Name: Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Scopri l'assay di bioluminescenza del calcio per analizzare le relazioni struttura-attività dei neuropeptidi degli artropodi sui recettori GPCR di Aedes aegypti e Rhipicephalus microplus. Questo metodo supporta la scoperta di farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson presso l&#39;Università di Copenaghen (Danimarca) sono apprezzati per fornire le aequorina plasmide. Il nostro collaboratore, il dottor Ronald J. Nachman da USDA-ARS (TX, USA), è riconosciuto per la sintesi di peptidi e per fornire il lettore di piastre Novostar.

1. Creazione di linee cellulari stabili <ol><li> Clonare il vostro GPCR di interesse e inserirlo in un vettore di espressione che incorpora un 5 'sequenza consenso Kozak (AMCC / GCCATGG) intorno al codone di inizio per la ottimale legame ribosomiale in un sistema di mammifero (Kozak, 1986). Qui usiamo il pcDNA3.1/Bm-KR plasmide per il recettore zecca chinina, e il plasmide pcDNA3.1/Aedae-KR per il recettore zanzara chinina (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. Il pcDNA3.1 (-) vettore codifica resistenza all'ampicillina per la selezione di batteri e neomicina (G418) resistenza per la selezione in cellule di mammifero. </li><li> Crescere CHO-K1 celle vuote (senza plasmidi) (ATCC, Manassas, VA, USA) o altri linea cellulare desiderato in un T-25 pallone (BD Falcon) a 37 ° C in un 5% di CO 2 umidificata incubatore (Holmes et al ., 2003). Tutte le incubazioni più dovrebbe essere fatto in queste condizioni se non diversamente specificato. Mantenere le celle vuote nel mezzo di crescita (media F12K con il 10% di siero fetale bovino) con 1X antibiotici Antimicotici (Invitrogen, CA). </li><li> Per dividere le celle, riscaldare tutte le soluzioni a 37 ° C. Rimuovere vecchi media nel T-25 pallone e lavare con 5 ml di PBS e quindi rimuovere PBS. Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml di PBS-tripsina-EDTA (34 ml di PBS, 2 ml di bicarbonato di sodio 7,5%, 4 ml 10X tripsina-EDTA) per 2 min. Aggiungere 3 ml di mezzo e aspirare media su e giù per miscelare cellule. Trasferimento di media con le cellule in una provetta conica e centrifugare per 2 min a ~ 200-300 g (1.000 rpm). Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di mezzo. Diluire le cellule risospese ad una concentrazione di 1:5 o 1:10 con terreno fresco e trasferire 5 ml in una nuova T-25 pallone. </li><li> Dopo che le cellule crescono sani (circa 2-3 giorni), il seme CHO-K1 cellule in fiasche tessuto T-25 cultura e farle crescere durante la notte nel mezzo di crescita senza antibiotici fino a circa il 30% confluenti (circa 18 ore). Il grado di confluenza può essere determinato dalle cellule sotto osservazione invertita microscopia a fluorescenza. </li><li> Preparare le miscele seguenti per ogni campione: <ol><li> Combina 1-2 DNA mcg (esempio: 4μl uso di 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) con 100 l Opti-MEM ho ridotto Media siero (Invitrogen). </li><li> Mix 6 Reattivo microlitri Lipofectin (InvitrogenTM) in 100 l di media F12K siero libero, facendo un rapporto 1:1 di Lipofectin al DNA. Incubare a temperatura ambiente per 30-45 min. </li></ol> Mescolare delicatamente le soluzioni da 1.5.1 a 1.5.2 in una goccia a goccia moda (volume totale = 200 mL). Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10-15 min. </li><li> Rimuovere il supporto di vecchia crescita dalle cellule e lavare le cellule con 5 ml di mezzo F12K siero libero e poi rimuovere il supporto di F12K siero libero. In un tubo da 15 ml, mescolare delicatamente la miscela di trasfezione in 1,8 ml di medium F12K fresco in un goccia a goccia moda. Allora, lavate le cellule dal punto 1.5 con PBS e aggiungere questa nuova soluzione di trasfezione per le cellule. Incubare per 18 ore. </li><li> Modificare il medio F12K medio più il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici e incubare una notte. Dividere le celle in due T-25 palloni di media F12K più il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici per altre 18 ore (per la divisione delle celle si prega di vedere il punto 1.3). </li><li> Sostituire la media con terreno selettivo (media F12K più 10% di siero fetale bovino con 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Coltura le cellule utilizzando il terreno selettivo per 3-4 settimane. Nel corso del tempo questo selezionerà per le cellule che hanno incorporato il plasmide stabilmente nel loro DNA genomico. Continuare a mantenere le cellule utilizzando terreno di mantenimento (media F12K più 10% di siero fetale bovino con 400μg/ml GENETICIN). Periodicamente congelare linee cellulari con rapporto 1:1 dei supporti di congelamento (terreno selettivo con il 20% DMSO) per evitare che perde in caso di contaminazione inattese. </li><li> Selezione clonale linee cellulari: in una prima fase, trypsinize e centrifugare le cellule a partire dal punto 1.8 con terreno di mantenimento come al punto 1.3. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzo di manutenzione, prendere 0,5 ml della cellula sospendere e aggiungere 4,5 ml di terreno di mantenimento fresca per fare una diluizione 10x. Trasferire la diluizione 10x in 12 pozzetti di una piastra 96 ​​pozzetti, aggiungendo 100 l in ciascun pozzetto di selezionare per le singole cellule. </li><li> Continuare a fare 10x diluizioni seriali di queste cellule per una sospensione teorica finale di una cella per 100 l (di solito la diluizione finale sarà nel range di 10 -11 e 10 -19; il numero totale di 10x diluizioni seriali è ~ 19) . Subito dopo ogni diluizione, trasferire 100 ul della diluizione in 12 pozzetti della piastra 96 ​​pozzetti. Dopo 18 ore di incubazione, osservare Piastre a 96 pozzetti sotto una luce invertito o pozzi microscopio a fluorescenza e marchio che sembrano contenere solo una singola cella o contenere due celle che, ovviamente, divisi da una sola cellula. Mantenere l'osservanza di ogni giorno e medie cambiano ogni tre giorni. </li><li> Quando i pozzi sono 80% confluENT (circa una settimana), lavare i pozzi contrassegnati con 200 l di PBS e trypsinize con 100 l di PBS-tripsina-EDTA soluzione. Cellule trasferimento da ciascuno segnato anche in un pozzetto di un 6-pozzetti con 1 ml di mezzo di manutenzione. Crescere queste cellule per 3 giorni poi trasferire le cellule in singoli T25 pallone. Test di queste cellule mediante il test bioluminescenza calcio con peptidi agonisti (vedere la sezione 2). </li><li> Selezionare 1 linea cellulare da 1,11 passo con la più alta risposta al saggio di bioluminescenza piatto di calcio e di eseguire per la seconda volta la singola cellula seguenti passaggi selezione 1,9-1,11. Periodicamente congelare linee cellulari. </li><li> Dalla selezione secondario descritto al punto 1.12, scegliere 2-3 linee cellulari con la più alta risposta nel saggio piatto calcio bioluminescenza e mantenerli in coltura per ulteriori test calcio bioluminescenza piatto. Tenere traccia dei numeri passaggio. Di tanto in tanto, congelare linee cellulari da primi passaggi in modo che si può sempre tornare indietro a loro se le linee cellulari con più passaggi fermare l'esecuzione in modo coerente. </li></ol> 2. Il calcio bioluminescenza saggio piatto <ol><li> Legare il gene reporter di interesse in un vettore di espressione. Qui abbiamo usato mtAEQ/pcDNA1 plasmide aequorina (un dono di Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson, Università di Copenhagen, Danimarca). Trasformare il plasmide in E. coli MC1061/PS (Invitrogen) e purificare usando un QIAprep giro miniprep kit (Qiagen Inc.). Nella fase finale eluire il plasmide con Tris buffer senza EDTA, non l'acqua. </li><li> Crescono linee cellulari a partire dal punto che esprimono il recettore 1,13 desiderato in terreno di mantenimento. Quando le cellule sono il 90% confluenti, trypsinize, centrifuga e poi ri-sospendere le cellule in 5 ml di terreno di mantenimento come al punto 1.3. Diluire le cellule (circa 10x con terreno di mantenimento) e contare il numero di cellule con cellule contatore (Bright-line emocitometro) al microscopio. Regolare il numero di cellulare di circa 2 x 10 5 cellule / ml (media 20 celle in uno dei 9 quadrati mostrato nel emocitometro). Seed 2 celle ml diluito in media in ciascun pozzetto di una piastra ben sei. Incubare per 24 ore (le cellule dovrebbe raggiungere circa il 60% dopo la confluenza di incubazione). </li><li> Cambiare supporto nella piastra 6 pozzi a OPTI-MEM medium. Per ogni bene, mescolare 96 microlitri OPTI-MEM con 4 microlitri FuGENE 6 reagente Transfection (Biochemicals Roche) in una provetta per microcentrifuga e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 mg di aequorina / pcDNA 1 DNA plasmidico in ciascuna provetta e poi delicatamente agitare il campione per 1 min, incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Aggiungi ciascuna miscela in ciascun pozzetto in modo goccia a goccia, mentre scuotendo leggermente la piastra bene. Incubare le piastre per 6 ore e mezzo per cambiare il F12K terreno contenente 10% di siero fetale bovino senza antibiotico. </li><li> Dopo aver incubato le cellule in sei pozzetti per 24 ore, trypsinize, centrifuga e risospendere le cellule come punto 1.3. Contare il numero di cellulare a 400.000 cellule / ml come passo 2.1 e trasferire 100 ul (totale 40.000 cells/100 microlitri) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo bianco sottile microtitolazione (Costar 3610). Incubare per altre 24 ore fino a circa l'80% confluenza delle cellule. Questa è la concentrazione ottimale di cellule per l'analisi bioluminescenza. </li><li> Preparare 90μl/well di un calcio senza mezzi DMEM (Invitrogen) contenente 5 coelenterazine mM (Invitrogen) al buio (coelenterazine è sensibile alla luce). Prendete il piatto da 2,4, rimuovere i supporti vecchi e aggiungere questo 90μl in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 3 ore al buio a 37 ° C e 5% di CO 2, dopo che le cellule nella piastra sono pronti per essere testati. </li></ol> 3. Strumento funzionamento e l'analisi dei dati <ol><li> Ogni lettore di piastre bioluminescenza è diverso. Realizziamo i nostri test con un (Labtechnologies BMG) lettore di piastre Novostar in modalità bioluminensence. Se si utilizza uno strumento diverso, è necessario adattare il protocollo. </li><li> Purge le pompe piastra lettore (o POMPE PRIME) prima dell'uso. Spegnere la luce nella stanza prima di mettere la piastra sul portatarga. Una volta che il portatarga ha chiuso, accendere le luci. </li><li> Solubilizzare peptidi (in un tubo Eppendorf da 1,5 ml) nel calcio senza mezzi DMEM. Impostare la "Profondità Aspirare" e "Determinazione di posizione" della soluzione di peptide prima dell'uso. Sfida le cellule con 10 microlitri (10x) di concentrazioni variabili dei peptidi (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, o altro peptide desiderato) e immediatamente iniziare a registrare l'emissione luminosa. Abbiamo impostato lo strumento per registrare l'emissione di luce (465 nm) per ogni bene ogni 2 secondi per un tempo totale di 50 secondi. </li><li> Assicurati di includere un controllo positivo, come un attivo analogico (analogico FFFSWGa è stato utilizzato, Taneja-Bageshwar et al., 2009) e un controllo negativo come le cellule trasfettate solo vettore. Il controllo negativo sarà necessario durante l'analisi dei dati per impostare la soglia di riferimento (vedi risultati rappresentativi).Un estraneo, peptide inattivo può anche essere aggiunto come controllo negativo. </li><li> Dopo la corsa è terminata, lavare la pompa strumento (o POMPE PRIME) e poi inserire il vostro campione successivo peptide. Salvare i dati e lavare le pompe di nuovo. </li><li> Il trattamento dei dati: Trasferire i dati di emissione di luce da ogni bene in un foglio dati di Microsoft Excel. </li><li> Incollare i dati da Excel a software Prism 4.0 da GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). Le concentrazioni di peptide vari è l'asse X e unità bioluminescenza è l'asse Y. Per normalizzare i dati, la trama di un registro curva di risposta. Selezionare una curva di analisi di regressione lineare in forma (sigmoidale dose-risposta equazione con pendenza variabile) per ottenere curve concentrazione-risposta per ciascun peptide. Il programma traccia i valori, alla fine, e dà la CE 50. </li><li> Ogni esperimento deve essere ripetuto tre volte per l'analisi dei dati. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Quando espressa in cellule CHO-K1, la zanzara Aedes aegypti recettore chinina si è comportato come un recettore multiligand e funzionalmente risposto a concentrazioni fino a 1 nM del endogenours tre Aedes chinine, Aedae chinine 1-3, testato singolarmente usando la bioluminescenza saggio di calcio piastra . La Figura 1 mostra che l'ordine rango di potenza è stato ottenuto Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, sulla base dei rispettivi valori di EC 50 Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM e Aedae-K-1, 48,85 nM, che sono state differenze statisticamente significative (P &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). Abbiamo anche usato questo test per determinare quali residui di chinina sono fondamentali per la chinina peptide-recettore. Insetti peptidi chinina condividere un C-terminale pentapeptide che rappresenta la sequenza di minimi necessari per l'attività biologica, noto anche come nucleo. Nella tabella 1, la chinina analoghi nucleo peptidi sono stati sintetizzati come una serie sostituzione Alanina della chinina nucleo pentapeptide FFSWGa e testato da un test piastra di calcio bioluminescenza (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Abbiamo scoperto che gli aminoacidi Phe Trp 1 e 4 sono stati essenziali per l'attività delle chinine insetti per entrambi i recettori. Il test può anche essere utilizzato per testare peptidi progettato per biostabilità migliorata. La tabella 2 mostra gli analoghi progettato chinina contenenti aminoacidi isobutirrico (Aib), testato sul recettore tick ricombinante chinine e la Figura 2 mostra il confronto l'attività di sei alfa-amino acido isobutirrico analoghi sul recettore chinina tick esprimere CHO-K1 linea cellulare da un calcio bioluminescenza saggio piastra (Taneja-Bageshwar et al., 2009). Il esapeptide analogico FFFSWGa è aggiunto per un controllo positivo per l'attività del recettore. L'analogo FF [Aib] WGA portato più attivi di questo controllo analogico esapeptide. L'analogo con due sostituzioni acido aminoisobutyric, [Aib] FF [Aib] WGA, è stato il più potente della doppia sostituzione analoghi testate (Tabella 2 e Figura 2). Per ulteriori esempi di come questo saggio è stata e può essere applicato vedere Nachman e Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), e Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Stima di Aedes chinine concentrazione efficace (CE 50) su cellule CHO-K1 E10 da un calcio-bioluminescenza saggio piatto. L'asse y nel curve concentrazione-risposta è stato ottenuto da unità di bioluminescenza, espressa in percentuale della risposta massima osservata per ogni peptide. Punti dati rappresentano la media di sei repliche ottenute nel corso di tre esperimenti indipendenti. Barre rappresentano l'errore standard. (A) Stima della Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Stima del Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Stima del Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1, p &lt;0,05. Analisi statistiche e grafici sono stati con il software Prism GraphPad 4.0. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Confronto l'attività di sei alfa-amino acido isobutirrico analoghi sul recettore tick kinin esprimere CHO-K1 linea cellulare da un saggio di piatto calcio bioluminescenza. L'asse y rappresenta la massima unità di bioluminescenza per cento per ogni analogico espressa in percentuale di bioluminescenza osservato una concentrazione rispetto alla risposta massima osservata tra tutte le concentrazioni testate per ciascun analogico. Analisi statistiche e grafici sono stati eseguiti con il software Prism GraphPad 4.0. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick ​​linea cellulare del recettore </td><td colspan="2"> Mosquito recettore linea cellulare </td></tr><td> Peptidi </td><td> CE 50 (nM) </td><td> Bioluminescenza risposta massima di 1 mm </td><td> CE 50 (nM) </td><td> Bioluminescenza risposta massima di 1 mm </td><tr><td> AFSWGa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Potenze stimato (CE 50) e la risposta bioluminescenza massima di tutti i peptidi testati su zecche e zanzare linee cellulari transfettate recettore *. * L'EC 50 stime la concentrazione necessaria per indurre una mezza massima risposta. I: inattivo se la risposta bioluminescenza è inferiore a 300 unità (livello del vettore solo cellule transfettate). R: La posizione in cui il residuo corrispondente nella FFSWGa peptide è stato sostituito da alanina. ND: L'analogico è stato testato, ma era o non era molto attivo o non attivo a basse molarità, quindi un EC50 non può essere determinato. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib-Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Chinina analoghi (K) che contiene aminoacidi isobutirrico (Aib), testato sul recettore tick ricombinante chinina. Ac: acetil; α me: α metil-fenilalanina; β3F: β3-fenilalanina, un: ammide.

<ol><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li>
<li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNachman%2C+R+%22Neuropeptide+systems+as+Targets+for+Parasite+and+Pest+Control%22">Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control</a>. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).</li>
<li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biostable+agonists+that+match+and%2For+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond%2C+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selective+and+non-selective%2C+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+and+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li>
<li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li>
<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Siamo stati in grado di eseguire la caratterizzazione funzionale del recettore del neuropeptide scoperto dal Aracnidi (zecche, acari e ragni), il recettore chinina zecca, con questo protocollo. Questo metodo ha tre applicazioni principali. In primo luogo, la tecnica può essere applicata per deorphanization recettore attraverso misurazioni dell&#39;attività ligando. In secondo luogo, il test può risolvere ligando-recettore relazioni struttura-attività (SAR). In terzo luogo, i metodi possono essere utilizzati nella scoperta della droga. Inoltre, questo protocollo può essere usato per studiare l&#39;attività di agonisti o antagonisti su quasi tutti i GPCR. Stiamo cominciando ad adattare questo protocollo per lo screening di librerie di piccole dimensioni. La linea cellulare abbiamo utilizzato non esprime la proteina onnipresente G G 16. Non abbiamo bisogno perché artropodi recettori chinina segnale attraverso le proteine ​​Gq e la cascata di calcio intracellulare e conservano questa proprietà di segnalazione in cellule di mammifero come mostrato qui.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Cellule CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K media </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotico-Antimicotici </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM ho ridotto Media siero </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Reattivo Lipofectin </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep rotazione miniprep kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfection reagente </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-bene bianco sottile piastra inferiore microtitere </td><td> Co-star </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> calcio senza mezzi DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-line emocitometro </td><td> Hausser scientifico </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 e T-75 fiasche </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 e 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del mosquito ( aedes aegypti) e tick ( rhipicephalus microplus) g recettori accoppiati alla proteina

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Recettori ormonali artropodi sono potenziali obiettivi per i pesticidi romanzo come si regolano molti processi fisiologici e comportamentali indispensabili. La maggior parte di essi appartengono alla superfamiglia delle proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR). Ci siamo concentrati sulla caratterizzazione artropodi recettori chinina da zecche e zanzare. Chinine artropodi sono neuropeptidi polifunzionale con myotropic, diuretico, e la funzione dei neurotrasmettitori. Qui, un metodo per l&#39;analisi sistematica delle relazioni struttura-attività di chinine insetti su due eterologa chinina che esprimono i recettori sistemi è descritto. Forniamo informazioni importanti per lo sviluppo di analoghi biostabile chinina con la possibilità di interrompere il diuretico, myotropic, e / o processi digestivi a zecche e zanzare. I recettori chinina dalla zecca del sud bestiame, Boophilus Microplus (Canestrini), e la zanzara Aedes aegypti (Linneo), sono stati stabilmente espressi nella linea cellulare di mammifero CHO-K1. Analisi funzionale di questi recettori sono stati completati con un saggio di bioluminescenza calcio piastra che misura bioluminescenza per determinare i livelli intracellulari di calcio citoplasmatico su richiesta peptide a queste cellule ricombinanti. Questo metodo sfrutta la proteina aequorina, un fotoproteine ​​isolato da meduse luminescenti. Noi trasfettate transitoriamente la aequorina plasmide (mtAEQ/pcDNA1) in linee cellulari che stabilmente espresso i recettori chinina. Queste cellule sono poi trattate con il coelenterazine cofattore, che complessi con aequorina intracellulare. Rompe questo legame, in presenza di calcio, che emettono i livelli di luminescenza indicativo della concentrazione di calcio. Come il recettore chinina segnali attraverso il rilascio di calcio intracellulare, l&#39;intensità del segnale è legato alla potenza del peptide. Questo protocollo è una sintesi di diversi protocolli precedentemente descritti, con modificazioni, presenta passo-passo le istruzioni per l&#39;espressione stabile di GPCR in una linea cellulare di mammifero attraverso saggi piastra funzionale (Staubly et al, 2002 e Scuderie et al, 1997.. ). Utilizzando questa metodologia, siamo stati in grado di stabilire linee cellulari stabili che esprimono la zanzara ei recettori zecca chinina, confrontare la potenza di tre chinine zanzara, identificare critica posizioni di aminoacidi per il ligando-recettore, ed eseguire semi-throughput screening di un peptide biblioteca. Perché chinine insetti sono sensibili alla rapida degradazione enzimatica da parte di peptidasi endogene, sono fortemente limitate in uso come strumenti per il controllo dei parassiti o studi endocrinologici. Pertanto, abbiamo provato anche gli analoghi chinina amminoacido isobutirrico (Aib) per migliorare la loro potenza e biostabilità. Questo peptidasi-resistente analogica rappresenta una guida importante per lo sviluppo di analoghi biostabile chinine insetti e può contribuire allo sviluppo di strategie di artropodi neuropeptide controllo basato su.

Questo protocollo fornisce le istruzioni per la selezione clonale di cellule di linea e un saggio di bioluminescenza di calcio per analizzare la struttura-attività di sintetizzata neuropeptidi artropodi sul loro affini GPCR. Questo test può essere utilizzato per deorphanization recettore e struttura-attività degli studi rapporto di sintesi per la progettazione analogica e peptide / farmaco-lead scoperta.

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

I recettori ormonali degli artropodi sono potenziali bersagli per nuovi pesticidi, poiché regolano numerosi processi fisiologici e comportamentali essenziali. Il...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare le relazioni struttura-attività di neuropeptidi artropodi sintetizzati nei confronti dei loro recettori gpcr corrispondenti. Questo viene ottenuto tramite la trasfezione di cellule ovariche di criceto cinese, linee cellulari K1 vuote, con il vettore di espressione del recettore GPCR desiderato, al fine di ottenere linee cellulari stabilmente trasformate derivate da una singola cellula. Come secondo passaggio, la linea cellulare stabile viene trasfettata con il plasmide quaran, che porta il reporter Gina Quaran per la misurazione della bioluminescenza intracellulare nel saggio in piastra per bioluminescenza del calcio. Successivamente, viene eseguito il saggio in piastra per bioluminescenza del calcio al fine di determinare i livelli citoplasmatici di calcio a seguito dell'applicazione del ligando peptidico a queste cellule ricombinanti.Si ottengono risultati che mostrano differenze nelle unità di bioluminescenza in seguito all'applicazione di peptidi strutturalmente diversi o di diverse concentrazioni peptidiche a cellule ricombinanti, in base al rilascio intracellulare di calcio indotto, rilevato dal reporter a corrin nel saggio in piastra. Il principale vantaggio dell'utilizzo di linee cellulari clonali stabilmente trasformate che esprimono GPCR ricombinanti, rispetto alle tendenze e ai protocolli di espressione, è che i livelli di espressione del recettore sono più uniformi, consentendo coerenza e riproducibilità dei risultati. Inoltre, l'indirizzamento della proteina aquarium ai mitocondri permette misurazioni sensibili del calcio mediante bioluminescenza, dimostrando che l'esperimento di oggi sarà condotto da due studenti laureati, Lie e Simon Kersch, oltre a un postdottorando del mio laboratorio.Per stabilire linee cellulari stabili, iniziare coltivando cellule di ovaio di criceto cinese, ceppo K1 vuote, a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%. Mantenere le cellule vuote in mezzo di crescita con antibiotico antimicotico 1x finché le cellule non crescono in modo sano. Seminare le cellule di ovaio di criceto cinese K1 in fiaschi da coltura tissutale T25 e far crescere le cellule durante la notte in mezzo di crescita senza antibiotici fino a quando non raggiungono circa il 30% di confluenza.Prima della trasfezione, preparare un vettore di espressione del DNA contenente il recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) di interesse come descritto nel protocollo scritto. Combinare il DNA con 100 microlitri di mezzo Optum a siero ridotto.Mescolare sei microlitri di reagente per lipofezione in 100 microlitri di mezzo F 12 K privo di siero e incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, mescolare delicatamente le soluzioni di DNA e di lipofezione in modo goccia a goccia. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 10-15 minuti in un tubo da 15 millilitri.Mescolare delicatamente la miscela di trasfezione in 1,8 millilitri di mezzo F 12 K fresco, aggiungendola goccia a goccia. Quindi lavare le cellule con PBS e aggiungere questa nuova soluzione di trasfezione alle cellule. Dopo un'incubazione di 18 ore.Cambiare il mezzo con F 12 K, mezzo contenente il 10% di FBS senza antibiotici e incubare tutta la notte il giorno successivo. Suddividere le cellule in due fiasche T 25 con F 12 K, mezzo contenente il 10% di FBS senza antibiotici come descritto nella procedura scritta. Incubare per ulteriori 18 ore.Sostituire il mezzo con un mezzo selettivo. Successivamente coltivare le cellule utilizzando il mezzo selettivo per un periodo di tre o quattro settimane. Questo permetterà di selezionare le cellule che hanno incorporato stabilmente il plasmide nel loro DNA genomico.Continuare a mantenere le cellule utilizzando il mezzo di mantenimento, congelando periodicamente le linee cellulari per prevenire la perdita in caso di contaminazione imprevista. Per selezionare linee cellulari clonali, trattare dapprima gli occhi con tripsina e centrifugare le cellule con il mezzo di mantenimento come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo di mantenimento.Rimuovere 0,5 millilitri della sospensione cellulare e aggiungere 4,5 millilitri di mezzo di mantenimento fresco per ottenere una diluizione 10 x; trasferire quindi 100 microlitri della diluizione 10 x in 12 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per selezionare singole cellule. Proseguire effettuando ulteriori diluizioni seriali 10 x di queste cellule per circa 19 volte, fino a ottenere una sospensione finale teorica di una cellula ogni 100 microlitri, e trasferire 100 microlitri di ciascuna diluizione seriale in 12 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Dopo 18 ore di incubazione, osservare le piastre a 96 pozzetti al microscopio invertito a luce visibile o a fluorescenza e contrassegnare i pozzetti che sembrano contenere una singola cellula oppure due cellule che hanno chiaramente derivato dalla divisione di una singola cellula.Osservare le piastre ogni giorno, cambiando il mezzo ogni tre giorni. Lasciare crescere le cellule per una settimana fino a raggiungere una confluenza del 80%. Quindi risciacquare le pozzette marcate con 200 microlitri di PBS e tripsina.Incubare gli occhi con 100 microlitri di soluzione di PBS tripsina EDTA. Rimuovere la soluzione di PBS tripsina EDTA. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di mantenimento e trasferire le cellule da ogni pozzetto marcato in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di mezzo di mantenimento.Dopo aver coltivato le cellule nella piastra a sei pozzetti per tre giorni, trasferire le cellule in singoli flaconi T 25. Congelare periodicamente la linea cellulare in modo che possa essere recuperata nel caso in cui le cellule smettano di comportarsi in modo costante. Per determinare la linea cellulare con la risposta più elevata, sottoporre le cellule trasferite a un saggio di bioluminescenza del calcio utilizzando un ligando attivo come il recettore, un peptide, un ligando o un altro agonista di controllo positivo.L'assay bioluminescente del calcio verrà dimostrato in dettaglio più avanti in questo video. Eseguire una seconda volta la selezione di singole cellule prima di proseguire con l'esperimento. Quando si scelgono linee cellulari clonali per saggi e le si mantiene in coltura, è fondamentale tenere traccia del numero di passaggi, poiché le cellule con un numero elevato di passaggi potrebbero smettere di proliferare in una fiala T 25.Linee cellulari stabili che esprimono il recettore desiderato in mezzo di mantenimento fino a raggiungere una confluenza di circa il 90%. Dopo aver sottoposto le cellule a tripsinizzazione e centrifugazione, sospendere le cellule in mezzo di mantenimento, diluirle di circa 10 volte con mezzo di mantenimento e determinare il numero cellulare mediante emocitometro. Successivamente, regolare il numero di cellule a circa due per 10 alla quinta cellule per millilitro, seminare due millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e incubare la piastra per 24 ore, al termine delle quali le cellule dovranno presentare una confluenza di circa il 60% prima dell'inizio del saggio di bioluminescenza del calcio.Preparare il gene reporter di interesse nel costrutto del vettore di espressione. In questo caso viene utilizzato un reporter del quorum espresso nei mitocondri. Successivamente, trasfettare le cellule con un microgrammo di questo plasmide reporter come descritto nel protocollo scritto.Dopo aver incubato le cellule in una piastra a sei pozzetti per 24 ore, trattare con tripsina, centrifugare e risospendere; quindi contare il numero di cellule fino a raggiungere una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro e trasferire 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra micromolare bianca a 96 pozzetti con fondo sottile, incubando per ulteriori 24 ore fino al raggiungimento di una confluenza pari a circa l'80%. Questa è la concentrazione ottimale di cellule per il saggio di bioluminescenza. I seguenti passaggi devono essere eseguiti al buio, ma qui vengono mostrati alla luce.Per scopi dimostrativi, preparare un quantitativo sufficiente di mezzo DME privo di calcio contenente cinque micromolari di CHO terezin, calcolando 90 microlitri per pozzetto. Rimuovere il vecchio mezzo dalla piastra e aggiungere 90 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per tre ore al buio a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica; dopo questo periodo, le cellule sono pronte per essere sottoposte a test. Questa dimostrazione viene eseguita utilizzando un lettore di piastre Nova star in modalità bioluminescenza. Per iniziare la purga, la piastra deve essere inserita nel supporto della piastra al buio mentre la macchina pompa. Solubilizzare i peptidi in un tubo EOR da 1,5 millilitri.Utilizzare una quantità sufficiente di DME senza calcio e mezzo per 10 microlitri di peptide 10 x per pozzetto. Impostare la profondità di aspirazione e la determinazione della posizione della soluzione peptidica prima dell'uso. Sfamare le cellule con 10 microlitri di peptide e iniziare immediatamente la registrazione dell'emissione luminosa.In questa dimostrazione, lo strumento è impostato per registrare l'emissione luminosa a 465 nanometri per ogni pozzetto ogni due secondi per un tempo totale di 50 secondi. Al termine della corsa, lavare le pompe dello strumento. Ripetere il processo per ogni campione di peptide, salvare i dati e lavare nuovamente le pompe dello strumento al termine del saggio.I dati di emissione luminosa da ciascun pozzetto vengono trasferiti automaticamente in un foglio dati di Microsoft Excel dal programma software. Incollare i dati da Excel nel Prism Software 4.0. Generare un grafico con le diverse concentrazioni di peptide sull'asse delle x e le unità di bioluminescenza.Nell'asse Y, selezionare un'analisi di adattamento della curva di regressione non lineare per ottenere le curve di risposta alla concentrazione per ciascun peptide nei rispettivi valori di CE 50. Ogni esperimento deve essere ripetuto tre volte per l'analisi dei dati. Quando espresso in cellule ovariche di criceto cinese, cellule K one, il recettore della chininina da Aedes aegypti si è comportato come un recettore multiligando e ha risposto funzionalmente a concentrazioni basse come un amminoare.Per i tre cinine endogeni di Aedes aegypti testati singolarmente mediante saggio colorimetrico del calcio con bioluminescenza, sono stati determinati valori di CE50 statisticamente differenti di circa 16 nanomolari per Aedes aegypti kinina 3, 26 nanomolari per Aedes aegypti kinina 2 e 49 nanomolari per Aedes aegypti kinina 1, con un ordine di potenza decrescente in cui la kinina 3 di Aedes risulta la più potente e la kinina 1 la meno potente. Di seguito è riportato il confronto dell'attività di sei analoghi di cinina contenenti alfa-amminoisoacido butirrico sulla linea cellulare di ovario di criceto cinese K1 esprimente il recettore per la cinina di zecca, valutato mediante saggio colorimetrico del calcio con bioluminescenza.L'asse Y rappresenta la percentuale di unità massime di bioluminescenza per ogni analogo, espressa come percentuale di bioluminescenza osservata a una concentrazione rispetto alla risposta massima osservata a tutte le concentrazioni testate per ogni analogo. L'analogoo del peptide KININE HEXA F-F-F-S-W-G amidato è il controllo positivo per l'attività del recettore. L'analogoo della kinina con singola sostituzione, Phe-Phe-ISO acido butirrico-Trp-Gly amidato, è risultato più attivo del controllo positivo, l'analogoo del peptide KININE HEXA; l'analogoo della kinina con due sostituzioni con acido aminobutirrico, acido aminobutirrico-Phe-acido aminobutirrico-Trp-Gly amidato, è risultato il più potente tra gli analoghi con doppia sostituzione testati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come esprimere A-G-P-C-R e ottenere linee cellulari clonali per analizzare le relazioni struttura-attività dei ligandi sui recettori mediante un saggio di bioluminescenza del calcio.

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Metodi di impiego di sistemi di trasduzione alfavirus esprimere reporter fluorescente in vitro e in zanzare adulte sono descritti. Questa tecnica può essere adattato per esprimere qualsiasi proteina di interesse in sostituzione o in aggiunta ad un giornalista.

Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

&lt;p style='altezza-linea:1.38;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'&gt;Fonte: Lark, A. R., et. al., approccio di imaging cerebrale funzionale in vivo basato sull'indicatore di calcio bioluminescente GFP-aequorina. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'imaging in tempo reale della dinamica del calcio utilizzando la bioluminescenza fluorescente della proteina-equorina verde in Drosophila'sstrutture cerebrali profonde.

Imaging a bioluminescenza per lo studio dei transitori di calcio nelle strutture cerebrali di Drosophila

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.

Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

Questo protocollo descrive una metodologia di microiniezione che abbiamo standardizzato e usati per diversi anni per fornire determinate quantità di acidi nucleici direttamente all'emolinfa di zanzare e mosche di casa. Questo protocollo risulta in una iniezione minima mortalità e consente di effettuare misure di dose correlato della fecondità.

Riproducibile dsRNA Microinjection e analisi biologica di deposizione delle uova di zanzare e mosche domestiche

Descritto è un metodo di risparmio di tempo e spazio per contare le uova e determinare i tassi di schiusa delle singole zanzare utilizzando 24 piastre di coltura tissutale del pozzo, che possono aumentare sostanzialmente la scala e la velocità dei test di fecondità e fertilità.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Sono descritte le procedure per studiare i comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane utilizzando l'elettropenetragrafia AC-DC.

Elettropenetragrafia AC-DC per lo studio dei comportamenti di sondaggio e ingestione delle zanzare Culex tarsalis sulle mani umane

Un semplice ma accurato metodo per raccogliere e macchia ematociti concentrati zanzara è descritto. Il nostro metodo combina la semplicità di perfusione con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare. Questo metodo facilita la conoscenza di studi che richiedono i tipi di ematociti concentrati e la loro abbondanza.

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

Scopri l'assay di bioluminescenza del calcio per analizzare le relazioni struttura-attività dei neuropeptidi degli artropodi sui recettori GPCR di Aedes aegypti e Rhipicephalus microplus. Questo metodo supporta la scoperta di farmaci.

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina (Video) | JoVE Journal

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

Esplora altri video