Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Lo scopo di questo esperimento è generare tessuto 3D come gli steroidi. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule coltivate e quindi generando una singola sospensione cellulare. Le gocce successive della sospensione cellulare, vengono depositate sul lato inferiore del coperchio capovolto da un piatto di coltura tissutale.

Quindi il coperchio viene capovolto sulla camera di idratazione. Il passaggio finale consiste nell'incubare le gocce sospese per 24-48 ore per consentire la formazione degli aggregati. Questi possono quindi essere trasferiti in un bagno d'acqua agitato e incubati per un massimo di altri cinque giorni.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano differenze nella coesione aggregata o nell'ordinamento cellulare attraverso saggi di compattazione, simmetria della superficie tissutale 10 o microscopia a epifluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coltura tissutale 2D convenzionale, ad esempio, è che le cellule cresciute in 3D imitano più da vicino le interazioni cellulari sperimentate dalle cellule in un ambiente tissutale. Dimostrerò questo metodo per mostrarti che è così semplice che anche un PI può farlo.

Per iniziare questo esperimento, raccogliere le cellule di aderenza al 90% di fluenza. Per prima cosa, aspirare il terreno di coltura e sciacquare due volte il foglio cellulare con PBS. Quindi aspirare il PBS e pipettare due millilitri di viaggi allo 0,05% in soluzione di EDTA sullo strato monostrato.

Posizionare la piastra nell'incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e incubare fino a quando le cellule non si staccano. Quindi, rimuovere la piastra dall'incubatrice e interrompere l'accensione. Aggiungendo due millilitri di terreno completo.

Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per tritrare la miscela fino a quando le cellule non sono completamente in sospensione. Quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Pipettare 40 microlitri di una soluzione di DNA da 10 milligrammi per millilitro nella sospensione cellulare e incubarla a temperatura ambiente per cinque minuti dopo l'incubazione.

Agitare brevemente la sospensione cellulare e poi centrifugare a 200 volte la gravità per cinque minuti. Una volta completata la centrifugazione, aspirare il surnatante S e scartarlo, quindi risospendere la tavolozza in un millilitro di terreno completo per lavare. Ripetere la centrifugazione e ripescare dal pellet in un millilitro di terreno completo.

Successivamente, eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Regolare la sospensione cellulare con il terreno a una concentrazione finale di 2,5 volte 10 per le sei cellule per millilitro. Quindi procedere alla formazione di gocce pendenti.

Preparare una camera di idratazione rimuovendo il coperchio da una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri e pipettando cinque millilitri di PBS sul fondo della capsula. Capovolgere il coperchio della piastra e pipettare fino a 2010 microlitri di gocce di sospensione cellulare sul lato inferiore del coperchio. Assicurarsi che le gocce siano sufficientemente distanti in modo da non toccarsi.

Riposizionare delicatamente il coperchio contenente le gocce di coltura sul fondo del piatto contenente PBS. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture tissutali. Impostare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità e incubare durante la notte.

Monitorare quotidianamente le gocce e continuare l'incubazione fino a quando non si sono formati fogli cellulari o aggregati. Una volta formati i fogli cellulari o gli aggregati, trasferirli in palloni di vetro a fondo rotondo contenenti tre millilitri di terreno completo. Incubare i matracci contenenti i fogli cellulari o gli aggregati in un bagno d'acqua agitante.

Mantenuto a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per circa 24 ore fino a quando la formazione di steroidi può essere visualizzata al microscopio da dissezione. Una volta che gli steroidi sono stati formati, l'effetto delle manipolazioni sperimentali sulla formazione di steroidi può essere quantificato secondo la procedura delineata nel protocollo scritto. Inoltre, l'intercalazione della membrana di tutti i coloranti fluorescenti precedentemente inclusi può ora essere visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Questa immagine al microscopio in campo chiaro dimostra l'aggregazione delle cellule MLL del cancro alla prostata di ratto dopo 18 ore di incubazione utilizzando il metodo della goccia sospesa. Questa immagine mostra un secondo aggregato di cellule MLL formato dopo 18 ore di coltura utilizzando il metodo della goccia sospesa. Queste cellule sono state coltivate in presenza di 25 micromolari dell'inibitore MEK PD 9, 8, 0, 5, 9, risultando in un aggregato di cellule sostanzialmente più compatto.

Qui, viene dimostrata la differenza tra la coltura di gocce sospese di MLL trattata con inibitore MEK, la dimensione dell'aggregato e la dimensione dell'aggregato di controllo non trattato. L'asterisco rappresenta una differenza statisticamente significativa di P inferiore a 0,0001. Come determinato dagli studenti T-test tra aggregati non trattati e trattati con inibitori MEK e suggerisce che il trattamento con inibitori MEK si traduce in aggregati significativamente più piccoli e più compatti.

Questa immagine è stata catturata utilizzando uno stereomicroscopio Nikon Smz 800 e illustra uno steroide formato dall'incubazione di cellule epatiche embrionali di pollo in coltura a goccia sospesa per 18 ore. Poi a 37 gradi Celsius agitando bagnomaria per 48 ore. Questa immagine al microscopio confocale dimostra il comportamento di selezione che si verifica quando alcune popolazioni cellulari vengono co-coltivate utilizzando il metodo della goccia sospesa prima di procedere alla coltura a goccia sospesa, le cellule epatiche embrionali di pollo sono state colorate con pkh a due membrane e l'embrione di pollo.

Le cellule cardiache sono state colorate con PKH 26. Le sospensioni cellulari sono state quindi mescolate e appese a goccia. La coltura è stata eseguita per 18 ore, seguita da 48 ore di incubazione nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Si può vedere dalla sezione ottica che le cellule cardiache colorate di giallo sono avvolte da cellule epatiche. Qui si tratta di due nardi e cloni di cellule L trasfettate che esprimono NCA sulla loro superficie. Con un rapporto di 2,4 a uno, sono stati colorati con la membrana fluorescente in coloranti di fascicolazione, PKH due e PK KH 26 mescolati in proporzioni uguali e coltivati come gocce pendenti come prima.

In questo esempio, le celle che esprimono cadian di fascia alta, che sono pseudo colorate di verde, sono avvolte da quelle che esprimono livelli più bassi di en cadiano, che sono pseudo colorate di rosso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti o meno se eseguita correttamente.