Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus in risposta alla segnalazione Wnt

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare i cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine in seguito alla segnalazione mediata da fattori di crescita. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando blastomeri animali di embrioni precoci di Xenopus con RNA che codificano per diverse proteine fuse alla RFP e per il recettore di segnalazione FRIZZLED otto. Successivamente, vengono preparati impianti elettrodermici e/o sezioni crio di embrioni e sottoposti a immunoistochimica.

Infine, le cellule immunoistochimiche vengono analizzate mediante microscopio a fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come la localizzazione subcellulare di specifiche proteine dipenda dai percorsi di segnalazione embrionale. A titolo di esempio, dimostriamo che la proteina DIVERSA viene reclutata dal centrosoma alla membrana cellulare tramite il recettore FRIZZLED 8.

Questo metodo consente ai ricercatori di visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine di segnalazione in vivo utilizzando embrioni di Xenopus. Ciò può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo e nella biologia cellulare, come gli studi sulla regolazione spaziale della segnalazione e sui meccanismi di priorità cellulare. Per iniziare il processo di fecondazione in vitro, ottenere uova da rane femmine precedentemente iniettate con gonadotropina corionica umana.

12 ore prima dell'esperimento, aggiungere da 0,5 a un millilitro di soluzione di Ringer modificata 1 X Marx sulle uova e fecondarle in vitro con un piccolo pezzo di testicolo dissezionato. Dopo due o tre minuti, ridurre la concentrazione di sale con 0,1 XMMR per attivare la motilità degli spermatozoi. Incubare per 20 minuti.

Dopo la fecondazione, le uova si orientano con i poli animali verso l'alto. Rimuovere la guaina gelatinosa delle uova sostituendo la soluzione MMR con una soluzione al 3% di cisteina in acqua per cinque minuti. Lavare le uova tre volte con MMR 0,1 X.

Incubare a 13 gradi Celsius fino allo stadio da due a quattro cellule. Successivamente trasferire gli embrioni in 3%fi. Coltivare in 0,5 XMMR per microiniezione.

Sintetizzare gli RNA a partire da template di DNA linearizzato utilizzando il kit M message M machine e diluire con acqua priva di RNA fino a una concentrazione compresa tra 0,1 e 1 microgrammo per microlitro. Gli RNA per diversi in RFP, il marcatore della membrana GFP CX e FRIZZLED otto vengono utilizzati a una concentrazione compresa tra 0,1 e 1 nanogrammo per iniezione. Preparare gli aghi per iniezione a partire da tubi capillari utilizzando un estrattore di aghi e una mola affilatrice prima dell'iniezione.

Calibrare ogni ago con acqua per espellere 10 litri di liquido per iniezione. Posizionare gli embrioni sopra una piastra di plastica in una grande goccia di fial 3% 0,5 XMMR. Aspirare un microlitro di soluzione di RNA in un ago per iniezione mediante un microiniettore Shige a punta stretta.

Iniettare 10 nanolitri di RNA in ciascuno dei due blastomeri animali di embrioni a due cellule. Trasferire gli embrioni iniettati in una pozzetta di una piastra a 12 pozzette e incubare a 13 gradi Celsius fino al raggiungimento dello stadio gastrula precoce.

Trasferire gli embrioni allo stadio gastrula in una soluzione di 0,6 XMMR in una piastra di plastica da sei centimetri rivestita con aeros al 1%. Rimuovere manualmente la membrana vitellina con pinzette. Successivamente, utilizzare un ago di tsin e un anello di capello per escindere gli espanti di ectoderma dagli embrioni.

Fissarli in formaldeide al 3,7% in PBS per 30 minuti. Lavare l'esplan X tre volte per 10 minuti ciascuna in PBS. Per colorare i nuclei, aggiungere davi al terzo risciacquo.

Successivamente, montare l'esplanato X su un vetrino posizionandolo tra due strisce di nastro adesivo trasparente, con il lato interno non pigmentato dell'esplanato X rivolto verso l'obiettivo. Aggiungere due o tre gocce da 20 microlitri di soluzione di montaggio. Posizionare un coprioggetto sulla parte superiore.

Gli embrioni iniettati possono essere sottoposti a sezione criogenica per visualizzare la distribuzione delle proteine fluorescenti nella cellula e per effettuare una colorazione con anticorpi specifici. Allo stadio 10, fissare gli embrioni per uno o due ore a temperatura ambiente con un fissativo denso in un vial di vetro da quattro millilitri. Successivamente, dopo aver lavato in PBS, incorporare gli embrioni in una soluzione al 15% di gelatina di pesce e al 15% di saccarosio nello stesso vial.

Il giorno successivo, trasferire gli embrioni inclusi in uno stampo di plastica. Congelare rapidamente gli embrioni inclusi su ghiaccio secco. Quindi preparare sezioni crio utilizzando un criostato.

Eseguire la colorazione immunofluorescente sulle sezioni, montare i vetrini e acquisire immagini di embrioni in sezione trasversale utilizzando lo stesso metodo descritto per gli impianti di ectoderma. Acquisire le immagini mediante un microscopio fluorescente Zeiss Axio Plan con i filtri appropriati e aome per identificare e acquisire immagini di specifici piani Z all'interno dell'esplan X. In questa figura, ersin è localizzata al centrosoma nelle cellule ectodermiche, ma risulta traslocalizzata alla membrana cellulare.

In risposta alla Frizzled otto, cex GFP marca la membrana cellulare in verde. Diverse in RFP è in rosso e i nuclei marcati con DPI sono in blu. Diverse in RFP viene reclutato sulla membrana cellulare dalla Frizzled otto in sezioni crio di embrione.

La gamma tubulina è un marcatore centrosomale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dell'utilità degli embrioni e delle cellule embrionali XUS per lo studio dei processi di autorizzazione del docking delle proteine e di segnalazione a risoluzione subordinata.