ml di questa soluzione vescicola stock. </li><li> I 4 ml di soluzione delle vescicole lipidiche è collocato in un ambiente caldo (~ 30 ° C) bagno d'acqua, e sonicato utilizzando un microtip ultrasonicatore per 1 ora a duty cycle del 50%. Lo scopo del bagnomaria è duplice. In primo luogo, impedisce la soluzione dei lipidi di diventare troppo caldo a causa del processo di sonicazione. In secondo luogo, il bagno caldo assicura che la temperatura della soluzione acquosa lipidica rimane al di sopra della temperatura di transizione di fase doppio strato durante la sonicazione, per DMPC, questa temperatura di transizione è ~ 23 ° C. </li><li> La soluzione sonicato è passato attraverso una siringa da 0,22 micron filtro per rimuovere i detriti dalla punta sonicatore, e questa soluzione filtrata viene equilibrata durante la notte a 37 ° C. </li></ol> 2. Preparazione del campione per la curva iniziale fluorescenza Unfolding <ol><li> Una soluzione madre di 10 M urea in tampone fosfato 20 mM (pH 7,3) è fatto. E 'essenziale che l'acqua da aggiungere al solido (e non viceversa) perché la grande quantità di urea occupa un volume significativo nella soluzione. Questa soluzione di urea può essere fatta con l'aggiunta di soluti ad un ambiente pulito, una bottiglia vuota e l'aggiunta di acqua fino al volume di destinazione finale. Questa soluzione potrebbe richiedere il riscaldamento a bagnomaria o su una piastra calda con mescolando per sciogliere il soluto. L'urea è igroscopico e quindi, la concentrazione effettiva della soluzione di riserva urea devono essere determinate con indice di rifrazione 1. </li><li> Una soluzione tampone stock di fosfato 20 mM (pH 7,3) è fatto. </li><li> Una soluzione di riserva della dispiegato proteina è preparato. Questa soluzione di proteine ​​di riserva dovrebbe avere una concentrazione di circa 200 proteine ​​mM in 8 M urea, 20 mM tampone fosfato. </li><li> Campioni per studi di fluorescenza sono preparati nel modo seguente. Volumi adeguati di proteine ​​stock (paragrafo 2.3), lipidi soluzione madre (5 mg / ml lipidi, sezione 1), fotografia di soluzione di urea 10 M (sezione 2.1), e tampone fosfato stock (sezione 2.2) sono combinati per rendere campioni contenenti ~ 4 proteina mM, 1 mg / mL lipidi, e 0-8 M urea in incrementi di 1 M. Il volume totale di ogni campione è di 200 microlitri. Un foglio di esempio (Tabella 1) è compreso che i volumi di liste di desiderata con uno stock 200 mM soluzione proteica. </li><li> Campioni in bianco sono realizzate come descritto nel paragrafo 2.4, tuttavia, la proteina non viene aggiunto. Al posto di proteine, 4 ml di una soluzione di urea 8 M possono essere aggiunti in modo da concentrazioni di altri componenti sono identici a quelli nella sezione 2.4. Questi spazi vengono utilizzati per sottrarre dispersione del segnale e background che appare negli spettri di fluorescenza di proteine. </li><li> I campioni di sezioni 2.4 e 2.5 sono autorizzati a incubare a 37 ° C per almeno 2 ore prima misura di spettri di fluorescenza per assicurare pieghevole completo e equilibrio. </li></ol> 3. Misura di spettri di fluorescenza Triptofano fluorescenza di ciascun campione e vuota è misurata con un fluorimetro steady-state. Spettri di fluorescenza devono essere registrati con lunghezza d'onda di eccitazione di 290 nm per evitare di eccitazione dei residui di tirosina e digitalizzati 305-500 nm. Ingresso tipici e banda passante uscita è di 3 nm. L'incremento lunghezza d'onda e tempo di integrazione può essere ottimizzato per segnale-rumore. Valori tipici per incrementare lunghezza d'onda e tempo di integrazione sono 1 nm / passo e 0,5 sec / step, rispettivamente. Proteine ​​di membrana in genere piega in lipidi di sintesi solo quando la temperatura è al di sopra della temperatura di transizione di fase doppio strato. Pertanto, in questo caso di DMPC, la temperatura del campione è mantenuta costante a 30 ° C. Una cuvetta silice fusa microvolumi con 160 microlitri è utilizzato in questi experiments. 4. Generazione di curve iniziali Unfolding e stima dell'energia libera di Gibbs di proteine ​​di membrana Unfolding <ol><li> Spettri di fluorescenza nella forma di un insieme di dati xy vengono caricati in software come Igor Pro, Matlab, Origin o Excel. </li><li> Segnale dal fondo vescicola urea e lipidico deve essere sottratto con la seguente procedura: Spettro A = spettro di fluorescenza prime di proteine ​​in presenza di vescicole lipidiche e di concentrazione specifici di urea. Spettro B = spettro prime fluorescenza corrispondente campione in bianco che contiene vescicole lipidiche e la concentrazione di urea identica a quella dello spettro A, nessuna proteina nei campioni è vuoto. Spettro corretta = Spectrum A - C * spettro B. C è uno scalare tipicamente pari a 1,0. In alcuni casi, C è inferiore o superiore a 1,0 a causa di problemi di dispersione che causano sovra o sotto-sottrazione vicino alla regione 305-320 nm ~. </li><li> La lunghezza d'onda del massimo di fluorescenza, λ max, è tabulati da spettri corretti per ciascuna concentrazione di urea. Un valore tipico per la piena spiegato proteina di membrana è di 350 nm, mentre quello della proteina ripiegata è ~ 330 nm. Lunghezze d'onda tabulati vengono convertiti in frazione spiegato convertendo la gamma di valori di λ max (~ 330 a ~ 350 nm) per la gamma 0,0-1,0 per correlare il valore λ max a frazione della popolazione spiegato. Per esempio, un valore λ massima di 330 nm corrisponde a 0,0, 350 nm corrisponde a 1,0 e 340 nm corrisponde a 0,5 in termini di frazione spiegato. Questa frazione di proteine ​​è spiegato poi complottato contro la concentrazione di urea. Come detto sopra, la concentrazione di urea deve essere determinato sperimentalmente misurando indice di rifrazione. </li><li> Partiamo dal presupposto che la proteina può esistere in uno dei due stati: ripiegati o aperti. La trama della frazione spiegato, f, in funzione della concentrazione di urea, C, può essere in forma per l'equazione: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Equazione 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 2"> Il coefficiente m corrisponde al tasso di variazione della energia libera rispetto alla concentrazione di denaturante e C m corrisponde alla concentrazione di urea punto medio in cui la popolazione piegata uguale alla popolazione spiegato. Questi valori sono le variabili montaggio ottenuto da minimi quadrati da un software di analisi dati. R (0.001987 kcal / mol • K) è la legge costante dei gas, e T è la temperatura (303 K). </li><li> I coefficienti ottenuti dal fit sono utilizzati per determinare l'energia libera di Gibbs (kcal / mol) di dispiegarsi in assenza di urea: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Equazione 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 3"> . </li></ol> 5. Ottimizzato Unfolding Curva Per una misurazione più precisa della energia libera di Gibbs di Unfolding. <ol><li> La curva di svolgimento sopra descritta rivela l'intervallo di concentrazioni di urea che provoca il più grande cambiamento nella massima λ. Questa gamma è in genere piccolo, e la maggior parte di svolgimento avviene all'interno di questa gamma di piccole dimensioni. Al fine di determinare con precisione l'energia libera di dispiegarsi, campioni supplementari vengono analizzati in questa regione per ottenere una trama che contiene molti punti dati necessari per ottimizzare minimi quadrati. Per esempio, se la proteina si svolge tra 2 e 4 M urea, i campioni possono essere fatte che contengono 2-4 M urea in incrementi di 0,2 M per rivelare più precisamente la forma di questa importante regione della curva di svolgimento. Non è necessario misurare spettri vuoto ad ogni concentrazione di urea, ma è sufficiente per misurare uno spettro vuoto ogni passo ~ 0,5 M. </li><li> L'energia libera di dispiegarsi ottenuti da questo complotto possono differire leggermente da quello ottenuto nella curva originale svolgimento, ma riflette un valore più preciso. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> finale [Urea], M </td><td> magazzino proteine ​​(mL) </td><td> magazzino dei lipidi (mL) </td><td> stock 10 M urea (mL) </td><td> magazzino tampone (mL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0,16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Volume delle soluzioni madre tenuto a fluorescenza di campioni <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Triptofano spettri di fluorescenza di ~ 5 proteina di membrana rappresentante mM che contiene un singolo residuo triptofano. (A) spettri Raw fluorescenza di proteine ​​(spettro da 4,2 A), (B) spettri Raw fluorescenza bianca (spettro di B da 4,2), (C) rettificato spettro da 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Corretto triptofano spettri di fluorescenza di proteine ​​di membrana dalla Figura 1 per le concentrazioni di urea numerosi. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Unfolding curva ottenuta dai dati in figura 2, con forma di equazione in 4.4. L'energia libera di Gibbs è calcolato in base al paragrafo 4.5.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
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<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;attuale protocollo descrive la generazione di curve di svolgimento associata alla membrana proteine ​​e peptidi che contengono residui di triptofano. Qui, si presume che la fluorescenza triptofano riflette se la proteina viene piegato e inserito in vescicole lipidiche sintetico, o si è svolto in soluzione. Ipotesi aggiuntive, come due Stati piegatura e dipendenza lineare di energia libera con concentrazione denaturante, sono contenute nella relazione corrente;. Modifica di tali presupposti risultato in diverse equ...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dibasico di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobasico di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

termodinamica di folding delle proteine ​​di membrana misurato in spettroscopia di fluorescenza

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Ripiegamento delle proteine ​​della membrana è un tema emergente di significati fondamentali e relativi alla salute. L&#39;abbondanza di proteine ​​di membrana delle cellule in base alla necessità per lo studio completo della piegatura di questa famiglia ubiquitaria di proteine. Inoltre, i progressi nella capacità di caratterizzare malattie associate con le proteine ​​mal ripiegate hanno motivato notevoli sforzi teorici e sperimentali nel campo del ripiegamento delle proteine. Rapidi progressi in questo importante settore è purtroppo ostacolata dalle sfide inerenti associate proteine ​​di membrana e la complessità del meccanismo di ripiegamento. Qui, delineare una procedura sperimentale per la misura di proprietà termodinamiche di energia libera di Gibbs di dispiegarsi in assenza di denaturante, Δ G ° H 2 O, per una proteina di membrana integrale rappresentante da E. coli. Questo protocollo si concentra sull&#39;applicazione della spettroscopia di fluorescenza per determinare l&#39;equilibrio le popolazioni degli stati piegato e spiegato in funzione della concentrazione di denaturante. Considerazioni sperimentali per la preparazione di vescicole lipidiche sintetici, nonché alle fasi principali della procedura di analisi dei dati sono evidenziati. Questa tecnica è versatile e può essere perseguito con diversi tipi di denaturante, tra cui la temperatura e pH, così come in vari ambienti ripiegamento dei lipidi e delle micelle. Il protocollo attuale è quella che può essere generalizzato a qualsiasi membrana o proteina solubile che soddisfa l&#39;insieme dei criteri discussi di seguito.

Questo articolo dettagli video la procedura sperimentale per ottenere l&#39;energia libera di Gibbs di ripiegamento delle proteine ​​della membrana da triptofano fluorescenza.

Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

Il ripiegamento delle proteine di membrana è un tema emergente, con una rilevanza sia fondamentale che legata alla salute. L'abbondanza di proteine di membrana nelle cellule...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la termodinamica associata al ripiegamento delle proteine di membrana. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando vescicole LAR di piccole dimensioni per fornire un ambiente di ripiegamento per la proteina di membrana. Una volta costruite, le vescicole vengono utilizzate per preparare campioni contenenti la proteina e concentrazioni sistematicamente variate di urea.Successivamente, viene misurato lo spettro fluorescente del triptofano di ciascun campione al fine di raccogliere i dati necessari per generare una curva di svolgimento della proteina di membrana; i risultati ottenuti mostrano come sia possibile ricavare l'energia libera di Gibbs dello svolgimento della proteina di membrana a partire da curve di svolgimento generate dagli spettri fluorescenti del triptofano. Ciao, mi chiamo Judy Kim. Sono professoressa associata presso l'Università della California di San Diego.Il metodo che state per osservare rivela un'importante proprietà delle proteine di membrana. In particolare, vi mostreremo come misurare la stabilità di una proteina ripiegata e inserita in un doppio strato lipidico. Mi chiamo Diana Ottinger, e sono una studentessa laureata presso il Dipartimento di Chimica dell'uc, San Diego.Oggi dimostreremo questo metodo su una proteina di membrana rappresentativa. Tuttavia, questa tecnica è generale e può essere applicata ad altri sistemi biologici, come peptidi associati alla membrana e proteine solubili. Cominciamo dunque.Prima di iniziare questo protocollo, acquistare una soluzione di uno dei due oli DME, SN glicerolo, tre fosfocolina o DMPC, lipide in cloroformio ed Eloqua in provette di vetro pulite. In quantità di 20 milligrammi per provetta, aggiungere uno strato di gas azoto in ciascuna provetta per prevenire l'ossidazione del lipide e sigillare le provette. Una singola provetta contenente 20 milligrammi di lipide in cloroformio viene utilizzata per ogni esperimento.Per preparare la soluzione madre di vescicole, iniziare asciugando il contenuto della provetta sotto un flusso di gas azoto per un'ora, utilizzando un settimo in teflon e aghi, fino a quando non rimane alcun solvente. Aggiungere un millilitro di tampone fosfato di potassio 20 millimolare, pH 7,3, ai lipidi essiccati e risospendere per circa 30 secondi in un bagno a ultrasuoni. Trasferire la sospensione torbida risultante in un tubo di plastica da 15 millilitri con fondo conico mediante pipetta. Aggiungere un ulteriore millilitro di tampone fosfato nel vial di vetro vuoto che conteneva inizialmente il lipide e ripetere la sonificazione. Aggiungere la sospensione ottenuta allo stesso tubo da 15 millilitri. Ripetere questo processo un totale di quattro volte per ottenere un volume finale di quattro millilitri e una concentrazione del lipide di cinque milligrammi per millilitro.Posizionare la sospensione di vescicole lipidiche in un bagno d'acqua calda e sottoporla a sonificazione utilizzando una microsonda ultrasonica per un'ora con un ciclo di lavoro del 50%. Il bagno d'acqua evita che la soluzione lipidica diventi troppo calda e mantiene la temperatura della soluzione acquosa lipidica al di sopra della transizione di fase a doppio strato.Filtrare la soluzione SONICATA attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron per rimuovere i detriti provenienti dalla punta dell'ator e lasciare equilibrare la soluzione filtrata durante la notte a 37 gradi Celsius. Per preparare il campione per lo svolgimento iniziale della fluorescenza, preparare una soluzione madre di 10 moli di urea in tampone fosfato 20 millimolare e una soluzione madre di tampone fosfato 20 millimolare. Secondo il protocollo scritto, la concentrazione di urea deve essere determinata sperimentalmente misurando l'indice di rifrazione con un rifrattometro e confrontandolo con valori noti.Successivamente, preparare una soluzione madre di proteina denaturata a una concentrazione di circa 200 micromolare di proteina in otto molarità di urea, 20 millimolare di tampone fosfato. In questo video, la proteina di membrana OPA A viene utilizzata per dimostrare il protocollo; campioni per studi fluorescenti vengono preparati combinando opportuni volumi di soluzione madre di proteina, soluzione madre di lipidi, soluzione madre di urea 10 molarità e tampone fosfato madre per ottenere campioni contenenti circa quattro micromolare di proteina, un milligrammo per millilitro di lipidi e da zero a otto molarità di urea con incrementi di un molare, per un volume totale di 200 microlitri. I campioni bianco vengono preparati nello stesso modo.Tuttavia, quattro microlitri di soluzione di urea otto molare vengono sostituiti alla proteina. Questi bianchi vengono preparati al fine di sottrarre i segnali di scattering e di fondo che compaiono negli spettri di fluorescenza della proteina. Incubare i campioni proteici nei bianchi a 37 gradi Celsius per almeno due ore prima della misurazione degli spettri di fluorescenza.Per garantire un ripiegamento completo, accendere il fluorimetro un'ora prima delle misurazioni. Le proteine di membrana in genere si ripiegano nei lipidi sintetici solo quando la temperatura è superiore alla temperatura di transizione della fase bilayer. Pertanto, nel caso del DMPC, la temperatura del portacampioni nel fluorimetro viene impostata a 30 gradi Celsius.Impostare l'esperimento di fluorescenza su un fluorimetro a stato stazionario e misurare la fluorescenza del triptofano di ogni campione a vuoto. La lunghezza d'onda di eccitazione deve essere impostata a 290 nanometri per evitare l'eccitazione dei residui di tirosina e l'emissione deve essere raccolta tra 305 e 500 nanometri. Utilizzare un filtro passa-banda di ingresso e di uscita di tre nanometri.L'incremento di lunghezza d'onda e il tempo di integrazione possono essere ottimizzati per ottenere un rapporto segnale-rumore ideale. I valori tipici per l'incremento di lunghezza d'onda e il tempo di integrazione sono rispettivamente di un nanometro per passo e 0,5 secondi per passo. Pipettare 200 microlitri del campione in una cuvetta in fused silica a basso volume con capacità di 160 microlitri e posizionare la qve nel portacuvette della macchina.Infine, è possibile iniziare le misurazioni di fluorescenza caricando un foglio dati XY degli spettri di fluorescenza in un software come Igor Pro, MATLAB Origin o Excel. Per questa dimostrazione, Igor Pro verrà utilizzato per rimuovere il fondo proveniente dall'urea e dalle vescicole lipidiche, moltiplicare lo spettro di fluorescenza del campione bianco per il fattore di scala S e sottrarlo dallo spettro di fluorescenza grezzo della soluzione proteina-lipidi. Alla corrispondente concentrazione di urea, tabulare la lunghezza d'onda di massima fluorescenza o lambda max ottenuta dallo spettro corretto.Per ogni concentrazione di urea. Un valore tipico per una proteina di membrana completamente svolta è 350 nanometri, mentre quello di una proteina ripiegata è approssimativamente 330 nanometri. Tradurre le lunghezze d'onda tabulate nella frazione di molecole svolte convertendo l'intervallo dei valori di lambda max in un intervallo compreso tra zero e uno, correlando il valore di lambda max alla frazione della popolazione svolta.Quindi tracciare la frazione di proteina svolta in funzione della concentrazione di urea. Il grafico della frazione svolta F in funzione della concentrazione di urea C può essere interpolato con un'equazione che assume che la proteina possa esistere in uno stato ripiegato o svolto. Il coefficiente M corrisponde alla variazione dell'energia libera rispetto al denaturante e alla concentrazione, e CM corrisponde alla concentrazione di urea al punto medio in cui la popolazione ripiegata è uguale alla popolazione svolta.R è la costante della legge dei gas e T è la temperatura in Kelvin. La procedura di fitting fornisce i valori per i coefficienti m e cm.Questi coefficienti vengono moltiplicati per determinare il delta G, l'energia libera di Gibbs di svolgimento in assenza di urea. La curva di svolgimento descritta rivela l'intervallo di concentrazioni di urea che provoca la maggiore variazione della lambda max. Questo intervallo è tipicamente ridotto e la maggior parte dello svolgimento avviene all'interno di questo piccolo intervallo, al fine di determinare con precisione l'energia libera di svolgimento.Dovrebbero essere analizzati ulteriori campioni in questa regione per ottenere un grafico contenente il numero elevato di punti dati necessari per un'ottimizzazione del fit ai minimi quadrati. Ad esempio, se la proteina si denatura tra due e quattro moli di urea, possono essere preparati campioni tra queste concentrazioni di urea con incrementi di 0,2 moli per rivelare con maggiore precisione l'andamento di questa regione importante nella curva di denaturazione. Un bianco dovrebbe essere incluso almeno ogni 0,5 moli e ogni 0,2 moli per ottenere i migliori risultati.L'energia libera di svolgimento ottenuta da questo grafico può differire leggermente da quella ottenuta dalla curva di svolgimento originale, ma riflette un valore più preciso mostrato. Di seguito sono riportati gli spettri di fluorescenza del triptofano di una proteina di membrana rappresentativa om a che contiene un singolo residuo di triptofano. Lo spettro di fluorescenza grezzo del bianco viene sottratto dagli spettri di fluorescenza grezzi della proteina come descritto nel protocollo, ottenendo lo spettro corretto.Gli spettri fluorescenti corretti del triptofano della proteina di membrana per numerose concentrazioni di urea sono mostrati qui secondo i metodi descritti. In questa dimostrazione, è stata generata una curva di svolgimento assumendo che la proteina sia o ripiegata o svolta e che non esista uno stato stabile. Il parametro M riflette la quantità di polipeptide esposta al solvente durante lo svolgimento, mentre CM è un valore importante che descrive il denaturante e la concentrazione necessaria per ottenere una popolazione equilibrata di forme ripiegate e svolte.Valori elevati di CM e M indicano una proteina stabile. L'energia libera di Gibbs di svolgimento è stata calcolata essere pari a 6,2 chilocalorie per mole per OPA a seguendo questa procedura. Altri metodi di svolgimento, come il calore, il pH e altri agenti chimici denaturanti, possono essere utilizzati per ottenere informazioni analoghe sulla termodinamica del ripiegamento proteico.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la stabilità di una proteina in base alle diverse proprietà di fluorescenza degli stati ripiegato e disripiegato. In alternativa, potresti anche generare una curva di disripiegamento utilizzando altri metodi come la dicromia circolare, la luminescenza debole, purché il metodo fornisca informazioni sulla conformazione della proteina, indipendentemente dallo strumento analitico scelto. Il metodo delle curve di disripiegamento è versatile e può essere applicato a un'ampia gamma di proteine di membrana e proteine solubili.

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Questo video dimostra la tecnica della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza (FFS) per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine. Le proteine marcate in fluorescenza in un campione vengono dimerizzate utilizzando un agente quando si studia l'oligomerizzazione proteica mediante FFS. Utilizzando un microscopio confocale, mentre le proteine si muovono dentro e fuori dal piccolo volume di osservazione, viene eseguita l'analisi delle fluttuazioni della luminosità delle molecole...

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine

I passaggi chiave della funzione delle proteine, in particolare i cambiamenti conformazionali della spina dorsale e le reazioni di trasferimento protonico, spesso avvengono su una scala temporale da microsecondi a millisecondi. Questi processi dinamici possono essere studiati mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a scansione a gradini risolta nel tempo, in particolare per le proteine la cui funzione è attivata dalla luce.

Proton Transfer e conformazione proteica Dynamics in proteine ​​fotosensibili da Time-risolto Step-scan trasformata di Fourier Infrared Spectroscopy

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

La distribuzione spaziale e la dinamica temporale delle proteine e dei lipidi della membrana plasmatica è un argomento caldo in biologia. Qui questo problema è affrontato da un'analisi di fluttuazione dell'immagine spazio-temporale che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche di tracciamento di singole particelle, ma utilizza piccole etichette molecolari e configurazioni di microscopia standard.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine a singola molecola risolto nel tempo è un utile sensore di prossimità spettroscopico a fluorescenza sensibile ai cambiamenti strutturali locali nelle proteine. Qui mostriamo che può essere usato per scoprire conformazioni locali stabili in α-sinucleina, che è altrimenti nota come globulare non strutturata e instabile quando misurata usando il righello FRET a lungo raggio.

Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

Il presente protocollo descrive una procedura per eseguire la cromatografia fluorescente ad esclusione dimensionale (FSEC) su proteine di membrana per valutarne la qualità per l'analisi funzionale e strutturale a valle. Vengono presentati i risultati rappresentativi FSEC raccolti per diversi recettori accoppiati a proteine G (GPCR) in condizioni solubilizzate con detergente e senza detergenti.

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

Qui, presentiamo il protocollo per studiare la flessibilità locale e la dinamica delle biomolecole utilizzando l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo a livello di singola molecola in modalità microscopia confocale.

Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

Impara a misurare l'energia libera di Gibbs del folding delle proteine di membrana mediante spettroscopia di fluorescenza del triptofano. Questo metodo utilizza vescicole LAR per studiare la termodinamica e la stabilità proteica.

Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

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