Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la termodinamica associata al ripiegamento delle proteine di membrana. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando vescicole LAR di piccole dimensioni per fornire un ambiente di ripiegamento per la proteina di membrana. Una volta costruite, le vescicole vengono utilizzate per preparare campioni contenenti la proteina e concentrazioni sistematicamente variate di urea.

Successivamente, viene misurato lo spettro fluorescente del triptofano di ciascun campione al fine di raccogliere i dati necessari per generare una curva di svolgimento della proteina di membrana; i risultati ottenuti mostrano come sia possibile ricavare l'energia libera di Gibbs dello svolgimento della proteina di membrana a partire da curve di svolgimento generate dagli spettri fluorescenti del triptofano. Ciao, mi chiamo Judy Kim. Sono professoressa associata presso l'Università della California di San Diego.

Il metodo che state per osservare rivela un'importante proprietà delle proteine di membrana. In particolare, vi mostreremo come misurare la stabilità di una proteina ripiegata e inserita in un doppio strato lipidico. Mi chiamo Diana Ottinger, e sono una studentessa laureata presso il Dipartimento di Chimica dell'uc, San Diego.

Oggi dimostreremo questo metodo su una proteina di membrana rappresentativa. Tuttavia, questa tecnica è generale e può essere applicata ad altri sistemi biologici, come peptidi associati alla membrana e proteine solubili. Cominciamo dunque.

Prima di iniziare questo protocollo, acquistare una soluzione di uno dei due oli DME, SN glicerolo, tre fosfocolina o DMPC, lipide in cloroformio ed Eloqua in provette di vetro pulite. In quantità di 20 milligrammi per provetta, aggiungere uno strato di gas azoto in ciascuna provetta per prevenire l'ossidazione del lipide e sigillare le provette. Una singola provetta contenente 20 milligrammi di lipide in cloroformio viene utilizzata per ogni esperimento.

Per preparare la soluzione madre di vescicole, iniziare asciugando il contenuto della provetta sotto un flusso di gas azoto per un'ora, utilizzando un settimo in teflon e aghi, fino a quando non rimane alcun solvente. Aggiungere un millilitro di tampone fosfato di potassio 20 millimolare, pH 7,3, ai lipidi essiccati e risospendere per circa 30 secondi in un bagno a ultrasuoni. Trasferire la sospensione torbida risultante in un tubo di plastica da 15 millilitri con fondo conico mediante pipetta.

Aggiungere un ulteriore millilitro di tampone fosfato nel vial di vetro vuoto che conteneva inizialmente il lipide e ripetere la sonificazione. Aggiungere la sospensione ottenuta allo stesso tubo da 15 millilitri. Ripetere questo processo un totale di quattro volte per ottenere un volume finale di quattro millilitri e una concentrazione del lipide di cinque milligrammi per millilitro.

Posizionare la sospensione di vescicole lipidiche in un bagno d'acqua calda e sottoporla a sonificazione utilizzando una microsonda ultrasonica per un'ora con un ciclo di lavoro del 50%. Il bagno d'acqua evita che la soluzione lipidica diventi troppo calda e mantiene la temperatura della soluzione acquosa lipidica al di sopra della transizione di fase a doppio strato.

Filtrare la soluzione SONICATA attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron per rimuovere i detriti provenienti dalla punta dell'ator e lasciare equilibrare la soluzione filtrata durante la notte a 37 gradi Celsius. Per preparare il campione per lo svolgimento iniziale della fluorescenza, preparare una soluzione madre di 10 moli di urea in tampone fosfato 20 millimolare e una soluzione madre di tampone fosfato 20 millimolare. Secondo il protocollo scritto, la concentrazione di urea deve essere determinata sperimentalmente misurando l'indice di rifrazione con un rifrattometro e confrontandolo con valori noti.

Successivamente, preparare una soluzione madre di proteina denaturata a una concentrazione di circa 200 micromolare di proteina in otto molarità di urea, 20 millimolare di tampone fosfato. In questo video, la proteina di membrana OPA A viene utilizzata per dimostrare il protocollo; campioni per studi fluorescenti vengono preparati combinando opportuni volumi di soluzione madre di proteina, soluzione madre di lipidi, soluzione madre di urea 10 molarità e tampone fosfato madre per ottenere campioni contenenti circa quattro micromolare di proteina, un milligrammo per millilitro di lipidi e da zero a otto molarità di urea con incrementi di un molare, per un volume totale di 200 microlitri. I campioni bianco vengono preparati nello stesso modo.

Tuttavia, quattro microlitri di soluzione di urea otto molare vengono sostituiti alla proteina. Questi bianchi vengono preparati al fine di sottrarre i segnali di scattering e di fondo che compaiono negli spettri di fluorescenza della proteina. Incubare i campioni proteici nei bianchi a 37 gradi Celsius per almeno due ore prima della misurazione degli spettri di fluorescenza.

Per garantire un ripiegamento completo, accendere il fluorimetro un'ora prima delle misurazioni. Le proteine di membrana in genere si ripiegano nei lipidi sintetici solo quando la temperatura è superiore alla temperatura di transizione della fase bilayer. Pertanto, nel caso del DMPC, la temperatura del portacampioni nel fluorimetro viene impostata a 30 gradi Celsius.

Impostare l'esperimento di fluorescenza su un fluorimetro a stato stazionario e misurare la fluorescenza del triptofano di ogni campione a vuoto. La lunghezza d'onda di eccitazione deve essere impostata a 290 nanometri per evitare l'eccitazione dei residui di tirosina e l'emissione deve essere raccolta tra 305 e 500 nanometri. Utilizzare un filtro passa-banda di ingresso e di uscita di tre nanometri.

L'incremento di lunghezza d'onda e il tempo di integrazione possono essere ottimizzati per ottenere un rapporto segnale-rumore ideale. I valori tipici per l'incremento di lunghezza d'onda e il tempo di integrazione sono rispettivamente di un nanometro per passo e 0,5 secondi per passo. Pipettare 200 microlitri del campione in una cuvetta in fused silica a basso volume con capacità di 160 microlitri e posizionare la qve nel portacuvette della macchina.

Infine, è possibile iniziare le misurazioni di fluorescenza caricando un foglio dati XY degli spettri di fluorescenza in un software come Igor Pro, MATLAB Origin o Excel. Per questa dimostrazione, Igor Pro verrà utilizzato per rimuovere il fondo proveniente dall'urea e dalle vescicole lipidiche, moltiplicare lo spettro di fluorescenza del campione bianco per il fattore di scala S e sottrarlo dallo spettro di fluorescenza grezzo della soluzione proteina-lipidi. Alla corrispondente concentrazione di urea, tabulare la lunghezza d'onda di massima fluorescenza o lambda max ottenuta dallo spettro corretto.

Per ogni concentrazione di urea. Un valore tipico per una proteina di membrana completamente svolta è 350 nanometri, mentre quello di una proteina ripiegata è approssimativamente 330 nanometri. Tradurre le lunghezze d'onda tabulate nella frazione di molecole svolte convertendo l'intervallo dei valori di lambda max in un intervallo compreso tra zero e uno, correlando il valore di lambda max alla frazione della popolazione svolta.

Quindi tracciare la frazione di proteina svolta in funzione della concentrazione di urea. Il grafico della frazione svolta F in funzione della concentrazione di urea C può essere interpolato con un'equazione che assume che la proteina possa esistere in uno stato ripiegato o svolto. Il coefficiente M corrisponde alla variazione dell'energia libera rispetto al denaturante e alla concentrazione, e CM corrisponde alla concentrazione di urea al punto medio in cui la popolazione ripiegata è uguale alla popolazione svolta.

R è la costante della legge dei gas e T è la temperatura in Kelvin. La procedura di fitting fornisce i valori per i coefficienti m e cm.

Questi coefficienti vengono moltiplicati per determinare il delta G, l'energia libera di Gibbs di svolgimento in assenza di urea. La curva di svolgimento descritta rivela l'intervallo di concentrazioni di urea che provoca la maggiore variazione della lambda max. Questo intervallo è tipicamente ridotto e la maggior parte dello svolgimento avviene all'interno di questo piccolo intervallo, al fine di determinare con precisione l'energia libera di svolgimento.

Dovrebbero essere analizzati ulteriori campioni in questa regione per ottenere un grafico contenente il numero elevato di punti dati necessari per un'ottimizzazione del fit ai minimi quadrati. Ad esempio, se la proteina si denatura tra due e quattro moli di urea, possono essere preparati campioni tra queste concentrazioni di urea con incrementi di 0,2 moli per rivelare con maggiore precisione l'andamento di questa regione importante nella curva di denaturazione. Un bianco dovrebbe essere incluso almeno ogni 0,5 moli e ogni 0,2 moli per ottenere i migliori risultati.

L'energia libera di svolgimento ottenuta da questo grafico può differire leggermente da quella ottenuta dalla curva di svolgimento originale, ma riflette un valore più preciso mostrato. Di seguito sono riportati gli spettri di fluorescenza del triptofano di una proteina di membrana rappresentativa om a che contiene un singolo residuo di triptofano. Lo spettro di fluorescenza grezzo del bianco viene sottratto dagli spettri di fluorescenza grezzi della proteina come descritto nel protocollo, ottenendo lo spettro corretto.

Gli spettri fluorescenti corretti del triptofano della proteina di membrana per numerose concentrazioni di urea sono mostrati qui secondo i metodi descritti. In questa dimostrazione, è stata generata una curva di svolgimento assumendo che la proteina sia o ripiegata o svolta e che non esista uno stato stabile. Il parametro M riflette la quantità di polipeptide esposta al solvente durante lo svolgimento, mentre CM è un valore importante che descrive il denaturante e la concentrazione necessaria per ottenere una popolazione equilibrata di forme ripiegate e svolte.

Valori elevati di CM e M indicano una proteina stabile. L'energia libera di Gibbs di svolgimento è stata calcolata essere pari a 6,2 chilocalorie per mole per OPA a seguendo questa procedura. Altri metodi di svolgimento, come il calore, il pH e altri agenti chimici denaturanti, possono essere utilizzati per ottenere informazioni analoghe sulla termodinamica del ripiegamento proteico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la stabilità di una proteina in base alle diverse proprietà di fluorescenza degli stati ripiegato e disripiegato. In alternativa, potresti anche generare una curva di disripiegamento utilizzando altri metodi come la dicromia circolare, la luminescenza debole, purché il metodo fornisca informazioni sulla conformazione della proteina, indipendentemente dallo strumento analitico scelto. Il metodo delle curve di disripiegamento è versatile e può essere applicato a un'ampia gamma di proteine di membrana e proteine solubili.