Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la microscopia fotoacustica ad alta risoluzione ottica, o OR-PAM, della microcircolazione, che è non invasiva e non richiede l'uso di marcatori. Questo risultato si ottiene anestetizzando innanzitutto l'animale sperimentale. Il secondo passaggio della procedura consiste nel posizionare la regione di interesse traslando la testa di imaging del microscopio fotoacustico ad alta risoluzione ottica; successivamente vengono impostati i parametri di scansione e avviata l'acquisizione delle immagini.

Alla fine, le distribuzioni della concentrazione totale di ossigeno e della saturazione dell'emoglobina con ossigeno si ottengono calcolando i dati sperimentali a più lunghezze d'onda. La microscopia fotoacustica ad alta risoluzione ottica si basa sull'eccitazione laser e sulla rilevazione ultrasonica. Un breve fascio laser post è focalizzato nel tessuto biologico.

L'assorbimento della luce genera un riscaldamento transitorio e successiva emissione di ultrasuoni, che viene ricevuta per formare un'immagine. Il vantaggio unico di, o Pam, è la rilevazione senza contatto e la straordinaria sensibilità all'assorbimento ottico. Al contrario, le tecnologie esistenti di microscopia a riflessione, non ottica, sono principalmente sensibili allo scattering ottico o alla fluorescenza, ed è in grado di fornire un imaging in vivo, senza etichette e ad alta risoluzione dell'assorbimento ottico; RPM ha trovato ampie applicazioni biomediche in neurologia, oftalmologia, biologia vascolare e dermatologia.

La microscopia fotoacustica a risoluzione ottica, o PAMM, comprende componenti sia ottici che ultrasonici. La sorgente di irradiazione ottica è un laser a colorante pompato da un laser a impulsi a stato solido. Il fascio laser in uscita viene attenuato da un filtro neutro e accoppiato in una fibra ottica monomodale per la consegna della luce, consentendo la scansione meccanica della testa di imaging del microscopio anziché dell'oggetto vivente, al fine di accoppiare efficacemente il fascio laser multimodale in una fibra ottica monomodale.

Viene dapprima filtrato attraverso un foro di diametro di 50 micrometri. Il foro è posizionato leggermente al di fuori del fuoco della lente condensatrice in modo da far corrispondere il suo diametro al diametro del fascio in modalità fondamentale. Per creare un fuoco ottico quasi limitato dalla diffrazione, l'uscita della fibra in modalità singola viene collimata e riempie l'apertura posteriore di un obiettivo del microscopio.

Il rilevamento ultrasonico prevede l'uso di un combinatore acusto-ottico autocostruito collegato a un trasduttore ultrasonico. Il combinatore allinea in modo coassiale l'irradiazione ottica e il rilevamento acustico. Una cavità sferica è ricavata nella parte inferiore del combinatore per produrre una lente acustica con un'apertura numerica di 0,5 in acqua, che fornisce un diametro focale acustico di 43 micrometri alla frequenza centrale di 50 megahertz.

Per il primo allineamento, è utile utilizzare l'ultrasuono a eco di impulso per determinare la posizione del piano focale acustico. La testa di imaging viene regolata verticalmente finché non si osserva il segnale ultrasonico a eco di impulso massimo. Per massimizzare la sensibilità di rilevamento, si allineano i fuochi ottico e acustico. Confocale.

Un bersaglio assorbente alla luce, come un pezzo di nastro isolante nero, viene posizionato nel piano focale acustico. Successivamente, la posizione focale ottica viene regolata per massimizzare il segnale fotoacustico. Il sistema PAM include inoltre amplificatori elettronici e convertitore analogico-digitale, uno scanner meccanico e un controllore dello scanner.

Il segnale digitalizzato viene trasferito a un computer per la formazione dell'immagine. Il software converte i dati grezzi in una sequenza di immagini bcan cross-sectional. Mentre la testa del microscopio esegue una scansione raster dell'oggetto, le immagini registrate possono quindi essere visualizzate come immagini cross-sectional singole, immagini di proiezione dell'ampiezza massima 2D o ricostruzioni 3D.

Un serbatoio d'acqua viene utilizzato per alloggiare la testa di imaging del microscopio. Una finestra di imaging viene ricavata in una piastra di Petri e sigillata con una membrana di polietilene trasparente all'ultrasonico e all'ottico. L'onda fotoacustica generata dall'oggetto viene accoppiata acusticamente al rivelatore ultrasonico prima tramite gel ultrasonico posto tra l'oggetto e la membrana di polietilene, e successivamente tramite acqua deionizzata contenuta nella piastra di Petri.

Queste invenzioni e applicazioni di laser a ottica disponibili e del trasduttore a ultrasuoni costituiscono il sistema PAM. Nel prossimo segmento, acquisiremo un'immagine della microvascolatura di un topo vivente mediante questo sistema. Se l'animale da sottoporre a imaging non è un topo nudo, 24 ore prima dell'esperimento è ideale rimuovere il pelo.

Pertanto, l'irritazione della vascolarizzazione cutanea viene recuperata. Anestetizzare il topo con vapore di isoflurano al 3% in ossigeno di grado medico. La portata tipica è compresa tra uno e 1,5 litri al minuto.

In base al peso corporeo dell'animale. Mantenere l'anestesia con fluoruro di isoflurano al 1% per tutta la durata dell'esperimento; eseguire una compressione del dito del piede per accertarsi che il topo sia completamente anestetizzato. Trasferire il topo su un supporto stereotassico dotato di un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius.

Appiattire ora l'orecchio sulla piastra di plastica. Applicare quindi uno strato di gel ecografico sulla superficie dell'orecchio. Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno del gel.

Applicare anche un unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione o danni accidentali da laser. Evitare di toccare direttamente l'occhio con l'applicatore. Quindi posizionare l'orecchio sotto la finestra di imaging e sollevare lentamente la piattaforma dell'animale fino a quando il gel ecografico non entra in contatto con la parte inferiore della membrana.

È necessario un contatto delicato perché premere l'orecchio contro la membrana potrebbe alterare il flusso sanguigno nell'orecchio. Successivamente, adottare alcune precauzioni con l'animale per monitorarne lo stato fisiologico. Applicare un ossimetro di pulso alla zampa o alla coda del topo.

Ora abbassare la testa di imaging fino a quando la lente acustica non sarà immersa in acqua deionizzata e rimuovere le bolle intrappolate sotto la lente acustica. Impostare il laser sulla modalità di trigger esterno e iniziare la scansione di prova. Regolare la posizione Z della testa di imaging fino a quando i fuochi ottico e acustico non saranno posizionati al centro dell'orecchio.

Ora impostare i parametri di scansione e avviare formalmente l'acquisizione delle immagini. Per misurare la concentrazione totale di emoglobina, impostare la lunghezza d'onda su un punto ISO spastico in cui ossiemoglobina e deossiemoglobina presentano coefficienti molari di estinzione uguali.

Per misurare la saturazione emoglobinica dell'ossigeno, impostare la seconda lunghezza d'onda nel punto in cui i coefficienti di estinzione molare dell'ossiemoglobina e della deossiemoglobina presentano una differenza marcata. Al termine, pulire l'orecchio del mouse e posizionare l'animale in un incubatrice. Con la temperatura ambientale impostata a 37 gradi Celsius, una volta che si sarà svegliato, riportare il mouse in modo naturale presso la struttura per animali.

Questa immagine di proiezione dell'ampiezza massima mostra l'anatomia vascolare dell'orecchio di un topo nudo vivo, acquisita mediante or Pam a 570 nanometri. Questa immagine di proiezione mostra la saturazione emoglobinica di ossigeno nello stesso orecchio. È calcolata a partire dalle immagini acquisite a una lunghezza d'onda isosbestica di 570 nanometri e a una lunghezza d'onda dominante per l'assorbimento della deossiemoglobina di 561 nanometri.

Un'analisi più approfondita della regione evidenziata mostra la risoluzione dell'ORAMM. È chiaramente risolta una rete capillare densamente compatta. In questo video, abbiamo illustrato il protocollo sperimentale tipico per l'ORPM, inclusa la configurazione del sistema, l'allineamento del sistema, la procedura sperimentale in vivo e lo schema di imaging funzionale.

Uno degli aspetti più importanti nella progettazione e nell'uso dello strumento è l'allineamento confocale ottico-acustico, che è cruciale per la sensibilità di imaging e la risoluzione ottica. La microscopia fotoacustica, in combinazione con la microscopia fotoacustica a risoluzione acustica con elevata penetrazione e la tomografia fotoacustica computerizzata, permette imaging funzionale e molecolare in vivo su diverse scale, dalle unghie degli organi, alle cellule, ai tessuti, fino a organi interi, tutti con lo stesso contrasto. L'origine di questa scalabilità nell'imaging offre il potenziale per rivoluzionare la ricerca nei sistemi biologici multiscala e nella traduzione dei risultati, dal livello microscopico delle scoperte di laboratorio a quello macroscopico della pratica clinica.