Immunocitochimica: cellule staminali neuronali

Ciao, sono Steve. Lavoro nel laboratorio del Dr. Flanagan nel Dipartimento di Patologia dell'UC, Irvine. E oggi vi mostrerò come fare l'immunochimica delle cellule precursori neurali umane.

Questo protocollo include l'inserimento di cellule su vetrini coprioggetti rivestiti e il blocco e l'incubazione delle cellule nell'anticorpo primario durante la notte, quindi l'esecuzione di diversi was e l'inserimento di anticorpi secondari e a temperatura ambiente. E infine, il montaggio dei vetrini coprioggetto sui voli dei microscopi. Iniziamo.

Quindi, per prima cosa, metterò tre vetrini di vetro tedeschi sterili di 12 millimetri di diametro in una piastra a 24 pozzetti per rivestirli con laminato. Quindi ora ho i miei vetrini di copertura nella piastra, e per prima cosa aggiungerò una soluzione di polilisina PDL, e incuberò i sottomarini di copertura in PDL per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi ora, alla fine dei cinque minuti, rimuoverò il PDL e metterò la laminina, e incuberò i vetrini di copertura nel laminato per almeno quattro ore o meglio durante la notte.

Quindi ho incubato la piastra per una notte in laminato, e ora ho intenzione di risciacquare i vetrini coprioggetto con PBS e piastre di cellule precursori neurali umane che ho già contato. Quindi ho appena rimosso le soluzioni laminate e ora ho intenzione di tenere a freno i vetrini coprioggetto con PBS. Quindi ora rimuoverò PBS e metterò la soluzione multimediale.

E infine, sono pronto a vedere le cellule. Quindi vedrò le celle a centomila celle per millimetro, il che significa che per una piastra da 24 pozzetti aggiungerò 50.000 celle per pozzetto, perché ogni pozzetto contiene mezzo millilitro. Quindi inclinerò la piastra da un lato all'altro per assicurarmi che le celle si distribuiscano uniformemente sulla superficie del vetrino coprioggetti.

E ora li metterò nell'incubatrice per almeno 24 ore per farli sistemare e diffondersi per l'immunochimica. Quindi le cellule sono cresciute per 24 ore e le ho guardate e sono attaccate e ben distribuite. Quindi ora li sistemerò con il 4% per altezza per cinque minuti.

Ma prima rimuoverò il terreno e non voglio lasciare che le celle si secchino. Quindi rimuoverò il supporto e aggiungerò il fissativo allo stesso tempo. Quindi si chiama tecnica a due mani.

Quindi ora incuberò le cellule in fissativo per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi sono passati cinque minuti. Ho intenzione di rimuovere il PFA e metterlo nel contenitore dei rifiuti PFA e aggiungere PBS nello stesso momento in cui rimuovo il PFA in modo che le cellule non si secchino.

Quindi userò una di queste pipette di aspirazione in plastica per sollevare il PFA e imposterò il timer per cinque minuti. Quindi, mentre le mie cellule sono in lavaggio PBS, preparerò una soluzione di visualizzazione della perme utilizzando Triton X 100. È un detergente non ionico ed è molto, molto viscoso.

Quindi è importante attendere che tutta la soluzione entri e entri nella pipetta. Quindi preparerò una soluzione allo 0,3% in PBS, aggiungerò 10 mil di PBS. E a questi 10 mil di PBS, aggiungerò 30 microlitri di tri next 100.

Quindi aggiungerò 30 microlitri di tri prossimi 100-10 mil di PBS. Quindi aggiungerò circa 10 secondi per far entrare tutta la soluzione nella punta. Quindi io, ho qui la mia soluzione per l'utilizzo del perme.

Lo metto sul rotatore per 10 minuti, e poi lo faccio vorticare per assicurarmi che il tritton viscoso si sciolga completamente. Quindi ora sono pronto per eseguire la fase di visualizzazione del perme. E quindi lo farò, per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi sono passati cinque minuti. Ora farò tre lavaggi PBS di cinque minuti per assicurarmi di lavare via tutto il tritone. Quindi, ancora una volta, imposterò l'orologio a cinque minuti.

Quindi io, ho appena finito tutte le mie fasi di lavaggio, quindi sono pronto per fare la fase di blocco. Quindi, per la fase di blocco, ho preparato una soluzione BSA al 5% in PBS. E proprio come con tutti i lavaggi, rimuoverò il PBS e aggiungerò la soluzione bloccante allo stesso tempo.

E la fase di blocco durerà un'ora a temperatura ambiente. Quindi, mentre le mie cellule sono in blocco, preparerò la piastra per l'incubazione degli anticorpi primari. Quindi inizierò con questa lastra di vetro, e taglierò un pezzo di pellicola para che ha più o meno queste dimensioni.

E quello che farò è avvolgerlo e ho bisogno di un po' di nastro adesivo, quindi avrò bisogno di quattro pezzi di nastro adesivo. Quindi li preparerò tutti. Quindi prenderò questo pezzo di pellicola para e lo raddrizzerò in modo che la superficie sia bella e liscia.

E poi prenderò ogni estremità e la legherò con del nastro adesivo al retro della lastra di vetro. Quindi ora tirerò l'altra estremità per assicurarmi che le superfici siano dritte, e legherò l'altra estremità sul retro. Quindi ora ho bisogno di un altro pezzo di pellicola di coppia della stessa dimensione del primo.

E fondamentalmente farò la stessa cosa. Così ho attaccato un secondo pezzo di pellicola para sopra il primo, proprio come il primo, tranne per il fatto che ho lasciato un'estremità del secondo pezzo di perfil allentata perché sto per posizionare la soluzione anticorpale e poi l'alimentazione scivola sul primo pezzo. E poi ci metterò sopra il secondo pezzo che fa un panino.

Ma in questo momento, sto per etichettare il luogo in cui metterò la soluzione anticorpale e la copertura. Quindi, le cellule sono rimaste nella soluzione bloccante per un'ora, e ora metterò i vetrini coprioggetti sulle goccioline di anticorpi primari per l'incubazione notturna. Quindi metterò una goccia di 35 microlitri di anticorpo primario, e starò molto attento a non espellere tutto il liquido perché ciò potrebbe creare bolle e le bolle potrebbero interferire con il legame dell'anticorpo all'antigene.

Quindi voglio cercare di evitare di avere bolle nella goccia, tutte e tre le gocce di anticorpi primari, e sono pronto a mettere una copertura, dei vetrini coprioggetti con cellule su queste gocce. Quindi quello che farò ora è prendere un foglietto di copertura. Quindi, per prima cosa, sposterò il vetrino coprioggetto di lato e cercherò di sollevarlo delicatamente con le pinzette aperte.

Non appena mi sento come se avessi preso la presa del vetrino coprioggetti, mi avvicino per chiudere lentamente le pinzette e sollevo delicatamente il vetrino coprioggetto dal pozzetto. Quindi le celle in questo momento sono sopra il vetrino coprioggetto. Quindi quello che farò è invertire e toccare delicatamente la goccia e appoggiarla lentamente sopra la goccia senza creare bolle.

E quindi ripeterò la stessa procedura con il secondo e il terzo vetrino. E il passaggio finale consiste nel posizionare il secondo pezzo di pellicola para sopra. E il modo in cui lo farò è metterlo giù in un movimento come quello.

Voglio cercare di evitare di muovermi, spostandolo da una parte all'altra. E infine lo fisserò sul fondo della piastra con un altro pezzo di nastro adesivo. E ora, finalmente, le cellule sono pronte per essere incubate a quattro gradi durante la notte, e questa è la fine del primo giorno di immunochimica.

Questo è il secondo giorno di immunochimica e laverò i vetrini in PB S3 volte per cinque minuti. E poi incuberò in un anticorpo secondario per due ore a temperatura ambiente. Per prima cosa, taglierò la pellicola para in questo modo in modo da poter rimuovere i vetrini di copertina.

E solleverò lentamente il pezzo superiore della pellicola para in modo che i vetrini coprioggetto rimangano sul pezzo inferiore della pellicola para di cura. Quindi ho tolto il primo pezzo e ho pronto il piatto con la soluzione di lavaggio PBS. Quindi solleverò ogni zuppa di copertura e la metterò nel pozzetto per lavare via qualsiasi anticorpo primario rimanente che non si è attaccato all'epitopo.

Quindi, per sollevare il vetrino coprioggetto, lo terrò prima in quel modo con una lama di rasoio e cercherò di raccoglierlo delicatamente. E dato che le cellule sono di fronte alla soluzione anticorpale, le capovolgo in modo che siano in cima e le faccio scivolare nel pozzetto in modo che rimangano ancora in cima. E ripeterò la procedura per gli slittamenti di alimentazione rimanenti.

E quindi verranno lavati per cinque minuti. Quindi sono passati cinque minuti. Ho intenzione di sostituire la soluzione PBS.

Aggiungerò la fustella per ganci. Ora lo incuberò per cinque minuti. Quindi l'incubazione degli ami è terminata, e ora sono pronto per montare i coperchi e guardarli.

Quindi, per prima cosa, alk quad vector shield, che aiuta a mantenere le monetine fluorescenti lontane dallo sbiancamento. Beh, prima etichetterò la diapositiva con il, con i numeri dei vetrini, e poi metterò 10 microlitri di scudo vettoriale. Vector shield è, è un olio ed è molto viscoso, quindi è, è anche importante aspettare un po' fino a quando tutto entra nella punta.

Così ho posizionato lo scudo vettoriale sul vetrino del microscopio, e ora sono pronto per posizionare i vetrini coprioggetti, sul vetrino del microscopio. Quindi quello che farò per prima cosa è prendere un vetrino coprioggetto e sciacquare il retro del vetrino con acqua deionizzata, perché se non lo faccio, quando si asciuga, il sale che era nel PBS si cristallizzerà e interferirà con le proprietà ottiche dei die fluorescenti. Quindi lo farò, ho la mia acqua deionizzata pronta.

E così prenderò il vetrino coprioggetti e sciacquerò il retro con acqua deionizzata. E poi toccherò la salvietta di latta per asciugarla. E poi lo invertirò di nuovo in modo che il lato della cella sia invertito e scenda sul vetrino del microscopio.

E proprio come prima, toccherò la goccia dello scudo vettoriale e la abbasserò lentamente senza intrappolare alcuna bolla. E ripeterò la stessa, la stessa procedura per, per tutti i lanci di carico. E ora diamo un'occhiata.

Questo è un esempio di ciò che potresti ottenere dopo aver fatto immunochimica e aver ottenuto le tue foto e fatto sovrapposizioni e così via. Quindi in questa immagine, questa, questa è un'immagine di cellule staminali neuro ippocampali isolate da dent gys in topi postnatali. Oggi vi ho mostrato come fare immunochimica delle cellule precursori neurali umane.

E se noterai, questa tecnica ti consente di risparmiare l'ampio reagente anticorpale. Abbiamo utilizzato un volume molto piccolo di anticorpi primari e secondari posizionando una piccola goccia su un perfil e invertendo il vetrino coprioggetti con le cellule sopra di esso. Quindi continua, fai chimica per l'immunoterapia e grazie per avermi guardato.