Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare le relazioni struttura-attività di neuropeptidi artropodi sintetizzati nei confronti dei loro recettori gpcr corrispondenti. Questo viene ottenuto tramite la trasfezione di cellule ovariche di criceto cinese, linee cellulari K1 vuote, con il vettore di espressione del recettore GPCR desiderato, al fine di ottenere linee cellulari stabilmente trasformate derivate da una singola cellula. Come secondo passaggio, la linea cellulare stabile viene trasfettata con il plasmide quaran, che porta il reporter Gina Quaran per la misurazione della bioluminescenza intracellulare nel saggio in piastra per bioluminescenza del calcio. Successivamente, viene eseguito il saggio in piastra per bioluminescenza del calcio al fine di determinare i livelli citoplasmatici di calcio a seguito dell'applicazione del ligando peptidico a queste cellule ricombinanti.

Si ottengono risultati che mostrano differenze nelle unità di bioluminescenza in seguito all'applicazione di peptidi strutturalmente diversi o di diverse concentrazioni peptidiche a cellule ricombinanti, in base al rilascio intracellulare di calcio indotto, rilevato dal reporter a corrin nel saggio in piastra. Il principale vantaggio dell'utilizzo di linee cellulari clonali stabilmente trasformate che esprimono GPCR ricombinanti, rispetto alle tendenze e ai protocolli di espressione, è che i livelli di espressione del recettore sono più uniformi, consentendo coerenza e riproducibilità dei risultati. Inoltre, l'indirizzamento della proteina aquarium ai mitocondri permette misurazioni sensibili del calcio mediante bioluminescenza, dimostrando che l'esperimento di oggi sarà condotto da due studenti laureati, Lie e Simon Kersch, oltre a un postdottorando del mio laboratorio.

Per stabilire linee cellulari stabili, iniziare coltivando cellule di ovaio di criceto cinese, ceppo K1 vuote, a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%. Mantenere le cellule vuote in mezzo di crescita con antibiotico antimicotico 1x finché le cellule non crescono in modo sano. Seminare le cellule di ovaio di criceto cinese K1 in fiaschi da coltura tissutale T25 e far crescere le cellule durante la notte in mezzo di crescita senza antibiotici fino a quando non raggiungono circa il 30% di confluenza.

Prima della trasfezione, preparare un vettore di espressione del DNA contenente il recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) di interesse come descritto nel protocollo scritto. Combinare il DNA con 100 microlitri di mezzo Optum a siero ridotto.

Mescolare sei microlitri di reagente per lipofezione in 100 microlitri di mezzo F 12 K privo di siero e incubare a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, mescolare delicatamente le soluzioni di DNA e di lipofezione in modo goccia a goccia. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente per 10-15 minuti in un tubo da 15 millilitri.

Mescolare delicatamente la miscela di trasfezione in 1,8 millilitri di mezzo F 12 K fresco, aggiungendola goccia a goccia. Quindi lavare le cellule con PBS e aggiungere questa nuova soluzione di trasfezione alle cellule. Dopo un'incubazione di 18 ore.

Cambiare il mezzo con F 12 K, mezzo contenente il 10% di FBS senza antibiotici e incubare tutta la notte il giorno successivo. Suddividere le cellule in due fiasche T 25 con F 12 K, mezzo contenente il 10% di FBS senza antibiotici come descritto nella procedura scritta. Incubare per ulteriori 18 ore.

Sostituire il mezzo con un mezzo selettivo. Successivamente coltivare le cellule utilizzando il mezzo selettivo per un periodo di tre o quattro settimane. Questo permetterà di selezionare le cellule che hanno incorporato stabilmente il plasmide nel loro DNA genomico.

Continuare a mantenere le cellule utilizzando il mezzo di mantenimento, congelando periodicamente le linee cellulari per prevenire la perdita in caso di contaminazione imprevista. Per selezionare linee cellulari clonali, trattare dapprima gli occhi con tripsina e centrifugare le cellule con il mezzo di mantenimento come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo di mantenimento.

Rimuovere 0,5 millilitri della sospensione cellulare e aggiungere 4,5 millilitri di mezzo di mantenimento fresco per ottenere una diluizione 10 x; trasferire quindi 100 microlitri della diluizione 10 x in 12 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per selezionare singole cellule. Proseguire effettuando ulteriori diluizioni seriali 10 x di queste cellule per circa 19 volte, fino a ottenere una sospensione finale teorica di una cellula ogni 100 microlitri, e trasferire 100 microlitri di ciascuna diluizione seriale in 12 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Dopo 18 ore di incubazione, osservare le piastre a 96 pozzetti al microscopio invertito a luce visibile o a fluorescenza e contrassegnare i pozzetti che sembrano contenere una singola cellula oppure due cellule che hanno chiaramente derivato dalla divisione di una singola cellula.

Osservare le piastre ogni giorno, cambiando il mezzo ogni tre giorni. Lasciare crescere le cellule per una settimana fino a raggiungere una confluenza del 80%. Quindi risciacquare le pozzette marcate con 200 microlitri di PBS e tripsina.

Incubare gli occhi con 100 microlitri di soluzione di PBS tripsina EDTA. Rimuovere la soluzione di PBS tripsina EDTA. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di mantenimento e trasferire le cellule da ogni pozzetto marcato in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di mezzo di mantenimento.

Dopo aver coltivato le cellule nella piastra a sei pozzetti per tre giorni, trasferire le cellule in singoli flaconi T 25. Congelare periodicamente la linea cellulare in modo che possa essere recuperata nel caso in cui le cellule smettano di comportarsi in modo costante. Per determinare la linea cellulare con la risposta più elevata, sottoporre le cellule trasferite a un saggio di bioluminescenza del calcio utilizzando un ligando attivo come il recettore, un peptide, un ligando o un altro agonista di controllo positivo.

L'assay bioluminescente del calcio verrà dimostrato in dettaglio più avanti in questo video. Eseguire una seconda volta la selezione di singole cellule prima di proseguire con l'esperimento. Quando si scelgono linee cellulari clonali per saggi e le si mantiene in coltura, è fondamentale tenere traccia del numero di passaggi, poiché le cellule con un numero elevato di passaggi potrebbero smettere di proliferare in una fiala T 25.

Linee cellulari stabili che esprimono il recettore desiderato in mezzo di mantenimento fino a raggiungere una confluenza di circa il 90%. Dopo aver sottoposto le cellule a tripsinizzazione e centrifugazione, sospendere le cellule in mezzo di mantenimento, diluirle di circa 10 volte con mezzo di mantenimento e determinare il numero cellulare mediante emocitometro. Successivamente, regolare il numero di cellule a circa due per 10 alla quinta cellule per millilitro, seminare due millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e incubare la piastra per 24 ore, al termine delle quali le cellule dovranno presentare una confluenza di circa il 60% prima dell'inizio del saggio di bioluminescenza del calcio.

Preparare il gene reporter di interesse nel costrutto del vettore di espressione. In questo caso viene utilizzato un reporter del quorum espresso nei mitocondri. Successivamente, trasfettare le cellule con un microgrammo di questo plasmide reporter come descritto nel protocollo scritto.

Dopo aver incubato le cellule in una piastra a sei pozzetti per 24 ore, trattare con tripsina, centrifugare e risospendere; quindi contare il numero di cellule fino a raggiungere una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro e trasferire 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra micromolare bianca a 96 pozzetti con fondo sottile, incubando per ulteriori 24 ore fino al raggiungimento di una confluenza pari a circa l'80%. Questa è la concentrazione ottimale di cellule per il saggio di bioluminescenza. I seguenti passaggi devono essere eseguiti al buio, ma qui vengono mostrati alla luce.

Per scopi dimostrativi, preparare un quantitativo sufficiente di mezzo DME privo di calcio contenente cinque micromolari di CHO terezin, calcolando 90 microlitri per pozzetto. Rimuovere il vecchio mezzo dalla piastra e aggiungere 90 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per tre ore al buio a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica; dopo questo periodo, le cellule sono pronte per essere sottoposte a test.

Questa dimostrazione viene eseguita utilizzando un lettore di piastre Nova star in modalità bioluminescenza. Per iniziare la purga, la piastra deve essere inserita nel supporto della piastra al buio mentre la macchina pompa. Solubilizzare i peptidi in un tubo EOR da 1,5 millilitri.

Utilizzare una quantità sufficiente di DME senza calcio e mezzo per 10 microlitri di peptide 10 x per pozzetto. Impostare la profondità di aspirazione e la determinazione della posizione della soluzione peptidica prima dell'uso. Sfamare le cellule con 10 microlitri di peptide e iniziare immediatamente la registrazione dell'emissione luminosa.

In questa dimostrazione, lo strumento è impostato per registrare l'emissione luminosa a 465 nanometri per ogni pozzetto ogni due secondi per un tempo totale di 50 secondi. Al termine della corsa, lavare le pompe dello strumento. Ripetere il processo per ogni campione di peptide, salvare i dati e lavare nuovamente le pompe dello strumento al termine del saggio.

I dati di emissione luminosa da ciascun pozzetto vengono trasferiti automaticamente in un foglio dati di Microsoft Excel dal programma software. Incollare i dati da Excel nel Prism Software 4.0. Generare un grafico con le diverse concentrazioni di peptide sull'asse delle x e le unità di bioluminescenza.

Nell'asse Y, selezionare un'analisi di adattamento della curva di regressione non lineare per ottenere le curve di risposta alla concentrazione per ciascun peptide nei rispettivi valori di CE 50. Ogni esperimento deve essere ripetuto tre volte per l'analisi dei dati. Quando espresso in cellule ovariche di criceto cinese, cellule K one, il recettore della chininina da Aedes aegypti si è comportato come un recettore multiligando e ha risposto funzionalmente a concentrazioni basse come un amminoare.

Per i tre cinine endogeni di Aedes aegypti testati singolarmente mediante saggio colorimetrico del calcio con bioluminescenza, sono stati determinati valori di CE50 statisticamente differenti di circa 16 nanomolari per Aedes aegypti kinina 3, 26 nanomolari per Aedes aegypti kinina 2 e 49 nanomolari per Aedes aegypti kinina 1, con un ordine di potenza decrescente in cui la kinina 3 di Aedes risulta la più potente e la kinina 1 la meno potente. Di seguito è riportato il confronto dell'attività di sei analoghi di cinina contenenti alfa-amminoisoacido butirrico sulla linea cellulare di ovario di criceto cinese K1 esprimente il recettore per la cinina di zecca, valutato mediante saggio colorimetrico del calcio con bioluminescenza.

L'asse Y rappresenta la percentuale di unità massime di bioluminescenza per ogni analogo, espressa come percentuale di bioluminescenza osservata a una concentrazione rispetto alla risposta massima osservata a tutte le concentrazioni testate per ogni analogo. L'analogoo del peptide KININE HEXA F-F-F-S-W-G amidato è il controllo positivo per l'attività del recettore. L'analogoo della kinina con singola sostituzione, Phe-Phe-ISO acido butirrico-Trp-Gly amidato, è risultato più attivo del controllo positivo, l'analogoo del peptide KININE HEXA; l'analogoo della kinina con due sostituzioni con acido aminobutirrico, acido aminobutirrico-Phe-acido aminobutirrico-Trp-Gly amidato, è risultato il più potente tra gli analoghi con doppia sostituzione testati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come esprimere A-G-P-C-R e ottenere linee cellulari clonali per analizzare le relazioni struttura-attività dei ligandi sui recettori mediante un saggio di bioluminescenza del calcio.