Phage 'Bioluminescent' Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yesinia Pestis e Bacillus Anthrax sono patogeni batterici di categoria A che causano rispettivamente la peste e l'antrace. Sebbene l'insorgenza naturale di entrambe le malattie sia ora relativamente rara, la possibilità che gruppi terroristici utilizzino questi patogeni come arma biologica è reale. Questo video illustra un metodo per rilevare e identificare Yersinia pestis.

Prima, il microrganismo viene coltivato su piastre con terreno solido e in terreno liquido. Successivamente, un reporter di pH specifico per Y. pestis viene aggiunto alla coltura. Il reporter di pH contiene nel suo genoma i geni che codificano per la luceciferasi batterica, luxAB.

Se sono presenti cellule di Y. pestis, il fago reporter si legherà specificamente alla cellula, iniettando il suo DNA ricombinante, che porta i geni luxe AB, e utilizzerà la macchina trascrizionale e traduzionale dell'ospite per trascrivere e tradurre i geni reporter luxe AB. I risultati ottenuti mostrano che i campioni hanno acquisito un fenotipo bioluminescente, indicando che il microrganismo sconosciuto è stato identificato positivamente come Y. pestis. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il tradizionale saggio di lisi fagica, è che il tempo necessario per rilevare e identificare Y. pestis è di pochi minuti invece che giorni. Questo metodo può aiutare a identificare rapidamente e rilevare la presenza di Y. pestis utilizzando colture isolate o direttamente da campioni clinici o ambientali complessi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della peste, poiché la malattia è solitamente fatale se non viene trattata entro le prime 24 ore dall'insorgenza dei sintomi. Pertanto, l'identificazione tempestiva di Yesenia pests è essenziale per una prognosi positiva. Poiché esistono fagi per quasi tutte le specie batteriche, la metodologia potrebbe potenzialmente essere adattata per qualsiasi specie che sia medica, ambientale o agricola di importanza per Y. pestis.

A 1122 è un ceppo escluso dagli agenti selezionati di livello di sicurezza biologica due. È privo sia del plasmide di virulenza LCR (risposta al calcio Perlo) di 75 chilobasi, sia del locus PGM, entrambi necessari per la virulenza. Iniziare questa procedura all'interno di una cappa di sicurezza biologica di classe due tipo A, utilizzando una tecnica sterile per effettuare lo streaking di Y. pestis, A 1122.

Coltivare i ceppi di riserva su agar LB come mostrato qui. Posizionare le piastre capovolte in un incubatore ad aria statico con temperatura controllata a 28 gradi Celsius per 48 ore. La velocità di crescita di Y. pestis è lenta, con un tempo di generazione di 1,25 ore dopo due giorni.

Utilizzare un’ansa di inoculazione sterile in metallo per prelevare una singola colonia di Y. pestis. Selezionare una colonia uniforme per dimensione, rappresentativa delle altre colonie e chiaramente separata dal resto delle colonie sulla piastra. Trasferire la colonia in un tubo da coltura sterile da 17 per 100 millimetri contenente due millilitri di brodo LB.

Chiudere il tubo e vorticare brevemente, quindi collocarlo in un incubatore agitato a 225 giri al minuto a 28 gradi Celsius per circa 20 ore. Per questo saggio, sono preferibili cellule in crescita attiva per il rilevamento. Poiché la capacità del fago di trasdurre è legata alla risposta bioluminescente, quest'ultima risulta correlata alla vitalità e al fitness dei batteri ospiti.

Tuttavia, è stato dimostrato che il sistema di rilevamento è compatibile con cellule raccolte in tutte le fasi del ciclo di crescita. Dopo 20 ore di crescita, diluire la coltura di Y pestis di uno a 20 in un tubo conico da 50 millilitri aggiungendo 500 microlitri di cellule a 10 millilitri di brodo lb. Reintrodurre la coltura nell'incubatore agitato a 28 gradi Celsius.

Lasciare crescere la coltura fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,2. Ciò richiederà circa cinque ore per generare il substrato della reazione bioluminescente. Preparare una soluzione di decanale N al 2% mescolando 200 microlitri di decanale N con 9,8 millilitri di brodo LB.

Agitare vigorosamente per cinque secondi. Successivamente, preparare l'iniettore del luminometro per micropiastre. Posizionare un'estremità del tubo dell'iniettore e un tubo da 13 millilitri contenente soluzione decal al 2% e l'altra estremità del tubo dell'iniettore in un contenitore per rifiuti.

Utilizzando il software dell'attrezzatura, impostare la macchina in modo che esegua il condizionamento della linea dell'iniettore con due millilitri della soluzione di decanale. Una volta completata l'operazione, la linea dovrà riempirsi di substrato; posizionare quindi nuovamente l'estremità della linea dell'iniettore nella sua sede originale, pronta per l'iniezione nei pozzetti. Successivamente, impostare il luminometro in modo che inietti automaticamente 67 microlitri della soluzione di deel in ciascuna micropiastra.

Quindi misurare immediatamente il livello di bioluminescenza emessa per 10 secondi. Successivamente, per preparare ogni campione ed eseguire le triplicazioni, etichettare tre provette di coltura per ogni condizione. In questo caso, verranno preparati controlli con solo mezzo e controlli con solo cellule, oltre a un campione di prova.

Pertanto, sono necessarie nove provette per preparare i campioni di controllo solo con fagi, distribuire aliquote di un millilitro di brodo lb in tre provette di coltura. Aggiungere 20 microlitri del fago reporter. Soluzione stock contenente cinque volte 10 alla nona unità formanti placche o PFU per millilitro in ciascuna provetta.

In assenza di cellule di Y pesti, l'aggiunta del fago reporter non dovrebbe indurre una risposta bioluminescente. Successivamente, per preparare i campioni di prova, distribuire aliquote di un millilitro della coltura di Y pesti in tre provette da coltura. Aggiungere 20 microlitri del ceppo di fago reporter a tre delle colture.

Mescolare le colture vortexando brevemente per preparare le cellule singolarmente. Come controlli negativi, utilizzati per determinare l'autoluminescenza di fondo, distribuire aliquote di un millilitro della coltura di Y. pestis in tre ulteriori provette. Una volta preparati i campioni, trasferire 200 microlitri da ciascuna coltura nei pozzetti di una piastra microtitolatrice bianca a 96 pozzetti per la lettura al tempo zero.

Posizionare il resto di ciascuna coltura nell’agitatore a 28 gradi Celsius utilizzando un luminometro per micropiastre. Misurare il tempo. Eseguire la taratura a zero dei campioni per la bioluminescenza o per le unità di luce relative.

Eseguire le misurazioni della bioluminescenza prelevando 200 microlitri da ogni coltura ed effettuando le letture nel luminometro per micropiastre a 20, 30, 40 e 60 minuti. Dopo aver aggiunto il fago reporter per accelerare il processo di rilevamento senza la necessità di far crescere Y. pestis, trasferire una colonia da una piastra appena coltivata in un tubo microcentrifuga contenente 200 microlitri di lb, contenente il fago reporter. Mescolare il campione mediante vortex, quindi distribuire la miscela cellule-fago in una pozzetta di una piastra per saggio multiplo.

Incubare la piastra a 96 pozzetti a 28 gradi Celsius per 60 minuti. Successivamente, leggere il campione per la bioluminescenza. Il saggio dimostrato in questo video rileva la presenza di cellule di Y pestis come descritto nell'introduzione.

Quando è presente Y. pestis, il fago reporter si lega a un recettore specifico sulla cellula, inietta il suo DNA e utilizza l'apparato trascrizionale e traduttivo dell'ospite per trascrivere e tradurre il gene reporter lux. L'intensità del segnale e il tempo di risposta del segnale sono proporzionali al numero di cellule presenti, a concentrazioni elevate di cellule, da 10 alla quinta a 10 alla ottava UFC per millilitro.

Un aumento significativo di RLU rispetto ai controlli dovrebbe essere evidente entro 20 minuti a concentrazioni cellulari più basse, da 10 alla seconda a 10 alla quarta UFC per millilitro. Un aumento significativo di RLU dovrebbe essere evidente entro 40-60 minuti. Qui viene mostrato un esperimento rappresentativo nel tempo del rilevamento del reporter mediato da fago di Y. pestis ai tempi zero.

I fagi reporter e le cellule sono stati mescolati e incubati a 28 gradi Celsius, e la luminescenza (RLU) è stata monitorata nel tempo. Un aumento dei RLU è risultato evidente entro 12 minuti, risultato significativo con un valore P minore di 0,05; i controlli negativi costituiti solo da fagi o solo da cellule hanno mostrato livelli di fondo di bioluminescenza di circa 20 RLU durante tutta l'incubazione di 60 minuti. Si noti che i livelli di base sono specifici del luminometro.

Invece, un aumento della bioluminescenza nei campioni in prova delle cellule fantasma reporter è evidente a 12 minuti dall'aggiunta del fago. L'intensità del segnale dovrebbe aumentare in modo costante nel corso di 50 minuti, anche se non mostrato qui; incubazioni per periodi superiori a 80 minuti porteranno a un segnale in calo rispetto al valore massimo a causa della lisi mediata da fago delle cellule ospiti. Risultati simili si ottengono a temperature di incubazione di 37 gradi Celsius, anche se la temperatura ottimale per la crescita di Y. pestis è di 28 gradi Celsius.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il sistema di reportage ricombinante per il rilevamento. Una volta acquisita padronanza nell'identificazione di Yesenia Pestis, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti utilizzando colonie dorate di S come inocolo iniziale. Durante il tentativo di eseguire questa procedura e l'uso di fagi in laboratorio, è importante ricordare che è molto facile contaminare le colture batteriche di riserva con i fagi, pertanto si deve ridurre al minimo la possibilità di contaminazione.

Utilizzare indumenti e punte di pipetta in plastica monouso e cambiare regolarmente i guanti. La capacità del ceppo di indurre una risposta di Blum è correlata alla vitalità della cellula. Pertanto, dopo l'identificazione di Yesenia Pesta, il ceppo può essere utilizzato per determinare la suscettibilità antibiotica dell'isolato.

Ad esempio, le cellule di Yesenia pesta incubate con una concentrazione inibitoria dell'antibiotico risulteranno incapaci oppure avranno fortemente ridotta la capacità di produrre un segnale bioluminescente. Al contrario, le cellule di Yesenia pesta resistenti all'antibiotico non saranno compromesse dalla presenza dell'antibiotico e potranno generare una risposta bioluminescente analoga a quella delle cellule non inibite. Pertanto, è possibile determinare rapidamente un profilo della suscettibilità del patogeno agli antibiotici.

A scopo illustrativo, abbiamo utilizzato un ceppo attenuato di Yesenia pesta. In questo esperimento, Yesenia pests è una categoria, un patogeno batterico. Quando si esegue questa tecnica con campioni che devono essere ispezionati per la presenza di Yesenia Pestis, è necessario seguire adeguate precauzioni di biosicurezza e per i rischi biologici.