Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano
February 17th, 2011
Questa comunicazione presenta i dati sulla precisione e la riproducibilità dei Biospec nano-UV-VIS per dsDNA e quantificazione delle proteine. Anche con ultra-piccoli volumi (da 1 a 2 L), la riproducibilità è eccellente, mentre la funzione automatica pulire migliora la velocità e si traduce in riporto minimo per ottenere risultati più precisi.
L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le concentrazioni di acidi nucleici e proteine in modo accurato e riproducibile utilizzando uno spettrofotometro a micro volume. Ciò si ottiene selezionando prima la lunghezza del percorso appropriata per il campione da misurare. Il secondo passo della procedura consiste nel misurare un bianco.
Successivamente, viene misurato il campione di DNA o proteine. Il passaggio finale della procedura consiste nel salvare i dati in formato PDF o CSV. In definitiva, risultati altamente riproducibili per DNA e proteine.
La quantificazione può essere ottenuta in modo rapido e preciso con questo metodo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, precisa e riproducibile. Per iniziare la procedura per la quantificazione del DNA, accendere il nano spettrofotometro con specifiche del BIOS.
Aprire il software nano delle specifiche del BIOS dal desktop del PC. Fare clic sulla scheda D-S-D-N-A dell'acido nucleico semplice. Il software stabilirà la comunicazione con lo strumento ed eseguirà una sequenza di inizializzazione.
Questo verifica che lo strumento funzioni secondo le specifiche. Quindi, seleziona la lunghezza del percorso. Sul dispositivo di scorrimento della lunghezza del percorso.
Sono disponibili tre opzioni per campioni di volume di microlitri. È possibile utilizzare 0,2 millimetri o 0,7 millimetri. E per i campioni diluiti, c'è un'opzione per utilizzare un vete di cinque millimetri di lunghezza del percorso.
In questa dimostrazione, vengono selezionati 0,7 millimetri per misurare un campione di due microlitri. Tutti i calcoli si basano sulla lunghezza del percorso selezionata. Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda di configurazione e selezionare la configurazione della cancellazione automatica.
Selezionane uno per una salvietta. Prima della misurazione del campione, o ogni volta che viene selezionata una nuova lunghezza del percorso, è necessaria una misurazione in bianco Per una lunghezza del percorso di 0,7 millimetri pipettare due microlitri di acqua o tampone sul piedistallo. Fare clic su vuoto per la misurazione del bianco.
La finestra superiore si sposterà per entrare in contatto con la gocciolina del campione e si potranno osservare lampi di xeno. Al termine della misurazione, il tergicristallo asciugherà automaticamente il campione. Ora il campione può essere misurato.
È importante utilizzare una soluzione campione omogenea in quanto presenza di particolato non disciolto. La particella campione produrrà dati irriproducibili. Per evitare l'introduzione di bolle d'aria, aspirare con cura due microlitri di campione e quindi pipettare il campione in modo uniforme dalla punta della pipetta sul piedistallo.
Premere il pulsante di avvio sullo strumento. Come prima, la finestra superiore si sposterà per entrare in contatto con la gocciolina del campione e i lampi di xeno possono essere osservati per determinare la riproducibilità, ripetere la misurazione dello stesso campione tre volte, tutti i dati registrati vengono salvati automaticamente come file BUD A. Per salvare come file PDF o CCSV, fare clic su salva P-D-F-C-S-V.
I risultati possono anche essere salvati come file CSV utilizzando l'apposita selezione nella scheda di salvataggio. La quantificazione delle proteine può essere eseguita utilizzando il metodo dell'assorbanza due 80. Per la quantificazione delle proteine, selezionare la scheda Quantificazione delle proteine.
Immettere il coefficiente di estinzione epsilon due 80 se noto, se Epsilon due 80 non è noto, calcolarlo utilizzando Epsilon due 80 calc selezionare 0,2 millimetri sul cursore della lunghezza del percorso per misurare un campione di tre microlitri. Successivamente, nel software, fare clic sulla scheda di configurazione e selezionare la configurazione della cancellazione automatica. Selezionare due salviette per due per evitare il trascinamento del campione e per garantire una lettura accurata.
Per misurare una pipetta vuota tre microlitri di acqua o tampone sul piedistallo, fare clic su bianco per la misurazione del bianco. Quindi, pipettare con cura tre microlitri di campione proteico sul piedistallo. Senza introdurre bolle d'aria per iniziare a misurare il campione, fare clic su Avvia nel software o premere il pulsante di avvio sullo strumento.
Ripetere la misurazione dello stesso campione tre volte per determinare la riproducibilità mostrata. Di seguito sono riportati i dati delle misurazioni su un tipico campione di DNA a doppio filamento. La formula utilizzata per calcolare la concentrazione di DNA è uguale alla concentrazione del campione è uguale a DF moltiplicato per la quantità di OD due 60 meno OD tre 20 volte NACF, dove DF è uguale al fattore di diluizione del campione e NACF è uguale al fattore di concentrazione dell'acido nucleico.
Il fattore di concentrazione dell'acido nucleico viene impostato in base all'analita selezionato. Sono indicati la concentrazione di acido nucleico calcolata e il rapporto OD 2 62 80. Questa tabella contiene i risultati dei test di riproducibilità per la quantificazione del DNA.
Insieme, i dati mostrano risultati altamente riproducibili, come evidente dalla bassa deviazione standard relativa dello 0,26%. La concentrazione di proteine in microgrammi per millilitro si basa sul valore di Epsilon two 80. Infine, questa tabella mostra un'analisi di riproducibilità della quantificazione delle proteine.
La deviazione standard relativa dello 0,51% indica che le specifiche del BIOS nano misurano con precisione non solo il DNA, ma anche le proteine. Una volta padroneggiati, è possibile analizzare più campioni in un minuto.
Panoramica
Questo studio valuta l'accuratezza e la riproducibilità dello spettrofotometro BioSpec-nano UV-VIS per la quantificazione di dsDNA e proteine. Il metodo dimostra un'eccellente riproducibilità anche con volumi di campione ultra-piccoli, migliorando il throughput con un minimo di trascinamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biochimica
- Chimica Analitica
- Biotecnologia
Background
- La quantificazione accurata degli acidi nucleici e delle proteine è cruciale nella ricerca biologica.
- La spettrofotometria a micro volume permette l'analisi con requisiti minimi di campione.
- Le funzioni automatizzate possono migliorare l'efficienza e l'accuratezza della misurazione.
- La riproducibilità è essenziale per risultati sperimentali affidabili.
Obiettivo dello Studio
- Valutare le prestazioni dello spettrofotometro BioSpec-nano per la quantificazione di acidi nucleici e proteine.
- Stabilire un protocollo per misurazioni accurate utilizzando piccoli volumi di campione.
- Dimostrare l'affidabilità dei risultati attraverso misurazioni ripetute.
Metodi Utilizzati
- Seleziona la lunghezza del percorso appropriata per la misurazione del campione.
- Misurazione del vuoto prima dell'analisi del campione.
- Pulizia automatizzata per prevenire il trascinamento tra campioni.
- Salvataggio dei dati in formato PDF o CSV per ulteriori analisi.
Risultati Principali
- Risultati altamente riproducibili per la quantificazione del DNA con una deviazione standard relativa dello 0,26%.
- La quantificazione delle proteine ha mostrato anche un'alta accuratezza con una deviazione standard relativa dello 0,51%.
- Misurazioni rapide e precise possono essere ottenute con il BioSpec-nano.
- Moltipli campioni possono essere analizzati rapidamente, migliorando il throughput.
Conclusioni
- Lo spettrofotometro BioSpec-nano fornisce una quantificazione affidabile sia per il dsDNA che per le proteine.
- Le funzionalità automatizzate migliorano significativamente l'efficienza della misurazione.
- Questo metodo è adatto per applicazioni ad alto throughput nella ricerca biologica.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate and reproducible quantification of nucleic acids and proteins is essential for target validation and assay development in early drug discovery. The BioSpec-nano micro-volume spectrophotometer enables high-throughput, low-sample-consumption measurements with automated sample handling, reducing variability and improving data reliability for lead identification workflows. Its rapid measurement cycle and low relative standard deviation support predictive confidence in downstream screening and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise quantification of nucleic acid and protein samples to support target expression analysis and pathway interrogation.
- Operational Value: Reduces sample consumption and manual handling steps, increasing throughput for hypothesis testing in discovery biology.
- Predictive Value: Low relative standard deviation (0.26% for DNA, 0.51% for protein) enhances confidence in quantitative data used for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible absorbance measurements (OD260-OD320 for DNA, OD280 for protein) suitable for assay standardization and reagent qualification.
- Operational Value: Automated wiping and blanking minimize carryover and ensure measurement consistency across plates or batches.
- Scalability: Three-second measurement time enables rapid screening of sample libraries or fractionation outputs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker quantification and pharmacokinetic sample analysis where low-volume, high-precision detection is required.
- Mechanistic De-risking: Accurate protein concentration data (via ε280 calculation from Trp, Tyr, Cys-S-S residues) enables correct dosing in functional assays.
- Workflow Integration: Outputs in PDF/CSV format facilitate data tracking and cross-functional sharing between discovery and preclinical teams.
Pipeline & Workflow Integration
The BioSpec-nano fits within the discovery continuum from initial target validation through assay development and into preclinical sample analysis, particularly where sample conservation and measurement reproducibility are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven quantification of nucleic acids (e.g., gene expression constructs) and proteins (e.g., purified targets, antibodies) for target validation.
- Screening: Enables QC of sample inputs and reaction outputs in biochemical or cell-based assays with minimal volume requirements.
- Analytics: Delivers quantitative OD-based readouts with automated pathlength correction and extinction coefficient calculation for proteins.
- Translational Research: Compatible with low-volume preclinical samples (e.g., plasma, tissue lysates) requiring accurate concentration normalization.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core lab resource for standardized quantitation across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves data quality and reproducibility in nucleic acid and protein quantitation, reducing false negatives/positives in early screening.
- Operational Value: Automation of sample contact, measurement, and cleaning reduces user variability and increases lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead optimization by providing reliable quantification for structure-activity relationship (SAR) studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted resource allocation by delivering trustworthy quantitative data for target prioritization.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with spectrophotometer principles and pathlength selection based on sample concentration.
- Needs access to a PC with BioSpec-nano software and periodic maintenance of optical surfaces.
- Benefits from standardized SOPs for blanking, wiping, and sample application to ensure cross-user consistency.
- Adaptable to various sample types (DNA, protein, other analytes) via software configuration and pathlength adjustment.
- Limited to absorbance-based quantification; not suitable for fluorescent or luminescent assays without additional instrumentation.
