Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali per lo studio traumatica lesione cerebrale

L'obiettivo generale di questa procedura è somministrare e osservare una pressurizzazione impulsiva di cellule cerebrali coltivate per lo studio del trauma cerebrale. Questo viene realizzato innanzitutto inducendo la differenziazione neuronale di cellule coltivate mediante acido retinoico. Successivamente, le cellule neuronali vengono posizionate nel dispositivo di pressurizzazione cellulare basato sul ksky bar ed esposte a una pressione impulsiva di intensità e durata rilevanti per il trauma cerebrale indotto da esplosione.

Infine, le cellule vengono sottoposte a saggi di biologia molecolare per valutare i danni cellulari e i possibili meccanismi di lesione cerebrale traumatica. I risultati dell'ispezione al microscopio mostrano morte cellulare neuronale e perdita strutturale degli assoni neuritici in seguito a pressurizzazione impulsiva di due megapascal di intensità e durata di 0,7 millisecondi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la percussione fluidica, è l'assenza di fasi di pressione negativa e un controllo preciso della durata temporale.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trauma cranico (TBI), come la soglia di morte cellulare neuronale o di lesione in funzione della pressione impulsiva, dell'ampiezza, della durata e della forma del carico. Sebbene finora questo metodo sia stato utilizzato nel nostro gruppo per studiare il TBI indotto da esplosione, può essere applicato anche ad altri tipi di trauma cranico, come il TBI indotto da impatto. La procedura sarà dimostrata da Matthew, uno studente laureato del laboratorio della Professoressa Chen fang, e da li ha, un tecnico del mio laboratorio.

Questo esperimento utilizza un set Ksky configurato come apparecchio per la pressurizzazione cellulare. L'apparecchio è costituito da due barre in lega di alluminio lunghe sei metri, sospese mediante cuscinetti in ottone allineati, con una camera per la pressurizzazione cellulare in vitro. Posta tra le barre, la camera per la pressurizzazione cellulare è composta da un cilindro a pistone.

Il cilindro presenta un piccolo foro filettato alla base della cavità, che durante l'installazione del campione cellulare permette lo sfiato dell'aria e del liquido in eccesso. Il pistone è realizzato con lo stesso tubo della barra ed è avvolto con due o tre strati di nastro in teflon. Il tappo terminale fissa le lamelle di vetro con due piccole viti in acciaio inossidabile.

Questa dimostrazione utilizza cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Tuttavia, il protocollo è applicabile a molte colture di modelli cellulari. Le cellule vengono seminate su coprivetri di 18 millimetri di diametro a una densità di 3000 cellule per centimetro quadrato.

In DMEM supplementato, durante l'incubazione le cellule vengono indotte a differenziarsi aggiungendo all'ambiente di coltura acido retinoico a 10 micromolari per sette giorni, con cambio del mezzo ogni due giorni. Nel settimo giorno, le cellule mostrano una ben sviluppata struttura assonale dei neuriti ed sono pronte per essere sottoposte a pressione. Sterilizzare tutte le parti della camera di pressurizzazione mediante autoclave e conservarle sotto luce UV durante l'assemblaggio della camera.

In una cappa colturale, assicurarsi che la vite di ventilazione nella camera sia avvitata in modo lento al foro di aerazione. Alla base della cavità, riempire la camera con mezzo di crescita appena preparato e tiepido. Quindi avvitare un vetrino colturale in vetro sul coperchio del pistone, con le cellule rivolte verso l'esterno, e inserire con attenzione il pistone all'interno della cavità della camera.

Rimuovere la vite di sfiato, inclinare lo sfiato verso l'alto e spingere il pistone nella camera fino a una linea di riferimento precedentemente determinata. Ciò lascia circa sei millimetri di profondità del liquido all'interno della camera di pressurizzazione della cella. Evitare di introdurre bolle d'aria, sanificare la vite di sfiato e reinserirla per rendere la camera stagna all'acqua.

La camera non deve presentare perdite sotto il carico statico. Reimpostare il sistema della barra Ksky. Riportare la massa pesante alla sua posizione originale e sostituire il bullone di bloccaggio.

Il bullone di bloccaggio esercita una forza di serraggio che impedisce il movimento del barra incidente finché i perni non vengono spezzati. Innestare il nuovo bullone di bloccaggio con il martinetto idraulico fino a circa 200 PS.I utilizzare il martinetto a forbice per comprimere la sezione di precarico della barra incidente a una pressione leggermente superiore al valore desiderato, quindi allentarla per innestare completamente l'attrito della vite JAK. A questo punto impostare l'acquisizione dati poiché la pressurizzazione avviene in circa un millisecondo.

Impostare una frequenza di campionamento di un megahertz utilizzando estensimetri da 2000 ohm in un circuito a ponte di Wheatstone. La tensione deve essere impostata a 45 volt sulla barra trasmessa. Montare la camera della cella con il pistone rivolto verso la barra trasmessa.

Posizionare la camera cellulare in un blocco a V sostenuto dal cavalletto per forbici da laboratorio e allineato con le due barre. Ungere leggermente ogni interfaccia ed eliminare qualsiasi aria tra le superfici in contatto strofinandole delicatamente insieme. Ora il sistema è pronto.

Armare l'acquisizione dei dati ed eseguire il test pompando rapidamente il dispositivo idraulico della pinza. Questo provoca la rottura del bullone di bloccaggio, determinando la separazione della pinza e la trasmissione di un'onda di pressione alle cellule. Dopo il test, rimuovere la lamella dalla camera in una cappa da coltura e procedere con la valutazione del comportamento cellulare.

Con esperienza, l'apparato può essere utilizzato per pressurizzare circa nove vetrini con colture cellulari all'ora. Durante l'analisi del segnale, all'inizio del tracciato trasmesso possono comparire errori dovuti a bolle d'aria, tuttavia in questa dimostrazione non sono presenti.

Se la barra di trasmissione è sufficientemente lunga, i dati più importanti dovrebbero iniziare con la prima perturbazione e terminare dove le misurazioni mostrano una pressione negativa; questa lettura di tensione è proporzionale allo sforzo subito dalle cellule mediante l'analisi con estensimetri. La durata dell'impulso trasmesso può essere più breve rispetto all'impulso incidente. Se una piccola bolla è intrappolata nel fluido all'interno della camera di pressurizzazione delle cellule, l'ampiezza dell'impulso trasmesso potrebbe non superare quella dell'impulso incidente, ma dovrebbe presentare un plateau sufficientemente lungo prima dello scarico.

In caso contrario, o viene intrappolata una grande bolla d'aria nella camera sigillata oppure l'assemblaggio e la barra sono malallineati. Dopo la pressurizzazione, le cellule possono essere esaminate immediatamente oppure ulteriormente incubate per analisi successive. Confrontare le cellule pressurizzate con le cellule di controllo della camera, trattate in modo identico ma non sottoposte a pressurizzazione, per valutare le variazioni nella lunghezza dei neuriti mediante microscopia ottica in diversi punti temporali successivi all'incubazione.

La colorazione immunofluorescente dell'actina può essere utilizzata per valutare i cambiamenti del citoscheletro. Inoltre, l'anticorpo per la proteina associata ai microtubuli due, MAP due, può essere impiegato per visualizzare le modifiche in uno dei principali marcatori neuronali.

Per valutare l'effetto della pressurizzazione impulsiva sull'espressione genica neuronale e apoptotica, utilizzare se necessario tecniche standard di biologia molecolare come la R-T-P-C-R. È possibile raccogliere lisati cellulari sufficienti per l'immunoblotting da diversi campioni cellulari sottoposti a pressione identica. In questo esempio, il profilo di pressurizzazione, ottenuto mediante l'apparato ksky bar, ha applicato con successo una singola pressione impulsiva di livello pari a due megapascal con una durata di circa 0,7 millisecondi alle cellule neuronali in coltura, come mostrato nelle immagini al microscopio ottico. Le cellule neuronali umane SHSY5Y, sottoposte a pressione impulsiva di due megapascal, mostrano un evidente deterioramento dei neuriti e degli assoni rispetto alle cellule di controllo non depressurate.

Quando si esegue questa procedura, è sempre necessario tenere la camera di pressurizzazione del fluido in questo modo e mai in quest'altro, poiché ciò sottoporrebbe le cellule a una pressione negativa dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare il meccanismo cellulare del trauma cranico in condizioni controllate di pressurizzazione prostatica. Ringraziamo il centro dell'esercito UNL per la meccanica del trauma per il supporto finanziario.