Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano
17 febbraio 2011
Questa comunicazione presenta i dati sulla precisione e la riproducibilità dei Biospec nano-UV-VIS per dsDNA e quantificazione delle proteine. Anche con ultra-piccoli volumi (da 1 a 2 L), la riproducibilità è eccellente, mentre la funzione automatica pulire migliora la velocità e si traduce in riporto minimo per ottenere risultati più precisi.
L'obiettivo generale di questa procedura è determinare con precisione e riproducibilità le concentrazioni di acidi nucleici e proteine utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando il percorso ottico appropriato per il campione da misurare. Il secondo passaggio della procedura consiste nel misurare un bianco.
Successivamente, viene misurato il campione di DNA o proteina. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel salvare i dati in formato PDF o CSV. In definitiva, risultati altamente riproducibili per il DNA e le proteine.
La quantificazione può essere ottenuta rapidamente e con precisione mediante questo metodo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è rapida, precisa e riproducibile. Per iniziare la procedura di quantificazione del DNA, accendere lo spettrofotometro BIOSpec-nano.
Aprire il software BIOS spec nano dal desktop del PC. Fare clic sulla scheda acido nucleico semplice D-S-D-N-A. Il software stabilirà la comunicazione con lo strumento ed eseguirà una sequenza di inizializzazione.
Questo verifica che lo strumento stia funzionando secondo le specifiche. Successivamente, selezionare la lunghezza del cammino ottico. Sul cursore della lunghezza del cammino ottico.
Sono disponibili tre opzioni per campioni di volume microlitrico. È possibile utilizzare 0,2 millimetri o 0,7 millimetri. E per campioni diluiti, esiste l'opzione di utilizzare un cammino ottico di cinque millimetri.
In questa dimostrazione, viene selezionato 0,7 millimetri per misurare un campione di due microlitri. Tutti i calcoli si basano sulla lunghezza del cammino ottico selezionata. Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda impostazione e selezionare la configurazione della pulizia automatica.
Selezionarne uno per ogni pulizia. Prima della misurazione del campione, o ogni volta che viene selezionata una nuova lunghezza del cammino ottico, è necessaria una misurazione del bianco. Per una pipetta con lunghezza del cammino ottico di 0,7 millimetri, depositare due microlitri di acqua o tampone sulla piattaforma. Fare clic su "bianco" per eseguire la misurazione del bianco.
La finestra superiore si sposterà per entrare in contatto con la goccia del campione e si potranno osservare lampi di xenon. Al termine della misurazione, lo spazzolino rimuoverà automaticamente il campione. Ora il campione può essere misurato.
È importante utilizzare una soluzione campione omogenea, poiché la presenza di particelle non disciolte comporta dati non riproducibili. Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, aspirare con attenzione due microlitri del campione e quindi dispensare uniformemente il campione dalla punta della pipetta sul supporto.
Premere il pulsante di avvio dello strumento. Come in precedenza, la finestra superiore si sposterà per entrare in contatto con la goccia del campione e si potranno osservare lampi di xenon; per determinare la riproducibilità, ripetere la misurazione dello stesso campione tre volte. Tutti i dati registrati vengono salvati automaticamente come file A BUD. Per salvare in formato PDF o CCSV, fare clic su salva P-D-F-C-S-V.
I risultati possono anche essere salvati come file CSV utilizzando l'opzione appropriata nella scheda di salvataggio. La quantificazione delle proteine può essere eseguita utilizzando il metodo di assorbanza a 280 nm. Per la quantificazione delle proteine, selezionare la scheda di quantificazione delle proteine.
Inserire il coefficiente di estinzione epsilon 280 se noto; se epsilon 280 non è noto, calcolarlo utilizzando epsilon 280 calc. Selezionare 0,2 millimetri sul cursore della lunghezza del cammino ottico per misurare un campione di tre microlitri. Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda setup e selezionare la configurazione della pulizia automatica. Selezionare due per due pulizie al fine di prevenire qualsiasi contaminazione incrociata e garantire una lettura accurata.
Per eseguire la misura del bianco, pipettare tre microlitri di acqua o tampone sulla pedana e fare clic su "bianco" per la misurazione del bianco. Successivamente, pipettare con attenzione tre microlitri del campione proteico sulla pedana. Senza introdurre bolle d'aria, iniziare la misurazione del campione facendo clic su "start" nel software o premendo il pulsante di avvio sull'apparecchio.
Ripetere la misurazione dello stesso campione tre volte per determinare la riproducibilità mostrata. Di seguito sono riportati i dati ottenuti da misurazioni su un tipico campione di DNA a doppio filamento. La formula utilizzata per il calcolo della concentrazione del DNA è: concentrazione del campione uguale a DF per la quantità di OD a 260 meno OD a 320 per NACF, dove DF corrisponde al fattore di diluizione del campione e NACF al fattore di concentrazione dell'acido nucleico.
Il fattore di concentrazione degli acidi nucleici viene impostato in base all'analita selezionato. Vengono indicati la concentrazione calcolata di acidi nucleici e il rapporto OD 2 62 80. Questa tabella contiene i risultati del test di riproducibilità per la quantificazione del DNA.
Nel complesso, i dati mostrano risultati altamente riproducibili, come evidenziato dalla bassa deviazione standard relativa dello 0,26%. Vengono qui mostrati risultati rappresentativi di un'analisi della concentrazione proteica per la BSA. La concentrazione proteica espressa in microgrammi per millilitro si basa sul valore Epsilon due 80. Infine, questa tabella mostra un'analisi della riproducibilità della quantificazione proteica.
La deviazione standard relativa dello 0,51% indica che lo spettrofotometro BIOS spec nano misura con precisione l'assorbanza non solo per il DNA, ma anche per le proteine. Una volta acquisita padronanza, è possibile analizzare più campioni in un minuto.
Panoramica
Questo studio valuta l'accuratezza e la riproducibilità dello spettrofotometro BioSpec-nano UV-VIS per la quantificazione di dsDNA e proteine. Il metodo dimostra un'eccellente riproducibilità anche con volumi di campione estremamente ridotti, aumentando la produttività con un trasferimento minimo da un campione all'altro.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica biochimica
- Chimica analitica
- Biotecnologia
Sfondo
- Una quantificazione accurata di acidi nucleici e proteine è fondamentale nella ricerca biologica.
- La spettrofotometria in volume micro permette l'analisi con requisiti minimi di campione.
- Funzioni automatizzate possono migliorare l'efficienza e l'accuratezza delle misurazioni.
- La riproducibilità è essenziale per ottenere risultati sperimentali affidabili.
Scopo dello studio
- Valutare le prestazioni dello spettrofotometro BioSpec-nano per la quantificazione di acidi nucleici e proteine.
- Stabilire un protocollo per misurazioni accurate utilizzando volumi ridotti di campione.
- Dimostrare l'affidabilità dei risultati mediante misurazioni ripetute.
Metodi Utilizzati
- Selezione del percorso ottico appropriato per la misurazione del campione.
- Misurazione del bianco prima dell'analisi del campione.
- Pulizia automatica per prevenire il trasferimento di materiale tra i campioni.
- Salvataggio dei dati in formati PDF o CSV per ulteriori analisi.
Risultati principali
- Risultati altamente riproducibili per la quantificazione del DNA con una deviazione standard relativa dello 0,26%.
- La quantificazione delle proteine ha mostrato anche un'elevata accuratezza con una deviazione standard relativa dello 0,51%.
- Misurazioni rapide e precise possono essere ottenute con il BioSpec-nano.
- Più campioni possono essere analizzati rapidamente, aumentando la produttività.
Conclusioni
- Lo spettrofotometro BioSpec-nano fornisce una quantificazione affidabile sia per il DNA a doppio filamento che per le proteine.
- Le funzioni automatizzate migliorano in modo significativo l'efficienza delle misurazioni.
- Questo metodo è adatto ad applicazioni ad alto rendimento nella ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Una quantificazione accurata e riproducibile di acidi nucleici e proteine è essenziale per la validazione degli obiettivi e lo sviluppo di saggi nella fase iniziale della scoperta di farmaci. Lo spettrofotometro a microvolume BioSpec-nano consente misurazioni ad alto rendimento con basso consumo di campione e gestione automatizzata dei campioni, riducendo la variabilità e migliorando l'affidabilità dei dati nei flussi di lavoro per l'identificazione dei composti promettenti. Il suo rapido ciclo di misurazione e la bassa deviazione standard relativa supportano una maggiore affidabilità predittiva nelle applicazioni di screening successivi e traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente una quantificazione precisa di campioni di acidi nucleici e proteine per supportare l'analisi dell'espressione genica e l'indagine dei percorsi biologici.
- Valore operativo: Riduce il consumo di campioni e il numero di passaggi manuali, aumentando la produttività nei test di ipotesi nella biologia della scoperta.
- Valore predittivo: Una bassa deviazione standard relativa (0,26% per il DNA, 0,51% per le proteine) aumenta l'affidabilità dei dati quantitativi utilizzati per decisioni di avanzamento o interruzione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni riproducibili dell'assorbanza (OD260-OD320 per il DNA, OD280 per le proteine) adatte alla standardizzazione dei saggi e alla qualificazione dei reagenti.
- Valore operativo: La pulizia e la taratura automatiche riducono al minimo il carryover e garantiscono coerenza nelle misurazioni tra piastre o lotti.
- Scalabilità: Un tempo di misurazione di tre secondi consente lo screening rapido di librerie di campioni o di prodotti di frazionamento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta la quantificazione di biomarcatori e l'analisi di campioni farmacocinetici in cui è richiesta una rilevazione ad alto grado di precisione e basso volume.
- De-risking meccanicistico: Dati accurati sulla concentrazione proteica (mediante calcolo di ε280 dai residui di Trp, Tyr, Cys-S-S) consentono un dosaggio corretto nei saggi funzionali.
- Integrazione del flusso di lavoro: L'output in formato PDF/CSV facilita il tracciamento dei dati e la condivisione tra team di scoperta e preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il BioSpec-nano si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio allo sviluppo del saggio fino all'analisi di campioni preclinici, in particolare nei casi in cui sono fondamentali la conservazione del campione e la riproducibilità delle misurazioni.
- Biologia della scoperta: Supporta la quantificazione basata su ipotesi di acidi nucleici (ad esempio, costrutti di espressione genica) e proteine (ad esempio, bersagli purificati, anticorpi) per la validazione dei bersagli.
- Screening: Permette il controllo qualità degli input campione e degli output reazionali in saggi biochimici o cellulari con requisiti minimi di volume.
- Analisi: Fornisce letture quantitative basate sull'OD con correzione automatica del cammino ottico e calcolo del coefficiente di estinzione per le proteine.
- Ricerca traslazionale: Compatibile con campioni preclinici a basso volume (ad esempio, plasma, lisati di tessuto) che richiedono una normalizzazione accurata della concentrazione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come risorsa condivisa del laboratorio centrale per una quantificazione standardizzata in progetti e modalità diversi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la qualità dei dati e la riproducibilità nella quantificazione di acidi nucleici e proteine, riducendo falsi negativi/positivi nei test di screening iniziali.
- Valore operativo: L'automazione del contatto con il campione, della misurazione e della pulizia riduce la variabilità introdotta dall'operatore e aumenta l'efficienza del laboratorio.
- Valore strategico: Consente un'iterazione più rapida nell'ottimizzazione del composto attivo fornendo una quantificazione affidabile per studi di relazione struttura-attività (SAR).
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'allocazione delle risorse adeguata al rischio fornendo dati quantitativi attendibili per la priorizzazione degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede familiarità con i principi dello spettrofotometro e la selezione del cammino ottico in base alla concentrazione del campione.
- Necessita dell'accesso a un PC dotato di software BioSpec-nano e della manutenzione periodica delle superfici ottiche.
- Traggo beneficio da procedure operative standardizzate (SOP) per l'azzeramento, la pulizia e l'applicazione del campione, al fine di garantire coerenza tra diversi utilizzatori.
- Adattabile a diversi tipi di campione (DNA, proteine, altri analiti) mediante configurazione del software e regolazione del cammino ottico.
- Limitato alla quantificazione basata sull'assorbanza; non adatto per saggi fluorescenti o chemiluminescenti senza strumentazione aggiuntiva.
