Name: Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Impara a isolare leucociti infiltranti il cervello da topi infettati con TMEV utilizzando gradienti di Percoll e Ficoll. Questo metodo consente l'analisi citofluorimetrica delle risposte immunitarie innate.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NS64571 dal NINDS (CLH), con un premio primi stadi dello sviluppo della carriera della Mayo Clinic (CLH), e da un generoso regalo di Donald e Frances Herdrich (CLH). Vorremmo ringraziare il Core Mayo Clinic Citometria a flusso per l&#39;assistenza.

1. Virus iniezione intracranica: La seguente tecnica è stato modificato ed utilizzato ampiamente dal nostro laboratorio e colleghi. In breve, l'iniezione di tensione intracranica Daniel di Theiler ha murino encefalomielite virus (TMEV) o sham-infezione (1, 10) viene eseguita su topi giovani (preferibilmente 5-6 settimane di età), per sollecitare leucociti cervello infiltrante (Bils). Si prega di notare che i risultati saranno diversi tra il ceppo di Daniel, il ceppo BEAN, e il ceppo GDVII. Ai fini della raccolta Bils, topi ricevere 2x10 5 PFU di TMEV e sono infettate per 24 ore. <ol><li> Applicare l'ago di iniezione (27 gauge, ¼, Kendall), a un automatico siringa da 1 ml Hamilton e impostato a consegnare 10 ml di virus. </li><li> Redigere TMEV a 10 L DMEM nella siringa con particolare attenzione a bolle d'aria. Se del caso, i topi infettati farsa ricevere 10 ml di virus DMEM. </li><li> Poco prima iniezione, versare circa 1 ml di isoflurano in una campana di vetro che contiene una griglia metallica con il substrato di cotone sotto. </li><li> Topi luogo direttamente sui griglia metallica nella campana di vetro fino a quando diventano leggermente anestetizzata, insensibile ai piedi, pizzico e immobilizzato dai inalanti anestetico, circa 10-15 secondi. I topi non devono venire a contatto diretto con isoflurano, come sostanza può essere irritante e caustico. </li><li> Mentre è sotto anestesia, preparare i topi per l'iniezione di trovare velocemente coordinate appropriate nella regione di corteccia frontale del cranio con barba e inchiostrazione. La posizione generale per l'iniezione è di 1 mm anteriore al bregma e 1 mm laterale per la sutura sagittale sul lato destro (Figura 1). Mentre l'iniezione stereotassica può essere appropriato per alcune situazioni sperimentali, abbiamo scoperto che a mano libera iniezione senza barba o inchiostrazione è adatto per la maggior parte degli esperimenti. Ripartito il pelo con la punta dell'ago lungo entrambi gli assi è appropriato per l'iniezione. </li><li> Per fare una iniezione, orientare la perpendicolare ago al cranio e stampa attraverso l'osso a una profondità di circa 3 mm. </li><li> Esprimere virus nel cervello premendo il pulsante siringa Hamilton verso il basso e attendere 2 secondi per il virus di entrare nel cervello prima di ritirarsi. </li><li> Rimuovere con attenzione l'ago e posizionare il mouse in un ambiente pulito, asciutto gabbia. I topi risvegliano dall'anestesia in fretta e riprendere la normale funzione in pochi minuti. Prestare la debita attenzione ai topi che presentano sintomi anomali, come ad esempio un eccessivo sanguinamento dal sito di iniezione, come l'eutanasia degli animali può essere appropriato. Una corretta gestione degli animali 6 e aderenza al National Institutes of Health e cura degli animali e le linee guida istituzionali Comitato uso devono essere seguite. </li></ol> 2. Brain-infiltrazione dei leucociti preparazione delle cellule: <ol><li> Preparare a fondo rotondo provette Oak Ridge che può contenere una capacità di 30 ml con 10 ml di RPMI 1640, 9 ml di Percoll e 1 ml di PBS 10X e tubi dovrebbero sedersi a temperatura ambiente in panchina durante il processo di rimozione del cervello. </li><li> Portare Ficoll-Paque Plus per temperatura ambiente (RT). </li><li> Eutanasia animale modificato isoflurano overdose 5 e rimuovere rapidamente il cervello utilizzando un tessuto in acciaio inox spatola e mettere in un tubo da 15 ml contenente 5 ml RPMI sul ghiaccio. In alcune circostanze, PBS-perfusione può essere opportuno eliminare le cellule circolanti nel sangue periferico dalla preparazione Bils. I topi devono essere adeguatamente e completamente anestetizzato prima di PBS-perfusione. </li><li> Trasferimento del cervello e la soluzione RPMI da ml 7 di vetro Pyrex tessuto marchio Tenbroeck smerigliatrice e delicatamente omogeneizzare con 10-15 colpi. </li><li> Pipettare altri 5 ml in RPMI l'omogeneizzatore e pipetta su e giù due volte. Trasferimento cervello omogenato (circa 10 ml) per precedentemente preparato a fondo rotondo tubo e capovolgere delicatamente 2-3 volte per mescolare. </li><li> Spin omogenato cerebrale ave a 7800g per 30 min a RT in un angolo fisso F0360 in un rotore Beckman Allegra X-22R centrifuga clinica. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere i detriti della mielina che ha galleggiato alla parte superiore del gradiente. Raccogliere lo strato di leucociti che fluttua sopra il pellet di cellule rosse del sangue (Figura 2). </li><li> Ceppo strato di leucociti attraverso un filtro a 40 micron di cellule in un 50 ml conica. Portare soluzione a 50 ml di volume con RMPI. </li><li> Spin tubi contenenti sospensione diluita di cellule in una centrifuga clinica a 1500 rpm (600g ave) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il supernatante e raccogliere il pellet di cellule. Risospendere il pellet in 1 ml di FACS tampone (1% di sieroalbumina bovina, sodio azide 0,02% di calcio e magnesio senza PBS) e trasferire la sospensione cellulare a 5 ml tubi fondo rotondo FACS. </li><li> Attenzione alla base della sospensione con 1 ml di Ficoll-Paque Plus. </li><li> In provetta a 2500 giri al minuto (1400 diede) in centrifuga clinica per 25 minuti a temperatura ambiente, senza freno. </li><li> Rimuovere bianco, strato soffice a livello di interfaccia (Figura 2) con la pipetta da 1 ml e trasferimento al nuovo 5 ml di tubo di FACS. Lavare cells con 4 ml di tampone FACS. </li><li> Rotazione del tubo a 1500 rpm (600g ave) per 5 min a RT in centrifuga clinica alle cellule pellet. </li><li> Aspirare il surnatante e raccogliere pellet cellulare. Risospendere il pellet di leucociti nel tampone appropriato e tenere sul ghiaccio in nuovi tubi FACS. </li><li> Contare le celle, valutare la vitalità cellulare per esclusione Blu tripano e analizzare mediante citometria a flusso. In generale, gli investigatori si può aspettare di acquisire circa 5 x 10 5 cellule / animale. </li></ol> 3. Citometria a flusso immunofenotipo <ol><li> Dopo aver isolato e il conteggio dei leucociti, le cellule rotazione per 3 minuti a 1500 rpm (600 ha) in una centrifuga clinica. </li><li> Risospendere il pellet in tampone bloccante contenente quanto segue: buffer di FACS, sopranatante 2.4G2 ibridoma (Fc block; anti-CD16/32) e siero fetale bovino con un rapporto di 10:05:01 e incubare per 30 minuti a 4 ° C . </li><li> Preparare e aggiungere anticorpi coniugati contro gli antigeni extracellulari alle cellule bloccate ad una concentrazione di 1:200 e incubare per 30 minuti a 4 ° C al buio. Macchia e incubare cellule in 200 microlitri di una 96-e V-piastra inferiore. Controlli appropriati includono le cellule senza macchia e campioni di compensazione fluorocromo, se necessario. </li><li> Gira la cellule colorate a temperatura ambiente per 3 minuti a 1500 rpm (600 ha) in una centrifuga clinica utilizzando un appropriato rotore per piastre da 96 pozzetti. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare le cellule con 200 microlitri di buffer FACS pipettando gentilmente su e giù per 3 volte. </li><li> Ripetere la tecnica di lavaggio sopra due volte. </li><li> Dopo il lavaggio, risospendere le cellule nel 2% paraformaldeide e trasferimento in tubi di FACS. Fissaggio è necessario per citometria a flusso delle cellule infette del livello di biosicurezza 2 reagenti. </li><li> Eseguire le cellule fissato su un BD FACS Calibur seguendo un metodo di citometria a flusso modificato 8 e analizzare i file non in linea con FlowJo, WinMDI o altri software disponibili citometria a flusso di analisi. </li><li> L'analisi di 50-100.000 eventi per campione è generalmente richiesto per immunofenotipizzazione adeguata. </li></ol> Gli anticorpi coniugati direttamente utilizzati in questo esperimento: CD45 è stata rilevata con clone 30-F11. Ly6C / G è stata rilevata con clone Gr1, RB6-8C5. CD11b è stato rilevato con clone M1/70. F4/80 è stata rilevata con clone BM8. 4. Rappresentante dei risultati: Mostriamo i risultati fenotipizzazione cellulare per Bils del mouse a 24 ore dopo l'infezione (Figura 3). Leucociti sono state colorate con PerCP-coniugato anti-CD45 del mouse per rilevare le cellule immunitarie, PE-coniugato anti-topo Ly6C / G per rilevare monociti infiammatorie, APC-coniugato anti-topo CD11b e APC-coniugato anti-topo F4/80 per rilevare le cellule di lignaggio monociti. L'analisi è stata eseguita con uno strumento BD FACS Calibur. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Localizzazione anatomica del sito di iniezione. Il sito di iniezione si trova 1 millimetro anteriore al bregma e 1 mm laterale per la sutura sagittale sul lato destro. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Leucociti illustrazione di separazione gradiente di leucociti e Bils. Sono inizialmente raccolti direttamente sotto il livello detriti mielina e sopra il pellet RBC nel gradiente Percoll. Il bianco, strato soffice (Bils) presso l'interfaccia è raccolto dal gradiente di Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immunofenotipo del cervello infilatrating leucociti a 24 ore dopo l'infezione. Leucociti del mouse sono stati isolati dal cervello per centrifugazione differenziale densità del tessuto omogenato preparati con gli animali a 24 ore dopo l'infezione intracranica. Le cellule sono state colorate con anticorpi coniugati contro la fluorescenza-topo CD45, Ly6C / G, CD11b e F4/80. Gating iniziale è stata eseguita tracciando CD45, un marker per le cellule immunitarie, contro la dispersione in avanti (FSC), un indicatore della dimensione della cella (C). L'hi CD45 (A, D), lo CD45 (B, E), e CD45 neg (F, G), le popolazioni sono stati poi analizzati per i livelli di espressione relativa dei marcatori di monociti e macrofagi Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), e CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + CD11b F4/80 + monociti infiammatori sono stati trovati quasi esclusivamente nella popolazione CD45 hi (A, D), in linea con l'infiltrazione di queste cellule dalla periferia. Al contrario, lo Ly6C/G-F4/80 CD11b + macrofagi sono stati trovati quasi esclusivamente nel CD45 lo (B, E) e CD45 neg (G) le popolazioni, coerentemente con un fenotipo residente. In numerosi esperimenti, non abbiamo mai osservato le cellule CD45 hi o Ly6C / G + + CD11b F4/80 + monociti infiammatorie nel cervello dei non infetti o sham-infezioniTed topi (dati non riportati).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Noi abitualmente uso di citometria a flusso per determinare sia la qualità della preparazione infiltrazione delle cellule cerebrali, e per distinguere le diverse popolazioni di cellule immunitarie 2, 9. Al acuta intervalli di tempo, il nostro metodo Bils rese elevate percentuali di monociti infiammatorio all&#39;interno della popolazione CD45hi così come alte percentuali di macrofagi nella popolazione CD45lo. Ciò indica che una risposta immunitaria riproducibile all&#39;interno del cervello possono essere rob...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Ceppo di Daniel </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> a fondo tondo da Oak Ridge centrifuga tubi </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus. </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Tricloroetano 0,4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 15 ml </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 ml di vetro Pyrex marchio Tenbroeck tessuto smerigliatrice </td><td> Pescatore </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 micron filtro cellulare </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml coniche </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS tubi </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> siero fetale bovino </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 ibridomi </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V-piastra inferiore </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra X-22R centrifuga o equivalente </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96-bene secchio piastra e rotore </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Rotore ad angolo fisso </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7,5 </td><td> Albero Star, Inc. </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> clone: ​​30-F11 </td></tr><tr><td> GR1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> clone: ​​RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> clone: ​​M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> clone: ​​BM8 </td></tr></tbody></table>

isolamento di brain-infiltrazione leucociti

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Descriviamo un metodo per la preparazione di leucociti cervello infiltrante (Bils) dai topi. Noi dimostrare come infettare topi con encefalomielite Theiler ha murino virus (TMEV) attraverso una tecnica rapida iniezione intracranica e come purificare un leucociti arricchito popolazione di cellule infiltrati dalla intero cervello. In breve, i topi vengono anestetizzati con isoflurano in una camera chiusa e sono a mano libera iniettato con una siringa Hamilton nella corteccia frontale. I topi sono poi uccisi in vari momenti dopo l&#39;infezione da overdose isoflurano e cervelli interi vengono estratti e omogeneizzato in RPMI con una smerigliatrice tessuto Tenbroeck. Omogenati cerebrali sono centrifugate con una pendenza costante Percoll 30% per rimuovere i detriti cellulari mielina e gli altri. La sospensione cellulare viene quindi filtrato a 40 micron, lavato e centrifugato su un discontinuo Ficoll-Paque Plus. gradiente di selezionare e purificare i leucociti. I leucociti vengono poi lavate e risospese in buffer appropriato per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Citometria a flusso rivela una popolazione di cellule del sistema immunitario innato nelle fasi precoci dell&#39;infezione nei topi C57BL / 6. A 24 ore dopo l&#39;infezione, più sottoinsiemi di cellule immunitarie sono presenti nel Bils, con una popolazione arricchita del Gr1 +, CD11b F4/80 + + e cellule. Pertanto, questo metodo è utile per caratterizzare la risposta immunitaria alle infezioni acute del cervello.

Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

Descriviamo un metodo per la preparazione dei leucociti infiltranti il cervello (BIL) da topi. Dimostriamo come infettare i topi con il virus di Theiler murino...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una popolazione arricchita di leucociti di cellule immunitarie innate dal cervello di topi acutamente infettati con il virus dell'encefalomielite murina o TMEV. Questo viene ottenuto infettando innanzitutto i topi per via intracranica con TMEV. Successivamente, il cervello viene prelevato e omogeneizzato delicatamente 24 ore dopo l'infezione.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'utilizzare un gradiente continuo di perca e un gradiente discontinuo di fol per purificare in modo selettivo lo strato cellulare arricchito in leucociti. Infine, il fenotipo della popolazione di leucociti che infiltrano il cervello e che partecipano alla risposta immunitaria all'infezione acuta del cervello può essere caratterizzato mediante analisi citofluorimetrica. Ciao, mi chiamo Dr. Charles Howe.Il metodo che dimostreremo oggi può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroimmunologia. Ad esempio, quali sono le cellule immunitarie che infiltrano il cervello durante un'infezione acuta? A dimostrare il metodo oggi sarà Reagan, la France.Corey, un tecnologo di ricerca senior del mio laboratorio, per indurre l'infiltrazion

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