Name: Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara a coltivare cellule epiteliali pigmentate dell'iride di tritone per studiare la rigenerazione del cristallino. Questo metodo mostra l'isolamento, la coltura in vitro e l'impianto per analizzare il potenziale rigenerativo.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione al NIH Ey10540 PAT.

1. Iris colture cellulari <ol><li> Raccogliere i bulbi oculari da 7 tritoni (anestetizzati nel 0,1% etilici degli acidi metano 3-amminobenzoato solfonico preparati in PBS) e il luogo di calcio magnesio libero Hanks soluzione (CMF). </li><li> Cambiare i guanti e il lavoro all'interno della cappa coltura di tessuti. </li><li> Sterilizzare le palle degli occhi in Lugol's-EtOH per 3 secondi. </li><li> Lavare 2 volte in CMF. </li><li> Trasferimento occhi Hanks e iniziare la dissezione. </li><li> Sezionare iride-cornea complesso e rimuovere retina neurale. </li><li> Trasferimento complessi in un nuovo piatto di Hanks. </li><li> Utilizzando # 15 bisturi, complessi separati in due parti dorsali e ventrali. </li><li> Rimuovere frammenti dell'iride (ventrale prima) e mettere in un piatto contenente 1 ml L-15. </li><li> Aggiungere il 15% (150 ul) volume di dispasi (7,5 unità / ml di concentrazione). </li><li> Incubare a 27 ° C per 2 ore (piatto avvolgere con parafilm). </li><li> Isolare le cellule IPE da stroma (tripsina Luogo soluzione a 27 ° C). </li><li> Raccogliere le cellule IPE in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare a 1000 rpm a temperatura ambiente (temperatura ambiente) per 2 minuti, rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare con 1 ml di Hanks e centrifugare a 1000 rpm a temperatura ambiente per 2 minuti, rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina; incubare per 2 ore a 27 ° C. </li><li> Centrifugare a 1000 rpm a temperatura ambiente per 2 minuti, togliere tripsina. </li><li> Aggiungere 1 ml L-15 da lavare, centrifugare a 1000 rpm per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 800 ul L-15, pipetta lentamente su e giù ~ 10 volte (più di 12 volte riduce l'aderenza). </li><li> Piastra le cellule IPE su un piatto ben 24 collagene rivestito e incubare a 27 ° C per 2 settimane (di solito, 4 dorsali e ventrali 4 pozzi sono ottenuti da 7 tritoni). </li><li> In questa fase le cellule sono adatti per la trasfezione genica e la terapia con i fattori per determinare il loro ruolo nell'indurre o interferire con la rigenerazione della lente. </li></ol> 2. L'aggregazione delle cellule Iris <ol><li> Per le piastre contenenti cellule dell'iride aggiungere 20μl di soluzione dispasi a 400 microlitri di media, agitare delicatamente. </li><li> Incubare le piastre a 27 ° C per il pernottamento. </li><li> Pipettare delicatamente su e giù per staccare le cellule </li><li> Cellule posto in provetta Eppendorf e centrifugare per 2 minuti a 1000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere medio e lavare con l'aggiunta di 1 ml completo L-15, spin 2 minuti a 1000 rpm a temperatura ambiente, rimuovere media. </li><li> 2000-7000 cellule per uso aggregato. Aggiungere 200 ul L-15 per aggregare in ciascuna provetta. </li><li> Celle divise (200 microlitri) in nuovi tubi eppendorf. </li><li> Rotazione a 1000 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare per 48 ore a 27 ° C. </li></ol> 3. L'impianto di cellule Aggregrated <ol><li> Praticare un'incisione nella cornea dell'occhio tritone e rimuovere la lente. </li><li> Dopo la rimozione dell'obiettivo, posto l'aggregato IPE cellula appena sotto il tessuto corneale sul lato ventrale dell'occhio. </li><li> I tritoni sono conservati per un mese per far loro rigenerare l'obiettivo. </li></ol> 4. Incorporare di Eye Newt <ol><li> Rimuovere gli occhi tritone impiantati con l'aggregato e collocarlo in tampone fosfato (PBS). </li><li> Fissare in paraformaldeide 4% a 4 ° C per almeno 4 ore o durante la notte. </li><li> Lavare in PBS, 4 ° C per 30 minuti. </li><li> Trattare con soluzione salina allo 0,85%: 4 ° C, 30 minuti. </li><li> Lavare a Saline / etanolo (1:1): RT per 15 minuti. </li><li> Lavare in etanolo al 70%: RT, 15 minuti. Ripetere una volta. </li><li> Lavare in 85% etanolo e 95% etanolo a temperatura ambiente, 30 minuti ciascuno </li><li> Lavare in etanolo al 100%: RT, 30 minuti. Ripetere una volta. </li><li> Conservare a 4 ° C o continuare. </li><li> Lavare in 100% xilene: RT, 30 minuti. Ripetere una volta. </li><li> Trattare con xilene / paraffina (1:1): 60 ° C, 45 minuti. </li><li> Trattare con il 100% paraffina: 60 ° C, 20 minuti. Ripetere altre due volte. </li><li> Incorpora in embedding stampi. </li></ol> 5. Sezionamento <ol><li> Preparare 15 sezioni micron dell'occhio incorporato usando un microtomo. </li><li> Posizionare le sezioni occhio su un vetrino ricoperto di gelatina e lasciare su un vetrino più caldo. </li></ol> 6. Colorazione <ol><li> Luogo diapositive in xilene per 10 minuti. Ripetere ancora una volta. </li><li> Idrato in: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% di etanolo per 1 minuto ogni </li><li> Sciacquare in acqua deionizzata per un minuto. </li><li> Lavare in PBS per 15 minuti. </li><li> Lavare in PBST (0,2% Triton X-100 in PBS) per 15 minuti. </li><li> Lavare in PBS per 15 minuti. </li><li> Posto nel bloccare soluzione (Anticorpi di capra 10% secondaria) per un'ora. </li><li> Luogo in anticorpo primario per il pernottamento. </li><li> Lavare l'anticorpo primario in PBS per 15 minuti. </li><li> Lavare in PBST per 15 minuti. </li><li> Lavare in PBS per 15 minuti. </li><li> Luogo in anticorpo secondario per 2 ore al buio (diluizione 1:100 in PBS). </li><li> Lavare in PBS, PBST, e PBS per 15 minuti ciascuna e quindi montare. </li><li> Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Questa procedura di coltura tritone irè cellule è stato utilizzato per studiare il potenziale di rigenerazione della dorsale e ventrale le cellule IPE. Inoltre, è anche possibile studiare specifici geni che contribuiscono al meccanismo di rigenerazione lente nell'occhio tritone. Quando le cellule sono state coltivate per 2 settimane (Figura 1) possono essere transfettate con geni di esaminare la loro funzione di rigenerazione lente. Di particolare interesse sono i geni che potrebbero indurre l'iride ventrale. Dal momento che le cellule ventrale dell'iride non può transdifferenziarsi di lente (Figura 2) la funzione induttiva di un gene candidato può essere studiato. In passato, con questa tecnica abbiamo dimostrato che quando sei-3 è stato sopra espresso in presenza di induzione lente acido retinoico è stato osservato dal ventrale iride 6. In figura 3 possiamo vedere che l'aggregato ventrale iride ha dato luogo a una lente completamente cresciuto e differenziata (punta di freccia), non diverso da quello l'obiettivo host dalla dorsale iride (freccia). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. a) dorsali iride cellule epiteliali pigmentate coltivati ​​in vitro per un periodo di 2 settimane. b) ventrale iride cellule epiteliali pigmentate coltivati ​​in vitro per un periodo di 2 settimane. Si noti che pigmentazione persiste a questa fase sia in dorsali e ventrali cellule dell'iride. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Capacità di rigenerazione delle colture di cellule IPE. a) induzione obiettivo da dorsale aggregato di cellule IPE (punta di freccia). Host induzione lente dalla dorsale iride (freccia), di: iris dorsale, vi: ventrale iris, le: epitelio lente, lf: le fibre lente. b) Assenza di induzione lente da ventrale aggregato di cellule IPE (punta di freccia). Host induzione lente dalla dorsale iride (freccia). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Induzione obiettivo da aggregato ventrale transfettate con sei-3 e trattati con acido retinoico. Host induzione lente dalla dorsale iride (freccia). Induzione obiettivo da aggregare ventrale (punta di freccia).

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo ha stabilito un sistema in vitro per studiare meccanismi di rigenerazione lente tritoni. Dal momento che gli aggregati (sia dorsale o ventrale seguire fedelmente il loro comportamento in vivo durante la rigenerazione questa tecnica può alleviare l&#39;enorme sforzo richiesto per transgenesi in tritoni e può essere utilizzato per guadagno di funzione così come la perdita di esperimenti funzione 7,8,9. Anche , gli aggregati o l&#39;iride nel suo complesso può essere facilmente trattati con fattori di crescita e di esaminare i loro effetti come descritto in questo protocollo. Ad esempio il ruolo di BMP percorso è stato studiato con questa tecnica 6.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di Lugol&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Acido metanosolfonico etil 3-aminobenzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 1:250</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNasi 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di canamicina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (soluzione di anfotericina B)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 24 pozzetti rivestita con collagene</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento iris a studio rigenerazione lens newt

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Come salamandre e tritoni axolotl possedere la capacità di rigenerare molte delle sue parti del corpo perse, come gli arti, la coda con il midollo spinale, occhio, cervello, cuore, la mascella 1. In particolare, tritoni sono unici per la sua capacità lente rigenerazione. Al momento la rimozione della lente, le cellule IPE della dorsale iride transdifferenziarsi alle cellule lente ed eventualmente formare un nuovo obiettivo in circa un mese 2,3. Questa proprietà di rigenerazione non è mai esibito dalle cellule ventrale iride. Il potenziale di rigenerazione delle cellule dell&#39;iride può essere studiato facendo trapianti di cellule coltivate in vitro IPE. Per la cultura, le cellule dorsali e ventrali dell&#39;iride vengono prima isolati dall&#39;occhio e coltivate separatamente per un periodo di 2 settimane (Figura 1). Queste cellule in coltura sono riaggregate e trapiantate a occhio tritone. Studi precedenti hanno mostrato che il reaggregate dorsale mantiene la sua capacità di formare lente, mentre l&#39;aggregato ventrale non forma una lente, ricapitolando, quindi il processo in vivo (Figura 2) 4,5. Questo sistema di determinazione del potenziale di rigenerazione dorsale e ventrale cellule dell&#39;iride è molto utile per studiare il ruolo dei geni e delle proteine ​​coinvolte nella rigenerazione lente.

In tritone, la lente rigenera sempre da l&#39;iride dorsale da transdifferenziazione delle cellule epiteliali pigmentate dell&#39;iride (IPES). Qui si descrive una procedura per le cellule tritone cultura dorsale e ventrale IPE e il loro impianto per l&#39;occhio tritone. Le cellule impiantate sono poi studiati da sezionare tessuti e immunoistochimica.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Le salamandre, come il tritone e l'axolotl, possiedono la capacità di rigenerare molte delle parti corporee perse, tra cui gli arti, la coda con il midollo spinale, l'occhio, il cervello...

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule dell'epitelio pigmentato dell'iride per studiare la rigenerazione del cristallino in Tritone. Questo viene ottenuto anestetizzando innanzitutto un tritone in una soluzione anestetica e rimuovendo gli occhi.Il secondo passaggio della procedura consiste nell'isolare le cellule epiteliali pigmentate dell'iride dal tessuto oculare rimuovendo prima il tessuto retinico, seguito dal taglio dei frammenti di iride corneale in metà dorsale e ventrale. Le cellule dell'iride vengono quindi separate dallo stroma e coltivate in vitro per due settimane. Dopo due settimane di Turing, le cellule IPE vengono aggregate e successivamente impiantate in un nuovo ospite che è stato lin optimiz.Dopo un mese di guarigione, l'istologia rivela il potenziale rigenerativo del cristallino da parte delle cellule dell'epitelio pigmentato dell'iride (IPE) dorsali e ventrali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale nei passaggi di coltura cellulare e di impianto, difficili da apprendere poiché richiedono un'ampia serie di competenze nella microdissezione e nei interventi chirurgici. Iniziare anestetizzando almeno sette topi nudi con etil 3-amminobenzoato solfato di metanolo allo 0,1%, quindi rimuovere chirurgicamente gli occhi utilizzando pinzette e forbici chirurgiche, tagliando la palpebra insieme alla congiuntiva. Successivamente, recidere il nervo ottico.Ora trasferire rapidamente gli occhi dissecati in una cappa e sterilizzarli nell'etanolo di Lugo per tre secondi. Successivamente lavare gli occhi due volte in soluzione di Hank priva di calcio e magnesio. Trasferirli in Hank fresco e procedere con la dissezione.Utilizzando un bisturi, praticare una fessura nell'occhio. Successivamente, usare le forbici per tagliare lungo il margine corneale. Rimuovere il cristallino e asportare il tessuto retinale residuo insieme alla sclera.Trasferire i complessi iride-cornea in una piastra, utilizzando un bisturi numero 15, in una soluzione di Hank's fresca. Separare i complessi nelle loro metà dorsale e ventrale. Le iridi dorsale e ventrale vengono identificate dalla presenza di macchie nere sulla sclera del lato dorsale e da un'incisione a forma di V sull'iride ventrale.Separare l'iride ventrale dall'iride dorsale. Raccogliere i frammenti di iride in una piastra da 35 millimetri contenente un millilitro di soluzione L 15. Mantenere le metà dorsale e ventrale in piastre separate.Ora aggiungere 150 microlitri di soluzione dispa alle piastre e incubare per due ore a 27 gradi Celsius. Per raccogliere le cellule IPE dallo stroma. Con l'aiuto di pinzette, staccare delicatamente le cellule IPE da tutti i frammenti di tessuto raccolti.Successivamente, trasferire le cellule IPE in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 1000 RP M per due minuti a temperatura ambiente, quindi eliminare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet in un millilitro di soluzione di Hanks e ripetere la centrifugazione per separare le cellule. Eliminare la soluzione di Hanks e ri-sospendere il pellet.In un millilitro di una soluzione di tripsina 1:250, incubare per due ore a 27 gradi Celsius; lavare le cellule mediante centrifugazione ed eliminare la tripsina. Aggiungere un millilitro di soluzione L 15 e centrifugare nuovamente; ripetere il lavaggio una volta ancora e sostituire con 800 microlitri di soluzione L 15 fresca, quindi risospendere delicatamente le cellule in soluzione. Piastrare ora le cellule in piastre a 24 pozzetti rivestite con collagene.Il rendimento tipico di sette N è di quattro pozzetti di cellule dorsali e quattro pozzetti di cellule ventrali. Incubare la piastra per due settimane a 27 gradi Celsius dopo due settimane. Come mostrato qui, l'IPE può essere trasfettato con geni per esaminarne la funzione nella rigenerazione del cristallino.Questa coltura di cellule IPE ventrali di due settimane mostra la stessa morfologia delle cellule dorsali. Si noti che la pigmentazione persiste a questo stadio sia nelle cellule dell'iride dorsali che in quelle ventrali. Prima di impiantare le cellule IPE, è necessario aggregarle aggiungendo 20 microlitri di dyse in 400 microlitri di mezzo di coltura fresco alle cellule, agitando delicatamente la piastra e lasciando le cellule in incubazione tutta la notte a 27 gradi Celsius.Il giorno successivo, utilizzare una pipettatura delicata per staccare le cellule, quindi trasferirle in provette da 1,5 millilitro; lavare ora le cellule centrifugando le provette e sostituendo il soprannatante con un millilitro di L 15. Ripetere questo passaggio due volte. Utilizzare 10 microlitri della sospensione cellulare per calcolare il numero di cellule mediante metodi standard.Dopo il calcolo, preparare da 3000 a 5000 cellule in 200 microlitri di L 15 per aggregato. Centrifugare ora le cellule e incubarle per 48 ore. A 27 gradi Celsius, le cellule possono ora essere impiantate in un animale ricevente.Iniziare anestetizzando un adulto nuovo nella soluzione anestetica fino a quando non smette di muoversi. Ora utilizzare una lama di bisturi per praticare un'incisione nella cornea dell'occhio. Quindi, usando una pinzetta, rimuovere il cristallino.Dopo aver rimosso la lente, posizionare l'aggregato di cellule IPE appena al di sotto del tessuto corneale sul lato ventrale dell'occhio. A questo punto, restituire la salamandra a un contenitore separato e lasciarla guarire. Durante questo periodo, maneggiare la salamandra con cura per evitare di danneggiare il tessuto in fase di guarigione.Alle cellule trapiantate occorre un mese per rigenerarsi in una nuova lente. Trascorso un mese, rimuovere i nuovi occhi impiantati con le cellule aggregate e fissare il tessuto. Utilizzando un protocollo standard di disidratazione, il campione fissato può essere incluso in stampi adatti al taglio di sezioni da 15 micrometri, quindi tagliate e colorate in modo appropriato.Dopo l'impianto dell'aggregato nel nuovo occhio lentamente, l'aggregato derivato dalle cellule IPE dorsali induce la formazione di una nuova lente. L'induzione della lente dell'ospite da parte dell'iride dorsale è osservata anche nell'occhio con l'impianto ventrale. Nessuna induzione della lente è osservata a partire dall'aggregato preparato dalle cellule IPE ventrali; tuttavia, quando il gene six three è sovraespresso in presenza di acido retinoico, l'induzione della lente è osservata dall'aggregato ventrale.Inoltre, si osserva l'induzione della lente ospite dall'iride dorsale dell'occhio dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione della lente per esplorare il ruolo di diversi geni nel nuovo settore.

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