Un β-glucuronidasi (GUS) Sulla base di analisi morte cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un sistema reporter Gus per analizzare le potenziali proprietà di morte di geni specifici. I geni di interesse vengono clonati in una cassetta Gus e cresciuti nei vettori agrobatterici appropriati sotto un promotore 35 s. Questi vettori vengono poi trasformati nel ceppo di Agrobacterium, LBA 44 0 4, e vengono mescolati con una coltura contenente una cassetta di espressione Gus per infiltrarsi nelle foglie di Nick Oceana Hamana.

L'attività di Gus può essere valutata visivamente mediante colorazione istochimica o quantitativamente mediante saggio a tazza con metrica fluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il DNA laddering o il saggio a tunnel è comunemente usato nei sistemi dei mammiferi, ma difficile da riprodurre nelle piante, è che si tratta di un saggio transitorio sensibile e rapido basato sulle piante che sfrutta il semplice fatto che le cellule vive sono necessarie per l'espressione dei gas. A dimostrare la procedura oggi sarà Hua RAOS.

Un ricercatore post-doc associato nel nostro laboratorio Infiltration richiede foglie sane completamente espanse di piante di nicotiana hamana di tre o sei settimane coltivate a 25 gradi Celsius. Pianifica di eseguire questo protocollo nell'arco di otto giorni. Il primo giorno le striature con scorte di glicerolo di agrobacterium tumor fassan contenenti i vettori per il saggio di morte cellulare e il vettore con la cassetta di espressione Gus includono sempre un vettore vuoto come controllo negativo o riempitore quando vengono testate più combinazioni di colture.

Incubare le piastre a 28 gradi Celsius per due giorni. Il terzo giorno, inoculare due millilitri di LB selettivo con una singola colonia da ciascuna piastra. Incubare ogni coltura agitando a 28 gradi Celsius per 24 ore a 200 giri/min fino a raggiungere la massima densità di crescita.

Dopo 24 ore di incubazione, risospendere completamente la coltura pipettandola in caso di aggregazione e aumentare il volume totale per ciascuna coltura a 10 millilitri con LB selettivo fresco per indurre i geni di virulenza dell'agrobatterio. Aggiungere acetone a 25 micromolari e incubare ogni coltura agitando a 28 gradi Celsius per altre 16 ore. Il passo successivo consiste nel centrifugare ogni coltura a 4.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente e Resus, sospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo di infiltrazione.

Non aggiungere acetone, centrifugare nuovamente le colture, ma ora Resus. Sospendere ogni pellet in cinque millilitri di mezzo di infiltrazione contenente 100 micromolari di acetone. Ora misura il diametro esterno a 600 nanometri.

Concentrazioni fino a 0,1 sono accettabili, ma se superiori a 0,9, diluire a 0,9 con infiltrazione, terreno e acetone prima dell'infiltrazione. Incubare nuovamente le colture a 28 gradi Celsius agitando per tre ore dopo l'incubazione. Mescolare le colture sperimentali e le colture di controllo in un rapporto di uno a uno con la coltura contenente la cassetta Gus.

Per ogni coltura, utilizzare una siringa senza ago da un millilitro per infiltrarsi nel sigillo ABA o nella parte inferiore delle foglie appena emergenti. Il volume di infiltrazione non è importante. Quando si forma un'area di ammollo dell'acqua, è stata aggiunta una quantità sufficiente, infiltrare sia il controllo negativo che il gene da analizzare sulle foglie opposte sulla stessa pianta, quindi infiltrare altre due piante allo stesso modo.

Quindi ci sono piante triplicate per ogni cultura. Tre giorni dopo l'infiltrazione, è il momento di raccogliere le foglie e analizzare l'espressione proteica delle raffiche. Iniziare l'analisi istochimica infiltrando sottovuoto l'intera foglia con il substrato xlu fino a quando non è completamente bagnata.

Ora, incuba le foglie al buio a temperatura ambiente durante la notte o fino a quando non appare una colorazione blu distinta quando la colorazione blu è evidente. Sciacquare le foglie in acqua distillata e incubarle in etanolo al 70% per una notte fino a quando la loro clorofilla non viene rimossa. Il giorno successivo, sciacquare le foglie e l'acqua distillata e valutare i livelli di espressione di GUS.

Per quantificare l'espressione di Gus, una tazza di substrato viene convertita in un prodotto fluorescente mu, che può essere misurato iniziando macinando i dischi fogliari infiltrati in una malta utilizzando azoto liquido. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di estrazione GUS mantenendo il campione in ghiaccio. Ora centrifugare la sospensione a 14.000 GS per cinque minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante contenente le proteine solubili totali, che include il Gus.

Misurare la concentrazione totale di proteine solubili utilizzando un NanoDrop e regolare la concentrazione a 100 microgrammi di proteine totali per ciascun campione nel tampone di estrazione Gus. Ora, aggiungere il substrato della tazza nel tampone di estrazione Gus a ciascun campione fino a una concentrazione finale di due tazze millimolari. Un volume totale di 100 microlitri per campione deve essere sufficiente miscelato mediante pipettaggio e incubare la reazione per un'ora a 37 gradi Celsius.

Dopo un'ora, fermare la reazione aggiungendo 800 microlitri di tampone fermaraffiche. Per quantificare il mu 100 microlitri di ciascun campione vengono caricati su una piastra per microtitolazione, che viene analizzata in un lettore di piastre a fluorescenza a 365 nanometri di eccitazione 455 nanometri vengono misurate le lunghezze d'onda di emissione e confrontate con una curva standard, l'attività di Guss può quindi essere riportata come M di mu per microgrammo di proteina solubile totale per reazione al minuto. Vari livelli di raffica vengono rilevati a seconda del costrutto utilizzato quando la cassetta di espressione GUS è co-infiltrata con un regolatore negativo della morte cellulare o un gene anti-morte.

A titolo di confronto si osservano alti livelli di raffiche. I livelli di Gus nel controllo del vettore vuoto sono molto più bassi. Al contrario, quando viene utilizzato un regolatore positivo della morte cellulare o un gene pro-morte, si osserva una riduzione di mercato dell'espressione di Gus rispetto al controllo del vettore vuoto.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa una settimana. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che questa tecnica viene utilizzata come passo iniziale per determinare il potenziale di geni specifici. È necessario fare ulteriore lavoro per confermare questi risultati iniziali e per determinare il tipo di cellula coinvolta.