Name: Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Scopri l'imaging dei glicani negli embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e chimica click bioortogonale. Questo metodo consente la visualizzazione dinamica in vivo dei glicani fucosilati durante lo sviluppo.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health (GM093282 di PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fondi di avvio di Albert Einstein College of Medicine.

1. Uovo Raccolta e Dechorionation <ol><li> Raccogliere e trasferire le uova di pesce zebra piatto 35 millimetri di Petri, rimuovere l'acqua il più possibile e si aggiunge 1 mg / ml E Pronease nel medio embrione E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) per digerire il corion. </li><li> Dopo 3-5 minuti, unire il piatto in un bicchiere pieno di pesci d'acqua (60 mg "Ocean istantanea" per litro distillata H 2 O), e delicatamente trasferire le uova nel becher e lasciare le uova di "caduta" in acqua. </li><li> Lavare le uova con pesci d'acqua tre volte. La maggior parte delle uova saranno liberati dalla loro corion. </li><li> Utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur, trasferire le uova dechorionated di agarosio rivestite piastre di Petri riempite con terreno di embrione E3. </li></ol> 2. Microiniezione con un PIL-FucAl <ol><li> Preparare i piatti dopo l'iniezione del protocollo riportato 7. </li><li> Trasferimento uova dechorionated in piatti pieni di iniezione medio embrione E3. </li><li> Preparare l'ago, e caricare con 2 microlitri soluzione iniettabile. Questa soluzione contiene 20 mM PIL FucAl sintetizzato chemoenzymatically 8 e sia Alexa Fluor 594-destrano (5% w / v) come tracciante o rosso fenolo carico colorante (0,1% w / v) in 0,2 M KCl. Come controllo negativo, sostituire il PIL con un PIL-FucAl-fucosio in soluzione iniettabile. </li><li> Rompere l'ago e regolare la pressione di iniezione e la durata per produrre un 1 goccia nL 9. </li><li> Iniettare le uova con 1 nL di entrambe le soluzioni. </li><li> Trasferire le uova in agarosio rivestite piastre di Petri riempite con terreno di embrione E3. </li><li> Incubare le uova a 28 ° C ed eliminare le uova non fecondate entro tre o quattro ore dopo la fecondazione. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I)-catalizzata reazione chimica Clicca <ol><li> Quando gli embrioni raggiungono desiderato stadi di sviluppo (ad esempio gastrula tardiva, la segmentazione dei tessuti e larve presto), cappotto alla base di una piastra da 96 pozzetti con agarosio. </li><li> Aggiungere 92 microlitri di media embrione E3 in ogni pozzetto, seguita da aggiunta di 4 microlitri Alexa Fluor-488 azide (da uno stock 2,5 mm H 2 O), 2 microlitri BTTES-CuSO 4 6:01 complesso, e agitare delicatamente per miscelare. </li><li> Trasferimento degli embrioni nel pozzo contenente il reagente chimico clic utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur. Ogni bene deve contenere meno di cinque embrioni. </li><li> Aggiungere 2,5 microlitri ascorbato di sodio preparata (da uno stock di 100 mm H 2 O) per iniziare l'attacco su 3. Concentrazione finale di ogni reagente: Alexa Fluor-488 azide: 100 mM; CuSO 4: 50 micron; BTTES: 300 mM; ascorbato di sodio: 2,5 mm. </li><li> Dopo 3 minuti, aggiungere 2 microlitri bathocuproine solfonato (50 mM magazzino in H 2 O), un chelante del rame biocompatibile, per placare la reazione poi diluire subito con 100 microlitri di media embrione E3. </li><li> Trasferire gli embrioni per un piatto di vetro di Petri e lavare gli embrioni trattati 2 volte con 15 ml di media embrione E3. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Mettere una goccia di bassissimo punto di fusione agarosio (1,2% (w / v) in un mezzo embrione E3) su un fondo di vetro piatto MatTek pozzetti, e posto un embrione nella goccia di agarosio. </li><li> Posizionare gli embrioni dorsalmente o lateralmente e posizionare il piatto in ghiaccio per 5 minuti a solidificare la goccia di agarosio. Aggiungi medio E3 embrione dolcemente verso il piatto fino a coprire il calo di agarosio. </li><li> Immagini di campo fluorescenza e luminose vengono acquisiti in sequenza usando un microscopio confocale. Tutte le immagini degli embrioni vengono acquisite utilizzando un intervallo di fase 5 micron. Figure compositi sono stati preparati utilizzando il software ImageJ. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati La figura 1 mostra il flusso di lavoro della nostra strategia in due fasi di etichettatura. La Figura 2 mostra l'etichettatura di embrioni di zebrafish via BTTES-mediata CuAAC al 9,5 ore dopo la fecondazione (HPF). BTTES è un (triazolylmethyl) ammina tris a base di legante. Accelera CuAAC drammaticamente quando coordinamento con il Cu generato in situ (I), e promuove la reazione di cicloaddizione rapidamente nei sistemi viventi senza tossicità apparente. Subito dopo un 3-minuti di reazione su, siamo in grado di rilevare l'etichettatura robusta degli embrioni trattati PIL FucAl (Figura 2, pannelli a sinistra). Fluorescenza di fondo è rilevato solo per gli embrioni di controllo microiniettati con il PIL-fucosio (Figura 2, pannelli a destra). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La strategia di etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. In imaging in vivo di glicani fucosylated durante l'embriogenesi zebrafish via BTTES-Cu (I)-chimica catalizzata clic. Unicellulare embrioni di zebrafish fase sono microiniettati con una singola dose del PIL-FucAl e ha permesso di sviluppoop a 9,5 HPF. Gli embrioni vengono poi reagito con Alexa Fluor 488-azide catalizzata da BTTES-Cu (I). Gli embrioni vengono esposte reagito usando la microscopia confocale. Intensità massima di z-proiezione immagini di Alexa Fluor 488 fluorescenza (pannello superiore); campo Bright (pannello inferiore). Scala grafica: 100 micron. Risoluzione dei problemi <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Causa </td><td> Rimedio </td></tr><tr><td> Gli embrioni aspetto malsano </td><td> La soluzione microiniettati contiene contaminanti </td><td> La purezza degli zuccheri nucleotide deve essere superiore all'85%. Controlla la tua fonte. </td></tr><tr><td> Non c'è sull'etichetta dopo la reazione </td><td> Concentrazione di rame è inferiore a 30 micron </td><td> Fare attenzione a non diluire la soluzione di reazione con l'aggiunta di eccesso di media embrione E3 quando si aggiungono gli embrioni, come la velocità di reazione diminuisce in maniera significativa quando la concentrazione di rame è inferiore a 30 micron. </td></tr><tr><td> Gli embrioni muoiono dopo la reazione </td><td> Uso improprio degli embrioni </td><td> Assicurarsi che la pipetta è fuoco lucidato e il recipiente di reazione è rivestita con uno strato molto sottile di 0,5% di agarosio. </td></tr><tr><td> Le immagini appaiono spotty </td><td> I reagenti non sono propriamente mescolati prima di aggiungere gli embrioni </td><td> Seguire l'ordine consigliato di aggiunta dei reagenti, e assicurarsi che i reagenti clicca chimica sono stati opportunamente miscelati prima di aggiungere gli embrioni. </td></tr><tr><td> Le immagini mostrano gli embrioni vengono danneggiati </td><td> Vigorosa agitazione danni degli embrioni durante la reazione </td><td> Agitare delicatamente per meno di 10 secondi una volta gli embrioni sono nella soluzione. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<p class="jove_content"&gt; Imaging biomolecole<em&gt; In vivo</em&gt; Fornisce spunti critici della loro attività biologica nel loro ambiente naturale. In questo video, ci dimostrano come l&#39;etichettatura dei glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish è realizzato da microinjecting unicellulare embrioni stadio con il PIL-FucAl e una seconda fase coniugazione fluoroforo attraverso BTTES-mediata CuAAC biocompatibile<sup&gt; 3</sup&gt;. Etichettatura robusta può essere raggiunto entro 2-3 minuti, e il glicani etichett...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato pentaidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azide </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> destrano, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-L-ascorbato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic acido </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Con fondo di vetro piatto micropozzetti </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

glicani imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e chimica clicca bioorthogonal

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glicani di imaging in vivo è stato recentemente attivato utilizzando un bioorthogonal strategia giornalista chimica trattando cellule o degli organismi con monosaccaridi azide-o alchini-tag 1, 2. Il monosaccaridi modificato, elaborato dalla macchina biosintetica glicani, sono incorporati in glicoconiugati superficie cellulare. I tag bioorthogonal azide o alchini quindi consentire coniugazione covalente con sonde fluorescenti per la visualizzazione, oppure con sonde affinità per l&#39;arricchimento e l&#39;analisi glycoproteomic. Questo protocollo descrive le procedure normalmente utilizzate per l&#39;imaging non invasivo di glicani fucosylated in embrioni di zebrafish, tra cui: 1) microiniezione di una cella-embrioni stadio con un PIL-5-alkynylfucose (PIL-FucAl), 2) l&#39;etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish con azide coniugato fluorofori via Cu biocompatibile (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC), e 3) l&#39;imaging mediante microscopia confocale 3. Il metodo descritto qui può essere facilmente esteso ad altre classi di visualizzare glicani, glicani contenenti ad esempio acido sialico 4 e N-acetilgalattosamina 5, 6, in zebrafish di sviluppo e in altri organismi viventi.

Un click-chimica metodo basato che permette la rapida, etichettatura non invasivo, e robusto di alchini-tagged glicani in embrioni di zebrafish è descritto. Glicani Fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish in fase di gastrulazione fine erano ripreso in questo studio.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

L'imaging dei glicani in vivo è stato recentemente reso possibile attraverso l'impiego di una strategia di reporter chimico bioortogonale, trattando cellule o organismi con azide o...

La recente dimostrazione dell'imaging in vivo di glicani utilizza una strategia di reportage chimico bioortogonale, che prevede il trattamento di cellule o organismi con monosaccaridi marcati con alchini o azidi. I monosaccaridi modificati, elaborati dal macchinario biosintetico dei glicani, vengono incorporati nei glicoconjugati della superficie cellulare, contenenti marcatori bioortogonali alchini o azidi. Questi permettono quindi la coniugazione covalente con sonde fluorescenti per la visualizzazione o con sonde di affinità per l'arricchimento e l'analisi glicoproteomica.Questo metodo basato sulla chimica click consente un'etichettatura rapida, non invasiva e robusta di glicani alchini o azidi negli embrioni di pesce zebra e può essere facilmente esteso alla visualizzazione di altre classi di glicani in organismi in via di sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il rilevamento di glicani mediante lectine o anticorpi, è che può essere applicata all'imaging dinamico in vivo. I metodi di imaging basati su lectine o anticorpi forniscono soltanto un'istantanea dei glicani in un determinato momento.Sono difficili da implementare nel contesto di studi dinamici. Inoltre, l'etichettatura dei glicani con lectine o anticorpi richiede la rimozione delle cellule o dei tessuti di interesse dal loro ambiente naturale e il loro fissaggio prima dell'analisi. Al contrario, l'etichettatura dei glicani mediante la strategia del reporter chimico bioortogonale supera questi limiti e può essere applicata direttamente all'imaging non invasivo dei glicani in sistemi viventi, come embrioni di pesce zebra ed embrioni di *C. elegans*.Utilizzando la cicloadizione mediata da BTT Es di Azi Aine, una versione biocompatibile della chimica Qlik, è possibile ottenere un'etichettatura robusta in uno a cinque minuti. Per eseguire la procedura, procedere come segue: dal mio laboratorio, raccogliere e trasferire le uova di pesce zebra in una capsula di Petri da 35 millimetri. Rimuovere quanta più acqua possibile, quindi aggiungere pronasi E a una concentrazione di un milligrammo per millilitro nel mezzo per embrioni per digerire la coriona; dopo tre a cinque minuti, potrebbe verificarsi una formazione di bolle sulla coriona; a questo punto, immergere la capsula in un becher riempito con acqua per pesci.Trasferire delicatamente le uova nel becher lasciando cadere le uova nell'acqua. Risciacquare le uova abbondantemente con acqua per pesci in modo che la maggior parte delle uova si stacchi dal corione. Ora, utilizzando una pipetta levigata a fiamma, trasferire le uova rivestite in piastre di Petri ricoperte di agarosio e riempite con mezzo embrionale E3. Riempire le piastre da iniezione preparate con mezzo embrionale E3 e trasferire al loro interno le uova rivestite.Successivamente, preparare l'ago e caricarlo con due microlitri di soluzione di iniezione contenente GDP Fuk all 20 millimolare e, come tracciante, o il 5% di dextrina 5 94 o il colorante di carico 0,1% di rosso fenolo in cloruro di potassio 0,2 molare come controllo negativo. Sostituire GDP FUCA con GDP Fuco nella soluzione di iniezione. Ora spezzare l'ago e regolare la pressione e la durata dell'iniezione in modo da ottenere una goccia di un nanolitro.Quindi iniettare nelle uova un nanolitro della soluzione. Infine, trasferire le uova iniettate in piatti di Petri rivestiti con agrosa, riempiti con mezzo embrionale E3, e incubare a 28 gradi Celsius entro tre o quattro ore dalla fecondazione. Rimuovere le uova non fecondate quando gli embrioni raggiungono gli stadi di sviluppo desiderati, come la segmentazione tissutale tardiva della fase gastrula e la fase iniziale di larva.Rivestire la base di una piastra a 96 pozzetti con aros. Aggiungere 92 microlitri di mezzo per embrioni in ogni pozzetto, seguiti dall'aggiunta di quattro microlitri di 4 88 azide da un stock di 2,5 millimolare in acqua e due microlitri del complesso rameico B-T-T-E-S solfato di rame sei a uno mediante una pipetta di vetro con estremit&agrave; lucidata a fiamma. Trasferire meno di cinque embrioni nel pozzetto.Continuare aggiungendo il reagente di chimica click: aggiungere 2,5 µL di ascorbato di sodio appena preparato 100 millimolare. Per avviare la reazione click, far reagire per tre minuti. Aggiungere ora 2 µL di bato-cuprione solfonato 50 millimolare, un chelante del rame biocompatibile, per arrestare la reazione e diluire immediatamente con 100 µL di mezzo per embrioni.Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri di vetro e lavare gli embrioni trattati due volte con 15 millilitri di embryo.Medium. Posizionare una goccia di agarosio a punto di fusione ultra basso su una piastra con fondo in vetro opaco e trasferire un embrione nella goccia di agarosio. Posizionare correttamente l'embrione e mettere la piastra sul ghiaccio per cinque minuti.Per solidificare la goccia di agros, aggiungere delicatamente il mezzo per embrioni nella piastra fino a ricoprire l'agros. Aggiungere in modo sequenziale. Acquisire immagini in fluorescenza e in campo chiaro mediante microscopio confocale con intervalli di cinque micron e costruire figure composite.Utilizzando l'immagine. J-B-T-T-E-S è un ligando a base di amina aromatica che accelera in modo significativo il rame a c quando si coordina con il rame uno generato da NC due e promuove rapidamente la reazione di cicloaddizione in sistemi viventi senza tossicità apparente. Qui, gli embrioni di pesce zebra sono marcati mediante rame mediato da B-T-T-E-S.A a C a 9,5 ore post-fecondazione, immediatamente dopo una reazione di click della durata di tre minuti. Un marcamento robusto del GDPF in tutti gli embrioni trattati viene rilevato come previsto. Negli embrioni di controllo, microiniettati con GDP Fuco, viene rilevata solo una fluorescenza di fondo. Il marcamento e l'acquisizione delle immagini possono essere eseguiti in qualsiasi momento compreso tra 2,5 e 96 ore post-fecondazione.Queste immagini vengono ottenute a 24 e 48 ore post fecondazione. Pulse chase. L'uso di questa strategia consente il monitoraggio della biosintesi dinamica di glicani sialilati in cui l'Alcon fuco prodotto in diversi momenti temporali viene marcato con fluorocromi di diversi colori.Questa procedura può essere combinata con mutanti genetici o tecniche di soppressione genetica basate su fenotipi per analizzare i ruoli specifici dei singoli enzimi coinvolti nella sintesi dei glicani durante l'embriogenesi del pesce zebra. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biosintesi dei glicoconi, può essere applicato anche ad altre modifiche post-traduzionali, come l'acilazione durante la lipidazione.È inoltre applicabile allo studio delle proteine appena sintetizzate.

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Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Questo video mostra un test di captazione degli anticorpi per visualizzare la segnalazione Notch/DeltaD nei progenitori della glia radiale del pesce zebra. Prevede il montaggio di embrioni di pesce zebra dechorionati inclusi in agarosio, l'iniezione di una soluzione colorante mirata ai ligandi DeltaD sugli RGP e l'imaging al microscopio a fluorescenza per la divisione cellulare asimmetrica che conferma l'attivazione della segnalazione Notch/DeltaD.

Un saggio di captazione degli anticorpi per l'imaging della segnalazione Notch/DeltaD nei progenitori della glia radiale del pesce zebra

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Viene descritta una nuova tecnica per la rilevazione dei recettori endogeni a bassa abbondanza presenti negli embrioni di zebrafish. L'abbiamo chiamato AFLIP perché consiste nell'etichettatura di affinità del recettore da parte del suo ligando legato all'immunoprecipitazione.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

Questo lavoro descrive metodi per stabilire modelli iperglicemia acuta e cronica in zebrafish. L'obiettivo è quello di indagare l'impatto dell'iperglicemia sui processi fisiologici, come la neurogenesi costitutiva e indotta da lesioni. Il lavoro evidenzia anche l'uso di zebrafish per seguire molecole radiomarcate (qui, [ 18 F] -FDG) usando PET / CT.

Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l&#39;impatto dell&#39;iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

Qui, proponiamo un semplice protocollo che combina l'ingegneria degli oligosaccaridi metabolici, la chimica dei clic e la microscopia ad espansione che consente il bioimaging di N-glicoproteine sialilate intracellulari con una migliore risoluzione utilizzando apparecchiature di microscopia di routine.

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

Qui, presentiamo un protocollo per marcare le proteine con un tag proteico di fluorescenza nelle larve di zebrafish, un sistema in vivo recentemente sviluppato e modificato particolarmente utile per visualizzare le proteine a bassa abbondanza nel zebrafish.

Marcatura a fluorescenza per visualizzare le proteine a bassa espressione nel pesce zebra

Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Scopri l'imaging dei glicani negli embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e chimica click bioortogonale. Questo metodo consente la visualizzazione dinamica in vivo dei glicani fucosilati durante lo sviluppo.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

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