Name: Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Scopri come determinare concentrazioni di acidi nucleici e proteine con precisione e riproducibilità utilizzando lo spettrofotometro BioSpec-nano a microvolume. Questo metodo garantisce misurazioni rapide e affidabili.

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1. Procedura per la quantificazione del DNA <ol><li> Accendere lo strumento. </li><li> Aprire il Biospec-nano software dal desktop del PC. </li><li> Clicca sul semplice Nucleic Acid-dsDNA scheda (Figura 1). </li><li> Il software stabilire una comunicazione con lo strumento ed eseguire una sequenza di inizializzazione. Questo verifica che lo strumento sta eseguendo in base alle specifiche. </li><li> Selezionare 0,7 o 0,2 mm sul cursore cammino ottico. Seleziona il cammino ottico e tutti i calcoli sono basati sul cammino ottico selezionato. </li><li> Prossima Biospec-nano click software di installazione-Autowiping installazione. Selezionare 1 o 2. </li><li> Pipettare 2 microlitri (per 0,7 mm) H 2 O o tampone sul piedistallo. </li><li> Clicca vuoto o F6 per la misurazione vuoto. Ogni volta che un nuovo cammino ottico è selezionata, è necessario registrare un vuoto. </li><li> Pipettare 2 ml di campione sul piedistallo. </li><li> Fare clic su Start nel software o premere il pulsante di avvio sullo strumento. La finestra superiore si muove per prendere contatto con la goccia del campione. Flash allo xeno possono essere osservati. </li><li> Ripetere lo stesso campione 3 volte a determinare la riproducibilità. </li><li> Tutti i dati registrati vengono salvati come file. Bud file. </li><li> Per salvare come file. Pdf o. Csv clicca salvare pdf / csv o F9. I risultati possono anche essere salvati come file. Csv utilizzando la selezione appropriata nella scheda Salva. </li></ol> 2. Protocollo per la quantificazione delle proteine <ol><li> Seleziona quantificazione scheda proteine ​​(Figura 2). </li><li> Inserire l'E280 coefficiente di estinzione, se è nota. </li><li> E280 se non si sa calcolare usando e280Calc. </li><li> Selezionare 0,7 o 0,2 mm sul cursore cammino ottico. </li><li> Fare clic su Imposta-Autowiping installazione. Selezionare 2 o superiore. </li><li> Pipettare 3 ml (per 0,2 mm) H 2 O o tampone sul piedistallo. </li><li> Clicca vuoto o F6 per la misurazione vuoto. </li><li> Pipettare 3 ml di campione di proteine ​​sul piedistallo. </li><li> Fare clic su Start nel software o premere il pulsante di avvio sullo strumento. </li><li> Ripetere lo stesso campione 3 volte a determinare la riproducibilità. </li><li> Tutti i dati registrati vengono salvati come file. Bocciolo di file </li><li> Per salvare come file. Pdf o. Csv clicca salvare pdf / csv o F9. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: 1. Risultati per la quantificazione del DNA La figura 3 mostra i dati da misure su un tipico esempio di DNA a doppio filamento. La concentrazione e OD 260/280 rapporto calcolato sono mostrati. Figura 4 contiene la riproducibilità dei risultati di prova per la quantificazione del DNA. I dati in figure 3 e 4 mostra i risultati sono altamente riproducibili, come risulta dalla bassa deviazione standard relativa del 0,26%. Nota 1: Inesattezza quantificazione del DNA possono derivare dalla presenza di componenti del tampone che possono assorbire nella regione UV. E 'anche necessario utilizzare una soluzione omogenea del campione. Poiché la quantità di campione in pipettato è solo 1-2 microlitri, pipettaggio attento di volumi precisi senza introduzione di eventuali bolle è richiesto. 2. Risultati per la quantificazione delle proteine La figura 5 rappresenta la concentrazione analisi delle proteine ​​per BSA. La mg / ml concentrazione di proteine ​​si basa sul valore E280. La figura 6 mostra l'analisi riproducibilità. E 'evidente dalla deviazione standard relativa del 0,51% che la Biospec-nano misura la concentrazione di precisione - non solo per il DNA, ma anche per le proteine. Nota 2: Fattori che influenzano la concentrazione di proteine Determinazione accurata della concentrazione di proteine ​​è possibile quando ci sono effetti minimi di instabilità causata da pH, tamponi, la temperatura, o additivi. La maggior parte delle proteine ​​purificate passa attraverso varie fasi di lavorazione e quindi è possibile che la proteina può contenere tensioattivi o altri additivi che possono interferire con la formazione di goccioline. Per tali campioni, utilizzando il percorso ottico 5 millimetri cellula quarzo è altamente raccomandato. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Analita finestra di selezione per la quantificazione del DNA doppio filamento <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Finestra di selezione per la mancata quantificazione Analita proteina marcata <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Dati Rappresentante Figura 3. Per la quantificazione del DNA <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Dati Riproducibilità Figura 4. Per la quantificazione del DNA <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Dati Rappresentante per la quantificazione delle proteine <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"Figura'> Figura 6. Riproducibilità dei dati per la quantificazione delle proteine

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran, PhD è un dipendente di Shimadzu che rende lo strumento descritto in questo articolo.

Il Biospec-nano è stato progettato per risolvere i problemi attuali inerenti i metodi di quantificazione del DNA, come i risultati inconsistenti e lavoro manuale noioso. Ogni misurazione dura solo 3 secondi, consentendo un esperto biologo molecolare per l&#39;analisi circa 3-6 campioni multipli in un minuto. La caratteristica unica del tergicristallo non solo migliora il throughput di misura, elimina anche la necessità di pulizia manuale dei piedistalli, con conseguente riporto trascurabile tra le misurazioni. Inoltre, i test utilizzando solo 2 salviette per i campioni di DNA contenente 1000 ng / mL, indicato riporto inferiore a 2 ng / mL. La disponibilità di una cella di 5 millimetri Lunghezza di percorso fornisce un&#39;opzione per analizzare diluire campioni di acidi nucleici e proteine ​​ed estende l&#39;uso di questo strumento per altre applicazioni.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN del timo di vitello</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​utilizzando il micro-volume bio-spec spettrofotometro nano

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid procedure di quantificazione sono avanzati in modo significativo negli ultimi tre decenni. Sempre più, i biologi molecolari richiedono costante di piccoli volumi analisi dei campioni di acidi nucleici per i loro esperimenti. Il Biospec-nano fornisce una possibile soluzione ai problemi della inesatte, non riproducibili, inerenti gli attuali metodi di quantificazione del DNA, attraverso l&#39;ottica specializzati e un rivelatore sensibile PDA. Il Biospec-nano dispone anche di funzionalità automatizzate in modo tale che il montaggio, la misura e la pulizia sono fatte dallo strumento, eliminando così il posizionamento noioso, ripetitivo, e incoerente l&#39;elemento in fibra ottica e la pulizia manuale. In questo studio, i dati vengono presentati sulla quantificazione di DNA e proteine, nonché la riproducibilità di misura e precisione. Contatto automatizzata dei campioni e la scansione rapida consente di misurare in tre secondi, con conseguente rendimento eccellente. L&#39;analisi dei dati viene effettuata utilizzando il built-in caratteristiche del software. La formula utilizzata per calcolare la concentrazione del DNA è: Concentrazione campione = DF · (OD260-OD320) · NACF (1) Dove DF = fattore di diluizione del campione, NACF = fattore di concentrazione di acido nucleico. Il fattore di concentrazione di acido nucleico è impostato secondo l&#39;analita selezionato 1. Risultati concentrazione di proteine ​​può essere espressa come mg / ml o come moli / L inserendo E280 e valori di peso molecolare rispettivamente. Quando i valori di residui di Tyr, Trp e cisteina (SS obbligazioni) sono inseriti nella scheda e280Calc, i valori di estinzione coefficienti sono calcolati come E280 = 5500 x (residui Trp) + 1.490 x (residui Tyr) + 125 x (cisteina SS bond) . L&#39;E280 valore viene utilizzato dal software per il calcolo della concentrazione. Oltre alla determinazione della concentrazione di acidi nucleici e proteine, il Biospec-nano può essere usato come un ultra-micro volumi spettrofotometro per molti altri analiti o come uno spettrofotometro standard con 5 celle cammino ottico mm.

Questa comunicazione presenta i dati sulla precisione e la riproducibilità dei Biospec nano-UV-VIS per dsDNA e quantificazione delle proteine. Anche con ultra-piccoli volumi (da 1 a 2 L), la riproducibilità è eccellente, mentre la funzione automatica pulire migliora la velocità e si traduce in riporto minimo per ottenere risultati più precisi.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Le procedure di quantificazione degli acidi nucleici hanno fatto progressi significativi negli ultimi tre decenni. Sempre più spesso, i biologi molecolari richiedono una coerenza...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare con precisione e riproducibilità le concentrazioni di acidi nucleici e proteine utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando il percorso ottico appropriato per il campione da misurare. Il secondo passaggio della procedura consiste nel misurare un bianco.Successivamente, viene misurato il campione di DNA o proteina. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel salvare i dati in formato PDF o CSV. In definitiva, risultati altamente riproducibili per il DNA e le proteine.La quantificazione può essere ottenuta rapidamente e con precisione mediante questo metodo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è rapida, precisa e riproducibile. Per iniziare la procedura di quantificazione del DNA, accendere lo spettrofotometro BIOSpec-nano.Aprire il software BIOS spec nano dal desktop del PC. Fare clic sulla scheda acido nucleico semplice D-S-D-N-A. Il software stabilirà la comunicazione con lo strumento ed eseguirà una sequenza di inizializzazione.Questo verifica che lo strumento stia funzionando secondo le specifiche. Successivamente, selezionare la lunghezza del cammino ottico. Sul cursore della lunghezza del cammino ottico.Sono disponibili tre opzioni per campioni di volume microlitrico. È possibile utilizzare 0,2 millimetri o 0,7 millimetri. E per campioni diluiti, esiste l'opzione di utilizzare un cammino ottico di cinque millimetri.In questa dimostrazione, viene selezionato 0,7 millimetri per misurare un campione di due microlitri. Tutti i calcoli si basano sulla lunghezza del cammino ottico selezionata. Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda impostazione e selezionare la configurazione della pulizia automatica.Selezionarne uno per ogni pulizia. Prima della misurazione del campione, o ogni volta che viene selezionata una nuova lunghezza del cammino ottico, è necessaria una misurazione del bianco. Per una pipetta con lunghezza del cammino ottico di 0,7 millimetri, depositare due microlitri di acqua o tampone sulla piattaforma. Fare clic su "bianco" per eseguire la misurazione del bianco.La finestra superiore si sposterà per entrare in contatto con la goccia del campione e si potranno osservare lampi di xenon. Al termine della misurazione, lo spazzolino rimuoverà automaticamente il campione. Ora il campione può essere misurato.È importante utilizzare una soluzione campione omogenea, poiché la presenza di particelle non disciolte comporta dati non riproducibili. Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, aspirare con attenzione due microlitri del campione e quindi dispensare uniformemente il campione dalla punta della pipetta sul supporto.Premere il pulsante di avvio dello strumento. Come in precedenza, la finestra superiore si sposterà per entrare in contatto con la goccia del campione e si potranno osservare lampi di xenon; per determinare la riproducibilità, ripetere la misurazione dello stesso campione tre volte. Tutti i dati registrati vengono salvati automaticamente come file A BUD. Per salvare in formato PDF o CCSV, fare clic su salva P-D-F-C-S-V.I risultati possono anche essere salvati come file CSV utilizzando l'opzione appropriata nella scheda di salvataggio. La quantificazione delle proteine può essere eseguita utilizzando il metodo di assorbanza a 280 nm. Per la quantificazione delle proteine, selezionare la scheda di quantificazione delle proteine.Inserire il coefficiente di estinzione epsilon 280 se noto; se epsilon 280 non è noto, calcolarlo utilizzando epsilon 280 calc. Selezionare 0,2 millimetri sul cursore della lunghezza del cammino ottico per misurare un campione di tre microlitri. Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda setup e selezionare la configurazione della pulizia automatica. Selezionare due per due pulizie al fine di prevenire qualsiasi contaminazione incrociata e garantire una lettura accurata.Per eseguire la misura del bianco, pipettare tre microlitri di acqua o tampone sulla pedana e fare clic su "bianco" per la misurazione del bianco. Successivamente, pipettare con attenzione tre microlitri del campione proteico sulla pedana. Senza introdurre bolle d'aria, iniziare la misurazione del campione facendo clic su "start" nel software o premendo il pulsante di avvio sull'apparecchio.Ripetere la misurazione dello stesso campione tre volte per determinare la riproducibilità mostrata. Di seguito sono riportati i dati ottenuti da misurazioni su un tipico campione di DNA a doppio filamento. La formula utilizzata per il calcolo della concentrazione del DNA è: concentrazione del campione uguale a DF per la quantità di OD a 260 meno OD a 320 per NACF, dove DF corrisponde al fattore di diluizione del campione e NACF al fattore di concentrazione dell'acido nucleico.Il fattore di concentrazione degli acidi nucleici viene impostato in base all'analita selezionato. Vengono indicati la concentrazione calcolata di acidi nucleici e il rapporto OD 2 62 80. Questa tabella contiene i risultati del test di riproducibilità per la quantificazione del DNA.Nel complesso, i dati mostrano risultati altamente riproducibili, come evidenziato dalla bassa deviazione standard relativa dello 0,26%. Vengono qui mostrati risultati rappresentativi di un'analisi della concentrazione proteica per la BSA. La concentrazione proteica espressa in microgrammi per millilitro si basa sul valore Epsilon due 80. Infine, questa tabella mostra un'analisi della riproducibilità della quantificazione proteica.La deviazione standard relativa dello 0,51% indica che lo spettrofotometro BIOS spec nano misura con precisione l'assorbanza non solo per il DNA, ma anche per le proteine. Una volta acquisita padronanza, è possibile analizzare più campioni in un minuto.

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