Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare in vivo la microscopia fotoacustica a risoluzione ottica o, o Pam, del microcircolo che non è invasiva e priva di marcature. Ciò si ottiene anestetizzando prima l'animale da esperimento. Il secondo passo della procedura consiste nel posizionare la regione di interesse traslando la testa di imaging del microscopio fotoacustico a risoluzione ottica, quindi vengono impostati i parametri di scansione e viene avviata l'acquisizione dell'immagine.

In definitiva, le distribuzioni della concentrazione totale di ossigeno e della saturazione di ossigeno dell'emoglobina sono ottenute attraverso il calcolo dei dati sperimentali a più lunghezze d'onda. La microscopia fotoacustica a risoluzione ottica si basa sull'eccitazione laser e sul rilevamento ultrasonico. Un raggio laser a post corto viene focalizzato nel tessuto biologico.

L'assorbimento della luce genera un riscaldamento transitorio e la successiva emissione di ultrasuoni, che viene ricevuta per formare un'immagine. Il vantaggio unico di, o Pam, è il suo rilevamento senza terra e la squisita sensibilità all'assorbimento ottico. Al contrario, le tecnologie di microscopia ottica esistenti a riflessione, non a quelle ottiche, sono principalmente sensibili alla diffusione ottica o alla fluorescenza In grado di fornire immagini ad alta risoluzione senza etichetta in vavo di assorbimento ottico o RPM ha trovato ampie applicazioni biomediche in neurologia, oftalmologia, biologia vascolare e dermatologia.

La microscopia fotoacustica a risoluzione ottica, o pamm, è costituita da componenti ottici e ultrasonici. La sorgente di irradiazione ottica è un laser a colorante pompato da un laser a impulsi a stato solido. Il raggio laser in uscita è attenuato da un filtro a densità neutra e accoppiato in una fibra ottica monomodale per l'erogazione della luce per consentire la scansione meccanica della testa di imaging del microscopio piuttosto che dell'oggetto vivente per accoppiare efficacemente il raggio laser multimodale in una fibra ottica monomodale.

Viene prima filtrato da un foro stenopoico di 50 micrometri di diametro. Il foro stenopeico è posizionato leggermente lontano dal fuoco della lente del condensatore per far corrispondere il suo diametro con il diametro del fascio modale fondamentale. Per creare una messa a fuoco ottica quasi limitata alla diffrazione, l'uscita della fibra monomodale viene fascicolata e riempie l'apertura posteriore di un microscopio. Obiettivo.

Il rilevamento a ultrasuoni coinvolge un combinatore di fasci ottici acustici fatto in casa collegato a un trasduttore a ultrasuoni. Il combinatore allinea coassialmente l'irradiazione ottica e il rilevamento acustico. Una cavità sferica viene rettificata nella parte inferiore del combinatore per produrre una lente acustica con un'apertura numerica di 0,5 in acqua, che fornisce un diametro focale acustico di 43 micrometri alla frequenza centrale di 50 megahertz.

Per il primo allineamento, è utile utilizzare gli ultrasuoni a eco pulsata per determinare la posizione del piano focale acustico. La testina di imaging viene regolata verticalmente fino a quando non si osserva il segnale ultrasonico dell'eco dell'impulso massimo. Per massimizzare la sensibilità di rilevamento, i fuochi ottici e acustici sono allineati. Confocale.

Un bersaglio otticamente assorbente, come un pezzo di nastro isolante nero, viene posizionato nel piano focale acustico. Quindi la posizione focale ottica viene regolata per massimizzare il segnale fotoacustico. Il sistema PAM comprende anche amplificatori elettronici e convertitore analogico digitale, uno scanner meccanico e un controller per scanner.

Il segnale digitalizzato viene trasferito a un computer per la formazione dell'immagine. Il software converte i dati grezzi in una sequenza di immagini bcan in sezione trasversale. Mentre la testa del microscopio esegue la scansione raster dell'oggetto, le immagini registrate possono essere visualizzate come singole immagini in sezione trasversale, immagini di proiezione 2D di ampiezza massima o rendering 3D.

Un serbatoio dell'acqua viene utilizzato per alloggiare la testa di imaging del microscopio. Una finestra di imaging viene tagliata in una piastra di Petri e sigillata con una membrana di polietilene trasparente a ultrasuoni e otticamente. L'onda fotoacustica generata dall'oggetto è accoppiata acusticamente al rivelatore a ultrasuoni prima dal gel ultrasonico tra l'oggetto e la membrana di polietilene, e poi dall'acqua deionizzata nella capsula di Petri.

Queste invenzioni e applicazioni dei laser ottici disponibili e del trasduttore a ultrasuoni costituiscono il sistema OR PAM. Nel prossimo segmento, immagineremo la microvascolarizzazione di un topo vivente con questo sistema. Se l'animale che viene ripreso non è un topo nudo, 24 ore prima dell'esperimento, è l'ideale per dete.

Quindi l'irritazione del sistema vascolare cutaneo viene recuperata. Anestetizzato il topo con fluoro ISO al 3% vaporizzato in ossigeno di grado medico. La portata tipica è compresa tra uno e 1,5 litri al minuto.

A seconda del peso corporeo dell'animale. Mantenere l'anestesia con fluoro ISO all'1% Durante l'esperimento, eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato. Trasferisci il mouse in un tavolino stereotassico con un termoforo per mantenere la sua temperatura corporea a 37 gradi Celsius.

Ora appiattisci l'orecchio sulla piastra di plastica. Quindi applicare uno strato di gel per ultrasuoni sulla parte superiore dell'orecchio. Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno del gel.

Applicare anche un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza o danni accidentali al laser. Evitare di toccare l'occhio direttamente con l'applicatore. Quindi posizionare l'orecchio sotto la finestra di imaging e sollevare lentamente lo stadio dell'animale fino a quando il gel per ultrasuoni non tocca il fondo della membrana.

Il contatto morbido è necessario perché la pressione dell'orecchio contro la membrana può influire sul flusso sanguigno nell'orecchio. Successivamente, prendi alcune precauzioni con l'animale per monitorare il suo stato fisiologico. Fissare un pulsossimetro al mouse, alla gamba o alla coda.

Abbassare ora la testina di imaging fino a quando la lente acustica non è immersa in acqua deionizzata e rimuovere le bolle intrappolate sotto la lente acustica. Impostare il laser sulla modalità di trigger esterno e avviare la scansione di prova. Regolare la posizione Z della testina di imaging fino a quando i doppi fuochi ottici e acustici non si trovano al centro dell'orecchio.

Ora imposta i parametri di scansione e avvia l'acquisizione formale dell'immagine. Per misurare la concentrazione totale di emoglobina. Impostare la lunghezza d'onda su un punto spastico ISO in cui l'ossiemoglobina e la deossiemoglobina hanno coefficienti di estinzione molare uguali.

Per misurare la saturazione di ossigeno dell'emoglobina, impostare la seconda lunghezza d'onda in cui i coefficienti di estinzione molare dell'ossiemoglobina e della deossiemoglobina hanno una differenza pronunciata. Al termine, pulisci l'orecchio del mouse e posiziona il mouse in un'incubatrice. Con la temperatura ambientale impostata a 37 gradi Celsius, quando si sveglia, riporta naturalmente il topo nella struttura per animali.

Questa immagine di proiezione di massima ampiezza mostra l'anatomia vascolare di un orecchio di topo nudo vivente ripreso utilizzando o Pam a 570 nanometri. Questa immagine di proiezione mostra la saturazione di ossigeno dell'emoglobina nello stesso orecchio. Viene calcolato dalle immagini acquisite a una lunghezza d'onda spastica ISO di 570 nanometri e una lunghezza d'onda dominante di assorbimento della deossiemoglobina di 561 nanometri.

Uno sguardo più attento alla regione riquadrata mostra la risoluzione di oramm. Un letto capillare densamente compattato è chiaramente risolto. In questo video, abbiamo dimostrato il tipico protocollo sperimentale per ORPM, inclusa la configurazione del sistema, la procedura sperimentale di allineamento del sistema in vivo e lo schema di imaging funzionale.

Uno degli aspetti più importanti nella progettazione e nel funzionamento dello strumento è l'allineamento confocale ottico acustico, che è fondamentale per la sensibilità dell'imaging, la microscopia fotoacustica a risoluzione ottica in combinazione con la microscopia fotoacustica a risoluzione acustica profonda e la tomografia computerizzata fotoacustica promette in vivo, imaging funzionale e molecolare e scale terminali multiple, unghie d'organo, cellule, tessuti, e fino agli organi possono essere riprodotti con lo stesso contrasto. L'origine, come la scalabilità dell'imaging, ha il potenziale per rivoluzionare la ricerca nei sistemi multiscala, nella biologia e nella traduzione. Dalle scoperte microscopiche di laboratorio alla pratica clinica macroscopica.