Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt
22 giugno 2011
In tritone, la lente rigenera sempre da l'iride dorsale da transdifferenziazione delle cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPES). Qui si descrive una procedura per le cellule tritone cultura dorsale e ventrale IPE e il loro impianto per l'occhio tritone. Le cellule impiantate sono poi studiati da sezionare tessuti e immunoistochimica.
L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare cellule dell'epitelio pigmentato dell'iride per studiare la rigenerazione del cristallino in Tritone. Questo viene ottenuto anestetizzando innanzitutto un tritone in una soluzione anestetica e rimuovendo gli occhi.
Il secondo passaggio della procedura consiste nell'isolare le cellule epiteliali pigmentate dell'iride dal tessuto oculare rimuovendo prima il tessuto retinico, seguito dal taglio dei frammenti di iride corneale in metà dorsale e ventrale. Le cellule dell'iride vengono quindi separate dallo stroma e coltivate in vitro per due settimane. Dopo due settimane di Turing, le cellule IPE vengono aggregate e successivamente impiantate in un nuovo ospite che è stato lin optimiz.
Dopo un mese di guarigione, l'istologia rivela il potenziale rigenerativo del cristallino da parte delle cellule dell'epitelio pigmentato dell'iride (IPE) dorsali e ventrali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale nei passaggi di coltura cellulare e di impianto, difficili da apprendere poiché richiedono un'ampia serie di competenze nella microdissezione e nei interventi chirurgici. Iniziare anestetizzando almeno sette topi nudi con etil 3-amminobenzoato solfato di metanolo allo 0,1%, quindi rimuovere chirurgicamente gli occhi utilizzando pinzette e forbici chirurgiche, tagliando la palpebra insieme alla congiuntiva. Successivamente, recidere il nervo ottico.
Ora trasferire rapidamente gli occhi dissecati in una cappa e sterilizzarli nell'etanolo di Lugo per tre secondi. Successivamente lavare gli occhi due volte in soluzione di Hank priva di calcio e magnesio. Trasferirli in Hank fresco e procedere con la dissezione.
Utilizzando un bisturi, praticare una fessura nell'occhio. Successivamente, usare le forbici per tagliare lungo il margine corneale. Rimuovere il cristallino e asportare il tessuto retinale residuo insieme alla sclera.
Trasferire i complessi iride-cornea in una piastra, utilizzando un bisturi numero 15, in una soluzione di Hank's fresca. Separare i complessi nelle loro metà dorsale e ventrale. Le iridi dorsale e ventrale vengono identificate dalla presenza di macchie nere sulla sclera del lato dorsale e da un'incisione a forma di V sull'iride ventrale.
Separare l'iride ventrale dall'iride dorsale. Raccogliere i frammenti di iride in una piastra da 35 millimetri contenente un millilitro di soluzione L 15. Mantenere le metà dorsale e ventrale in piastre separate.
Ora aggiungere 150 microlitri di soluzione dispa alle piastre e incubare per due ore a 27 gradi Celsius. Per raccogliere le cellule IPE dallo stroma. Con l'aiuto di pinzette, staccare delicatamente le cellule IPE da tutti i frammenti di tessuto raccolti.
Successivamente, trasferire le cellule IPE in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 1000 RP M per due minuti a temperatura ambiente, quindi eliminare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet in un millilitro di soluzione di Hanks e ripetere la centrifugazione per separare le cellule. Eliminare la soluzione di Hanks e ri-sospendere il pellet.
In un millilitro di una soluzione di tripsina 1:250, incubare per due ore a 27 gradi Celsius; lavare le cellule mediante centrifugazione ed eliminare la tripsina. Aggiungere un millilitro di soluzione L 15 e centrifugare nuovamente; ripetere il lavaggio una volta ancora e sostituire con 800 microlitri di soluzione L 15 fresca, quindi risospendere delicatamente le cellule in soluzione. Piastrare ora le cellule in piastre a 24 pozzetti rivestite con collagene.
Il rendimento tipico di sette N è di quattro pozzetti di cellule dorsali e quattro pozzetti di cellule ventrali. Incubare la piastra per due settimane a 27 gradi Celsius dopo due settimane. Come mostrato qui, l'IPE può essere trasfettato con geni per esaminarne la funzione nella rigenerazione del cristallino.
Questa coltura di cellule IPE ventrali di due settimane mostra la stessa morfologia delle cellule dorsali. Si noti che la pigmentazione persiste a questo stadio sia nelle cellule dell'iride dorsali che in quelle ventrali. Prima di impiantare le cellule IPE, è necessario aggregarle aggiungendo 20 microlitri di dyse in 400 microlitri di mezzo di coltura fresco alle cellule, agitando delicatamente la piastra e lasciando le cellule in incubazione tutta la notte a 27 gradi Celsius.
Il giorno successivo, utilizzare una pipettatura delicata per staccare le cellule, quindi trasferirle in provette da 1,5 millilitro; lavare ora le cellule centrifugando le provette e sostituendo il soprannatante con un millilitro di L 15. Ripetere questo passaggio due volte. Utilizzare 10 microlitri della sospensione cellulare per calcolare il numero di cellule mediante metodi standard.
Dopo il calcolo, preparare da 3000 a 5000 cellule in 200 microlitri di L 15 per aggregato. Centrifugare ora le cellule e incubarle per 48 ore. A 27 gradi Celsius, le cellule possono ora essere impiantate in un animale ricevente.
Iniziare anestetizzando un adulto nuovo nella soluzione anestetica fino a quando non smette di muoversi. Ora utilizzare una lama di bisturi per praticare un'incisione nella cornea dell'occhio. Quindi, usando una pinzetta, rimuovere il cristallino.
Dopo aver rimosso la lente, posizionare l'aggregato di cellule IPE appena al di sotto del tessuto corneale sul lato ventrale dell'occhio. A questo punto, restituire la salamandra a un contenitore separato e lasciarla guarire. Durante questo periodo, maneggiare la salamandra con cura per evitare di danneggiare il tessuto in fase di guarigione.
Alle cellule trapiantate occorre un mese per rigenerarsi in una nuova lente. Trascorso un mese, rimuovere i nuovi occhi impiantati con le cellule aggregate e fissare il tessuto. Utilizzando un protocollo standard di disidratazione, il campione fissato può essere incluso in stampi adatti al taglio di sezioni da 15 micrometri, quindi tagliate e colorate in modo appropriato.
Dopo l'impianto dell'aggregato nel nuovo occhio lentamente, l'aggregato derivato dalle cellule IPE dorsali induce la formazione di una nuova lente. L'induzione della lente dell'ospite da parte dell'iride dorsale è osservata anche nell'occhio con l'impianto ventrale. Nessuna induzione della lente è osservata a partire dall'aggregato preparato dalle cellule IPE ventrali; tuttavia, quando il gene six three è sovraespresso in presenza di acido retinoico, l'induzione della lente è osservata dall'aggregato ventrale.
Inoltre, si osserva l'induzione della lente ospite dall'iride dorsale dell'occhio dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione della lente per esplorare il ruolo di diversi geni nel nuovo settore.
Panoramica
Questo studio descrive un metodo per la coltura di cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPEs) da tritone per indagare la rigenerazione del cristallino. La procedura prevede l'isolamento e l'impianto di queste cellule nell'occhio del tritone, seguiti da un'analisi istologica per valutare la formazione del cristallino.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Rigenerativa
- Tecniche di Coltura Cellulare
Sfondo
- Le salamandre possiedono la capacità di rigenerare cristallini a partire da cellule dell'iride dorsale.
- Le cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPE) svolgono un ruolo fondamentale in questo processo di rigenerazione.
- Comprendere i meccanismi della rigenerazione del cristallino può fornire spunti importanti per la medicina rigenerativa.
- Studi precedenti hanno dimostrato il potenziale delle IPE nella formazione del cristallino.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la coltura di IPE dorsali e ventrali provenienti da tritoni.
- Studiare le capacità rigenerative del cristallino di queste cellule coltivate.
- Fornire una dimostrazione visiva delle tecniche di coltura cellulare e di impianto.
Metodi Utilizzati
- Anestesia e rimozione chirurgica degli occhi di tritone.
- Isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato dell'iride (IPE) da frammenti dell'iride dorsale e ventrale.
- Coltura in vitro delle cellule IPE per due settimane.
- Trapianto di cellule IPE aggregate negli occhi riceventi del tritone.
Risultati principali
- L'analisi istologica ha rivelato una rigenerazione riuscita del cristallino da innesti di IPE dorsali.
- Nessuna induzione del cristallino è stata osservata a partire da cellule IPE ventrali, a meno che geni specifici non fossero sovraespressi.
- Lo studio ha dimostrato l'importanza delle IPE dorsali nella formazione del cristallino.
- Le cellule IPE transfezionate hanno mantenuto la loro morfologia e pigmentazione durante la coltura.
Conclusioni
- Il metodo stabilito è efficace per lo studio della rigenerazione del cristallino nelle salamandre.
- Ulteriori ricerche possono esplorare i fattori genetici che influenzano la rigenerazione del cristallino.
- Questa tecnica potrebbe contribuire alla comprensione dei processi rigenerativi in altre specie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi di rigenerazione del cristallino fornendo un sistema in vitro riproducibile per analizzare la funzione delle cellule epiteliali pigmentate dell'iride dorsale rispetto a quelle ventrali. Supporta la validazione degli obiettivi in biologia rigenerativa isolando le variabili che regolano la capacità di transdifferenziazione. Il sistema offre un valore predittivo per la selezione di bersagli genetici e molecolari nei percorsi di scoperta preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche testando la capacità di formazione del cristallino di cellule IPE dorsali e ventrali coltivate.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante saggi di rearreaggregazione e impianto che riproducono il potenziale rigenerativo in vivo.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando quali manipolazioni genetiche ripristinano la funzione rigenerativa negli aggregati di cellule IPE ventrali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce aggregati di IPE standardizzati adatti per lo screening di composti o genetico in un sistema rilevante per la malattia.
- Output quantitativo: Consente la misurazione dell'induzione del cristallino come lettura funzionale dopo l'innesto e la guarigione.
- Scalabilità: Supporta piastre multipozzetto e flussi di lavoro di aggregazione per il test parallelo di condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella un processo rigenerativo con una chiara polarità dorso-ventrale, offrendo spunti sui segnali posizionali coinvolti nella riparazione dei tessuti.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in colture in vitro a quelli in vivo mediante la validazione istologica della formazione del cristallino.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce il contributo specifico dei geni alla rigenerazione, come il ruolo di six3 e dell'acido retinoico nella riprogrammazione dell'epitelio pigmentato dell'iride ventrale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la validazione basata su ipotesi di bersagli rigenerativi prima di impegnarsi nell'ottimizzazione del capostazione o negli studi di efficacia preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi isolando le cellule IPE per verificare il potenziale di transdifferenziazione in condizioni controllate.
- Screening: Fornisce aggregati quantitativi e riproducibili per valutare modificatori genetici o farmacologici della rigenerazione del cristallino.
- Analisi: Genera endpoint istologici che permettono il confronto della capacità rigenerativa tra diversi gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi in vitro al ripristino dei tessuti in vivo, supportando decisioni di avanzamento con valutazione del rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio dei meccanismi di rigenerazione in diverse perturbazioni genetiche o ambientali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla plasticità delle cellule dell'iride e riduce l'ambiguità nella validazione degli obiettivi per la rigenerazione.
- Valore operativo: Offre procedure standardizzate e scalabili di coltura cellulare e impianto, con tempi definiti di due settimane di coltura e un mese di guarigione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione confermando se gli interventi molecolari ripristinano la funzione rigenerativa in tipi cellulari non permissivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla loro capacità di indurre la formazione del cristallino in aggregati di IPE ventrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia, dissezione dei tessuti e manipolazione sterile delle cellule per l'isolamento e l'aggregazione dell'iride.
- È dipendente da piastre rivestite con collagene, mezzo L15, tripsina e reagenti di dissociazione per ottenere un rendimento costante di cellule dell'epitelio dell'iride (IPE).
- Necessita di protocolli standardizzati di aggregazione che prevedano l'uso di colorante e di incubazione controllata per garantire la formazione riproducibile di pellet.
- Richiede competenze nelle procedure istologiche e nel taglio dei campioni per valutare i risultati della rigenerazione del cristallino a un mese dal trapianto.
- È limitato dalla disponibilità di esemplari di tritone e dalla difficoltà tecnica di separare l'iride in regione dorsale e ventrale in base ai reperti anatomici.
