Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (TAC).

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire la microtomografia a raggi X 3D di tessuti mineralizzati e non mineralizzati. Ciò si ottiene estraendo prima i campioni da esaminare, quindi immobilizzando e posizionando i campioni nello strumento micro CT. La terza fase della procedura consiste nell'impostare i parametri di acquisizione per ogni campione e raccogliere le immagini.

Infine, si ottiene un'immagine 3D del campione ad alta risoluzione attraverso la TC a raggi X. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle nostre metodologie esistenti, come la risonanza magnetica, l'ecografia o la microscopia elettronica, è che fornisce informazioni sui volumi delle zecche con una risoluzione di un micron D.Questo metodo può fornire informazioni in molti tessuti biologici. Può essere utilizzato anche in elettronica, nelle scienze dei materiali e in archeologia.

La preparazione è diversa per i tessuti mineralizzati e non mineralizzati. I tessuti mineralizzati devono essere sigillati in contenitori a tenuta stagna, in modo che la posizione del campione non cambi. Sebbene vengano effettuate misurazioni ad alta risoluzione, la forma del contenitore varierà in base alla morfologia del tessuto.

Ad esempio, un femore di topo estratto da un embrione di età 18,5 D può entrare nel puntale di una pipetta. Inizia sigillando l'estremità stretta di un puntale per pipette in polistirolo con colla simile alla resina epossidica. Quindi riempire la punta con un tampone di lavoro.

In questo caso, PBS ora inserisce saldamente la gamba con il femore esposto nella punta e posiziona la punta della pipetta in un supporto adatto e sigilla l'altra estremità con un foglio di parafilm e perfonde l'animale come indicato nel manoscritto allegato. Quindi estrarre i polmoni e il cuore colorati e trasferirli in una provetta da 50 millilitri preparata. Metti gli organi su un foglio di carta asciutto.

Posizionare i campioni nelle provette di misurazione finale sul fondo della provetta è un panno umido all'etanolo. Per creare un ambiente saturo di etanolo, il campione deve adattarsi perfettamente all'interno della provetta. Se il campione è allentato, stringerlo con un filo e immobilizzarlo vicino al fondo del tubo appena sopra il panno.

Successivamente, incollare o avvitare il tubo in un supporto dello strumento e procedere con l'impostazione dell'immagine. Parametri di acquisizione. Iniziare posizionando il portacampioni nella fase di rotazione dello strumento.

Quindi, utilizzando valori selezionati arbitrariamente per tensione e corrente, si acquisisce un'immagine a raggi X. Se l'immagine è troppo scura. Apporta modifiche aumentando prima gradualmente il numero di fotoni.

Questo viene fatto aumentando progressivamente la corrente. Se l'immagine non è diventata più luminosa dopo aver aumentato la corrente a 200 microampere, allora fai piccoli aumenti progressivi dell'energia dei fotoni a raggi X aumentando la tensione. Se l'immagine è troppo luminosa, prima diminuire la tensione, quindi diminuire la corrente fino a quando l'immagine non è soddisfacente.

Il benning può anche essere utilizzato per aumentare la luminosità dell'immagine a scapito della risoluzione. Un valore di inning pari a due renderà l'immagine circa quattro volte più luminosa a metà della risoluzione. Dopo aver impostato la luminosità ottimale, ottimizzare il tempo di esposizione della fotocamera per scendere a compromessi tra il miglior contrasto ottenibile e una durata ragionevole dell'esperimento.

Il contrasto dell'immagine, in particolare per i campioni ad alto assorbimento, può essere migliorato utilizzando filtri per ridurre il flusso di fotoni a bassa energia. A questo punto, è possibile scegliere l'ingrandimento di lavoro tra 0,5 x e 40 x e adattare il campo visivo in modo da comprendere l'intero campione massimizzando la risoluzione. Per aumentare la risoluzione, posizionare la sorgente di raggi X più vicino al campione.

Per aumentare il campo visivo, posizionare il rilevatore più vicino al campione. Per l'imaging 3D, il campione deve rientrare nel campo visivo a qualsiasi angolo di rotazione, quindi l'asse di rotazione deve essere centrato. Iniziare ruotando il campione a meno 20 gradi.

Se il volume desiderato si è spostato lateralmente, riposizionare l'asse di rotazione. Procedere con lo scatto di immagini con ulteriori rotazioni e continuare ad apportare correzioni fino a quando il campione non è completamente visibile da 90 gradi negativi a 90 gradi positivi, quindi procedere con la misurazione a tutti gli angoli compresi tra 90 e 90 gradi negativi. L'esecuzione di un programma di imaging può richiedere molto tempo, quindi pianifica di conseguenza.

Ad esempio, per visualizzare la maggior parte del femore con ingrandimento Forex con una risoluzione di otto micron sono necessarie 1000 immagini di proiezione. Il completamento dell'operazione richiede solo tre ore. Tuttavia, ci vogliono 10 ore per raccogliere le 2.500 immagini di proiezione necessarie per visualizzare i polmoni di ratto con un ingrandimento di 0,5 x e una risoluzione di 16 micron.

Per il futuro confronto delle immagini, è necessario calibrare l'immagine prendendo immagini di un fantoccio standard realizzato con materiali artificiali che hanno un assorbimento dei raggi X simile all'osso e all'acqua nelle stesse condizioni sperimentali. Per quanto riguarda il campione, dopo aver registrato tutte le immagini di proiezione, viene ricostruito l'intero volume. Per calibrare l'immagine ricostruita in base ai valori del fantasma, utilizzare il campo segugi o la scala CT.

Ad esempio, con l'ingrandimento Forex, il valore simile all'acqua nel fantasma è impostato su zero e il valore simile all'osso è impostato su 3000 da questo intervallo. Tutti gli altri valori vengono interpolati o estrapolati. Le immagini possono ora essere analizzate utilizzando qualsiasi pacchetto software in grado di supportare file da 20 gigabyte, come l'immagine freeware J o Fiji.

Questo rendering del volume mostra il femore di un topo quattro giorni dopo l'inizio della mineralizzazione ossea, la frazione mineralizzata calcolata al 18% e la densità minerale ossea può essere confrontata con le ossa in altri stadi di sviluppo. Questa rappresentazione tomografica del volume dei polmoni di una femmina di ratto nudo di 12 settimane è risolta a 16 micron. La colorazione polmonare viene utilizzata per rivelare vasi sanguigni di 20 micron di diametro.

In questa sezione seriale analisi degli stessi polmoni. I noduli tumorali multipli possono essere visti come forme grigie solide entro quattro settimane dall'impianto delle cellule tumorali. In questi polmoni, i noduli sono cresciuti fino a coprire il 17% del volume polmonare.

La maggior parte delle colorazioni polmonari è stata riscontrata nelle aree periferiche dei tumori. All'interno dei noduli sono presenti anche vasi sanguigni che coprono circa il 3% del loro volume. Una volta padroneggiato, il posizionamento del campione può essere effettuato in 15-20 minuti se eseguito correttamente.

Il tempo di imaging, compresa la ricostruzione automatica del volume, che di solito non richiede la presenza di un operatore dipendente, dipende dal campione e può richiedere fino a 50 ore. Non dimenticare che lavorare con agenti fissanti e coloranti può essere estremamente pericoloso. Indossare sempre guanti da laboratorio ed evitare di respirare i vapori dei campioni.