Name: Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Scopri la tecnica di crescita per stiramento assonale per l'ingegneria tissutale neurale utilizzando un bioreattore computerizzato. Questo metodo consente velocità di crescita fino a 10 mm al giorno per studiare lo sviluppo nervoso.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF CARRIERA cbet-0747615. Gli autori desiderano ringraziare Drs. Douglas H. Smith e David F. Meaney per il loro mentore e supporto.

1. Panoramica del sistema di bioreattori Stretch Axon crescita <ol><li> Due approcci predominanti sono stati utilizzati per applicare le forze sperimentale ai neuroni. Nel primo approccio, le forze vengono applicate al neurone intero (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Nel secondo approccio, le forze vengono applicate direttamente l'assone tirando il cono di crescita. Con aghi di vetro, quest'ultimo approccio è stato utilizzato per la formazione del nuovo modello di assone (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), individuare soglie vigore per allungamento e retrazione (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992) e di analizzare il clustering neurotrasmettitore nei terminali degli assoni (Siechen, Yang et al 2009).. Un unico estensione ingegneria dei tessuti di questo metodo è stato sviluppato per produrre nervo grande costruisce utilizzando un sistema automatizzato di crescita Stretch Axon (ASG) sistema di bioreattore (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recentemente, abbiamo sviluppato una versione miniaturizzata del sistema bioreattore per lo studio ASG microscopicamente in tempo reale (Loverde, Ozoka et al. 2011). Qui, dettaglio il protocollo di 9 giorni (tabella 1) attualmente in uso per preparare ed eseguire bioreattori ASG di routine. </li><li> Il funzionamento generale: Il sistema bioreattore ASG è costituito da tre componenti principali: 1) una camera bioreattore con corsie indipendenti (allungata pozzi), dove sono coltivate neuroni e allungato, 2) una tabella automatica di movimento lineare di applicare forze stretching e 3) un motore passo passo il controller di unità con il software per controllare la crescita allungare (figura 1). </li><li> In breve, la fabbricazione di prototipi bioreattore è stata effettuata in un negozio di macchine utilizzando una macchina fresatrice verticale (Bridgeport, Elmira, NY). Per la biocompatibilità, la facilità di sterilizzazione e la durata, i componenti interni bioreattore sono stati lavorati da 3 / 8 "(PEEK). Trasparente in policarbonato è stato usato per i coperchi per consentire la microscopia ottica e la visualizzazione delle culture. Anticorrosione 316 viti in acciaio inox e hardware completo l'assemblea (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> La camera di bioreattore è composto da una struttura che si forma si estende 3 corsie, un blocco di traino regolabile che manipola le cellule attraverso i vicoli, e sporgenti barre di traino per la manipolazione esterna (figura 2). Culture neuronali sono placcati su supporti cultura usa e getta Aclar traino sostenuto dal blocco di traino (figure 2 e 3). Un substrato coprioggetto usa e getta stazionario si attacca alla parte inferiore del telaio che si estende e si estende su tutte e 3 le corsie. Prima dello stretching, i neuroni placcato deve estendere i processi assonale dal substrato di traino sul substrato fisso tramite l'estensione del cono di crescita. La popolazione di assoni che colmare il substrati successive cui saranno soggetti tratto dallo spostamento controllo del blocco di traino. </li><li> La tabella automatizzati movimento lineare è costituito da un motore passo-passo (HT23-397, prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA) e la tabella di movimento lineare (MIPS-2-10-1,0 millimetri, servosistemi, Monteville, NJ) montato a una tabella di allineamento in delrin . La camera di bioreattore è seduto nel tavolo parallelo al piano di movimento lineare. Le aste di traino che si estende dalla camera di bioreattore vengono fissati al tavolo movimento lineare utilizzando un adattatore. </li><li> La fase di controllo motore (Si 2035, Prodotti movimento Applicata) è programmato utilizzando il software incluso Si programmatore di controllare la manipolazione dei substrati di traino. Allungamento assonale è applicata in maniera graduale facendo una serie di passaggi di piccola cilindrata distanziati da tempi di permanenza (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Questo sistema computerizzato offre la possibilità di programmare profili personalizzati per l'ASG, ed è essenziale per la continua sperimentazione di diversi giorni o settimane. </li></ol> 2. Preparazione del bioreattore Camera <ol><li> Preparare il substrato della cultura usa e getta di traino e fissi per la cultura neuronale: <ol><li> Substrati cultura traino sono tagliati da 8,5 "x 11" fogli di pellicola Aclar (33C 2,0 milioni, Sonda Struttura, West Chester, PA). Utilizzando una lama affilata tagliare i supporti a circa 0,5 x 2,5 centimetri, o leggermente inferiore alla larghezza delle corsie per consentire almeno 1-2mm distanza su entrambi i lati. </li><li> Carteggiare leggermente inferiore di 1 / 3 ° dei substrati cultura traino sui due lati con belle 1200-grana carta vetrata (McMaster Carr). Levigatura dei substrati traino facilita la crescita degli assoni dai substrati di traino sul substrato coprioggetti fermo. </li><li> Tagliare un 5 x 7 centimetri pezzo di Aclar o utilizzare un 1 coprioggetto di vetro No. servire come substrato fisso (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> ° puliziasubstrati cultura e con una soluzione diluita Alconox e risciacquare abbondantemente con purificata dH 2 O. </li><li> Sterilizzare l'substrati cultura per immersione in etanolo al 70% per 30 minuti. Lasciare i substrati di aria secca all'interno di una cappa sterile coltura di tessuti. </li></ol></li><li> Pulire la camera di bioreattore con diluire Alconox e sterilizzare in autoclave all'interno di un contenitore di autoclave. Immediatamente dopo la sterilizzazione in autoclave, trasferimento in una cappa sterile e lasciare asciugare all'aria. </li><li> Proseguendo all'interno della cappa sterile, colla i substrati cultura al bioreattore utilizzando Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) e punta di tamponi di cotone sterile (McMaster Carr): <ol><li> Con le gambe blocco di traino nella loro posizione verticale pieno, colla i substrati cultura di traino per le gambe blocco di traino nella porzione non levigato. Evitare il contatto con la superficie levigata della cultura. </li><li> Incollare il substrato della cultura stazionaria al fondo della camera bioreattore. </li><li> Togliere la colla in eccesso e bolle d'aria premendo leggermente un bastoncino asciutto contro i substrati incollati. </li><li> Poiché l'acido acetico in silicone RTV liscivie che è tossico per i neuroni, il bioreattore viene lasciato ad asciugare sotto la luce UV all'interno della cappa per 2 giorni interi prima di introdurre le culture neuronali. </li></ol></li><li> Abbassare le gambe blocco di traino per ottenere un 2-3mm sovrapposizione tra le punte delle levigato traino substrati e il substrato fermo. Attenzione cruciali devono essere pagate alla dimensione della sovrapposizione, se è troppo grande, le punte dei substrati trattore possono deviare fuori del substrato fisso, la riduzione del numero di assoni che abbracciano la sovrapposizione (figura 3). </li><li> Posizionare il blocco di traino nella posizione di partenza, con le barre di traino retratto all'interno del bioreattore. Serrare le viti di immobilizzazione per evitare il movimento delle barre di traino prima di allungare la crescita. </li></ol> 3. Culture neuronale <ol><li> 1 ml pool di 10 mg / ml ad alto peso molecolare poli-d-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) nel siero-multimediale gratuito presso l'area substrato interfaccia di ogni corsia. Lasciare che la soluzione di aderire indisturbato per 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare delicatamente 3x con dH 2 O, seguita da un risciacquo finale con terreni di coltura. Pipettaggio dovrebbero essere eseguite sul retro delle corsie, più lontano l'interfaccia substrato. </li><li> Isolare espianti gangli dorsali (DRG) da un ratto E16 cucciolo. Utilizzando uno stereomicroscopio, diluire il espianti in gocce utilizzando piastre Petri. Raccogliere espianti 3-4 con una pipetta 100 microlitri e la piastra sul bordo del substrato levigato cultura traino. Bisogna fare attenzione al piatto del espianti ai margini del substrato di traino con una piccola pozza di media. Fino a 1 ml di terreni di coltura per corsia è sufficiente per evitare l'evaporazione per diverse ore, limitando il movimento del espianti. Mezzi di formulazione: Neurobasal con B + 0,5 mm-27 L-Glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 G / L di D-glucosio (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) e 20 mM FDU + 20 mM inibitori della mitosi uridina (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Fissare il coperchio e trasferire il bioreattore di un incubatore per 1 ora o fino a quando le cellule aderiscono. </li><li> Riempire il bioreattore con terreni di coltura nel punto più lontano della espianti per evitare dislodgment. Incubare il bioreattore per un minimo di 5 giorni mentre i neuroni estendere i processi assonale sul substrato fermo. </li></ol> 4. Axon Stretch crescita <ol><li> Il bioreattore subisce le procedure di preparazione finale all'interno di una cappa sterile: <ol><li> Riempire i serbatoi all'interno del bioreattore con tampone fosfato per umidificare la camera di evaporazione e limite dei terreni di coltura. Nel nostro sistema, la cinta muraria scavata fungono da serbatoi. In alternativa, piccoli coperchi capsula di Petri possono essere collocati su entrambi i lati del blocco di traino in cima alla cultura corsie. </li><li> Sostituire il mezzo di coltura e riempire le corsie di capacità. Pipettaggio dovrebbero essere eseguite sul retro delle corsie, più lontano l'interfaccia substrato. </li></ol></li><li> Sedile del bioreattore all'interno della tabella automatizzati movimento lineare. Se l'esperimento deve essere eseguito all'interno di un incubatore, non deve essere umidificata per corrosione potenziali del tavolo automatico movimento lineare. </li><li> Fissare l'adattatore per asta di traino per le barre di traino. </li><li> Utilizzando il software programmatore Si jog la fase della tabella di movimento lineare per allinearsi con l'adattatore per asta di traino e fissarla sul palco. Per comodità, preparare le sequenze Si Programmatore in anticipo al fine di manipolare la scena con incrementi specifici. </li><li> Allentare le viti immobilizzazione sulla camera di bioreattore a consentire la libera circolazione del blocco di traino. </li><li> Stretch è applicata in maniera graduale iniziando una serie di passi di piccola cilindrata distanziati da tempi di permanenza (Pfister, Iwata et al. 2006). Il nostro paradigma inizia prendendo 2 passi micron ogni 172 secondi,risultante in un tratto netto di 1 millimetro in 24 ore. Dopo un giorno, il tasso di percorso può essere dilagato aumentando o diminuendo lo spostamento del tempo di sosta (tabella 2). </li><li> Una volta ASG è avviata, i cambiamenti dei media non sono normalmente richiesti. Nel corso del tempo, però, la cultura dei media in generale si acida ed è evidente da un cambiamento di colore giallastro. Se la sperimentazione è necessaria un'ulteriore, vecchi media non è mai completamente svuotato, ma solo parzialmente modificati per minimizzare il trauma di assoni galleggiante. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Assonale può subire processi di allungare notevolmente la crescita rapida e robusta. Inizialmente, il processo inizia con un periodo di stretching lento (≤ 1mm/day) che consiste di piccoli spostamenti frequenti. Entro le prime 24 ore di stretching, meccanotrasduzione di percorsi di crescita neuronale si verifica, per cui i neuroni cominciano Oltre al cilindro dell'assone. Entro 24 ore dalla ASG continuo, gli assoni mostrano una aumentata tolleranza verso gli spostamenti maggiori e più frequenti. In generale, gli assoni in grado di sopportare un aumento del tasso tratto di 1mm/day ogni 12-24 ore (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). L'aumento del tasso di allungare troppo presto, però, può portare ad una crescita più rapida degli assoni selezionare, ma anche portare ad occlusione patologica che provoca la disconnessione. Stretch crescita assoni hanno la tendenza a formare fasci, simile all'architettura di fascicoli. Utilizzando protocolli di corrente, la centrale, porzione tratto cresciuta di fasci di assoni non hanno aderenze al substrato culturale. Solo inizialmente aderito, i segmenti prossimale e distale del tratto crescita assoni rimangono attaccati al substrato culturale. Di conseguenza, la parte centrale del tratto assoni cresciuto fluttuare liberamente, e sono sensibili alle interruzioni a causa della manipolazione. Per una serie di motivi, alcuni assoni non possono crescere al tasso tratto applicata. Ad esempio, un neurone DRG con due processi assonale, che sono entrambi in fase di allungamento, non può essere in grado di tradurre le proteine ​​sufficienti e crescere al ritmo tratto applicata. Assoni che non può ospitare il tratto applicata sarà sottile seguente effetto Poisson. Allungamento successivo porterà alla occlusione degli assoni, montaggio inibendo, con conseguente disconnessione patologico. La maggior parte degli assoni, tuttavia, sono in grado di sottoporsi ASG con successo e solo una piccola percentuale di assoni sottoporsi a questo tipo di potatura processo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Sistema Stretch Axon crescita bioreattore. (A) Bioreattore camera di cultura e automatizzato tavolo movimento lineare, (B) Fase motore regolatore e Si programmazione software. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Chamber Cultura bioreattore. Questa vignetta raffigura la camera bioreattore dall'alto con il coperchio rimosso. La posizione del blocco di traino riflette lo stadio finale della crescita degli assoni tratto. Tratto assoni cresciuti può essere visto in fasci all'interno della corsia cultura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Substrato interfaccia Cultura placcatura. Questa vignetta raffigura i componenti del meccanismo di traino all'interno di ogni corsia del bioreattore da vista laterale. (Top) sovrapposizione corretta dei substrati cultura di traino e stazionari. (Basso) sovrapposizione eccessiva dei supporti di traino e stazionaria provoca la punta di un substrato di traino ad arricciarsi. Movie 1. Attaccamento di supporti Cultura Bioreattore Camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 2. Placcatura di DRG Espianti su substrati di traino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 3. Utilizzo SiProgrammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 4. Cono Estensione crescita sul substrato fisso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 5. Crescita Stretch Axon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Clicca qui per guardare il video</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Giorno </td><td> Passo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilizzazione ed asciugatura </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Incollaggio &amp; Assembly </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Rivestimenti e placcatura Cultura neuronale</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Inizio tratto di crescita </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Esperimento Pianificazione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tempo [hr] </td><td> Vota tratto [mm / giorno] </td><td> Tempo di sosta [s] </td><td> Lunghezza totale [mm] </td><td> Time Stretch totale [giorni] </td></tr><tr><td> Pretesa </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Stretch Pianificazione Rate. Tutte le fasi tratto di 2 micron di spostamento (10 punti = 2 motore passo-passo tratto micron).

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

L&#39;ex-vivo allungamento meccanico delle cellule neuronali è brevettato Brevetto US # # 6264944 e 7429267.

A due passi critici devono essere osservate durante la preparazione di bioreattori. In primo luogo, una sovrapposizione ottimale a livello di interfaccia substrato è necessaria per garantire che gli assoni possono attraversare sul substrato fermo. Aclar che è eccessivamente arricciata o meno imperfetta, non deve essere utilizzato (figura 3). Per ottimizzare la sovrapposizione, verificare che il substrato di traino è levigato in modo uniforme e contatti del supporto fisso in modo uniforme su un 2-3mm superficie di contatto a lungo. La sovrapposizione deve essere ottimizzata prima di ogni esperimento con attenzione regolando l&#39;altezza delle gambe di traino. In secondo luogo, pur prevedendo l&#39;attaccamento dei neuroni, rivestimenti substrato di sostenere notevoli forze Sheering causato dallo spostamento della tensione bioreattori e contrattile degli assoni (Heidemann e Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Substrati devono essere risciacquati abbondantemente con acqua sterilizzata sia prima che dopo il rivestimento lisina. Rivestimenti devono essere applicati dalle aliquote appena scongelati e ripartite il più omogeneamente possibile. È importante sottolineare che i substrati non deve essere spostato o comunque disturbato durante il periodo di adesione. In passaggi successivi, evitare il contatto con i substrati durante la placcatura, e seminare tutte le soluzioni dal fondo delle corsie di distanza dal substrato interfaccia. Tolleranze nelle connessioni di ogni componente bioreattore può manifestarsi sotto forma di allentamento. Durante il periodo iniziale di ASG, allentamento del sistema è evidente come il movimento della tavola automatizzati movimento lineare avviene senza il movimento del blocco di traino. Slack può variare per ogni esperimento, ma è tipicamente &lt;1mm nella nostra esperienza. Per questo motivo, un &quot;pre-tensione&quot; fase di eliminazione lasco della 1mm/day, per un giorno, precede il programma di ASG durante il quale le parti bioreattore impegnarsi e iniziare il movimento dei substrati di traino. Risoluzione dei problemi può essere richiesto se il passaggio spostamento del tavolo automatizzati movimento lineare non corrisponde allo spostamento del blocco di traino dopo la fase di pre-tensione è completa. Asincrona, spostamenti imprecisi del blocco di traino sono associati con &#39;stiction&#39; o attrito statico all&#39;interno dell&#39;hardware di traino e la flessione della scheda. Per evitare questi problemi si verifichino, il movimento del blocco di traino devono essere controllati a mano, dopo il montaggio, per il liscio quasi senza sforzo il movimento. Se associazione si verifica, l&#39;assemblea di traino deve essere liberato prima della sperimentazione. Una sufficiente rigidità dell&#39;adattatore è necessario anche per assicurare precisione, gli spostamenti non sono sincroni superato stiction dell&#39;hardware traino.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del componente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> (PEEK) </td><td> McMaster-Carr Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Una soluzione su misura bioreattore da camera </td></tr><tr><td> Policarbonato </td><td> McMaster-Carr Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Una soluzione su misura coperchio della camera bioreattore </td></tr><tr><td> Motore passo-passo </td><td> Prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Movimento lineare tavolo </td><td> Sistemi Servo, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Il controller di unità motore passo-passo </td><td> Prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Struttura della sonda Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Di traino della cultura substrati </td></tr><tr><td> N. 1 coprioggetto </td><td> Cervello Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Cultura substrato stazionario </td></tr><tr><td> Silicone RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi di cotone con punta </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon crescita stretch: il meccanotrasduzione di crescita neuronale

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Durante la pre-sinaptici sviluppo embrionale, i processi neuronali percorrere brevi distanze per raggiungere i loro obiettivi attraverso cono di crescita. Nel corso del tempo, somata neuronali sono separati dai loro terminali degli assoni a causa della crescita scheletrica dell&#39;organismo ingrandimento (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Questo meccanotrasduzione induce una modalità secondaria di crescita neuronale in grado di ospitare continuo allungamento degli assoni (Bray, 1984; Heidemann e Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. La crescita degli assoni Stretch (ASG) è plausibilmente un fattore centrale per la maturazione di processi di breve embrionale nei nervi lungo e tratti di sostanza bianca caratteristica del sistema nervoso adulto. Per studiare ASG in vitro, abbiamo progettato bioreattori per applicare la tensione ai processi brevi assonale di culture neuronali (Loverde, Ozoka et al. 2011). Qui, noi dettaglio i metodi che usiamo per preparare e condurre bioreattori ASG. In primo luogo, all&#39;interno di ogni corsia allungamento del bioreattore, i neuroni sono placcati su uno strato di micro-manipolazione di traino. Successivamente, i neuroni rigenerare i loro processi di assoni, tramite l&#39;estensione del cono di crescita, su un substrato fisso. Infine, la crescita tratto è eseguita da traino i corpi cellulari placcati lontano dai terminali dell&#39;assone aderito al substrato stazionaria; ricapitolando crescita scheletrica dopo l&#39;estensione del cono di crescita. Il lavoro precedente ha dimostrato che di ASG embrionale neuroni dei gangli spinali di ratto sono in grado di tassi di crescita senza precedenti fino a 10mm/day, raggiungendo lunghezze fino a 10 cm, mentre in concomitanza con conseguente aumento diametro assonale (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Questo è in drammatico contrasto con estensione rigenerativa cono di crescita (in assenza di stimoli meccanici), dove i tassi di crescita medi 1mm/day con rigenerazione successo limitato a lunghezze inferiori a 3 cm (Fu e Gordon 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Di conseguenza, un ulteriore studio di ASG può aiutare a svelare i meccanismi di crescita sregolata che limitano la rigenerazione, in assenza di stimoli meccanici.

Un unico metodo di ingegneria dei tessuti è stato sviluppato per allungare le fibre nervose in coltura da numerosi ricapitolando allungare la crescita degli assoni, una forma di crescita del sistema nervoso per cui i nervi allungare in concomitanza con la crescita del corpo ingrandimento.

Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

Durante lo sviluppo embrionale presinaptico, i processi neuronali percorrono brevi distanze per raggiungere i propri bersagli attraverso il cono di crescita. Nel tempo, i somata neuronali...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è applicare una forza di trazione al processo assonale di un neurone al fine di stimolarne e mantenerne la crescita. Questo risultato si ottiene seminando neuroni su un substrato trainato micro-manipolato, controllato da un computer e posizionato all'interno di un reattore. Dopo il seminamento, i neuroni vengono coltivati fino a una settimana, durante la quale gli assoni si estendono su un substrato stazionario mediante l'allungamento del cono di crescita.La successiva crescita assonale per stiramento viene effettuata trainando i corpi cellulari piastrati lontano dai terminali assonali, che aderiscono al substrato stazionario. La tecnica di ingegneria tissutale della crescita assonale per stiramento è in grado di sostenere velocità di crescita fino a 10 millimetri al giorno, producendo fasci vescicolari lunghi e tratti assonali ingranditi, come evidenziato dall'analisi microscopica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come l'estensione mediante corrente di crescita, è che la crescita assonale per stiramento consente di far crescere tratti assonali a qualsiasi lunghezza desiderata in periodi di tempo più brevi.Le implicazioni della crescita assonale per stiramento permettono di ricreare i segnali biomeccanici che stimolano la crescita nervosa. Questi segnali possono essere studiati al fine di sfruttarli e sviluppare nuove strategie per trattare nervi malati o danneggiati. Pertanto, il metodo di crescita assonale per stiramento può contribuire a rispondere a domande fondamentali chiave riguardo lo sviluppo e il mantenimento del sistema nervoso.È importante sottolineare che possiamo esplorare i meccanismi che permettono agli assoni di crescere a velocità superiori a quanto ritenuto possibile in precedenza. Il sistema bioreattore per la crescita assonale mediante stiramento comprende tre componenti principali. In primo luogo, una camera del bioreattore in cui i neuroni vengono coltivati e stirati.In secondo luogo, un tavolo motorizzato a movimento lineare, che applica forze di trazione. Infine, un controller per motore passo-passo con software per controllare l'allungamento. Qui il protocollo viene dimostrato utilizzando un sistema miniaturizzato in grado di funzionare sotto un microscopio.La fabbricazione dei prototipi di biorreattore è stata eseguita utilizzando una fresatrice verticale per garantire la biocompatibilità e la facilità di sterilizzazione della coltura. I componenti della camera sono stati lavorati in polietero chetone (PEEK) resistente alla corrosione e assemblati con tre viti in acciaio inossidabile 16. La camera di coltura del biorreattore contiene un telaio di trazione, un blocco di traino regolabile, aste di traino per la manipolazione esterna e substrati di coltura mobili e fissi monouso.Il tavolo motorizzato per movimento lineare è costituito da un tavolo per movimento lineare con un motore passo-passo montato su un tavolo in delrin. Un programma software chiamato P si programmer viene utilizzato per programmare e monitorare il controllore del motore che si interfaccia con il motore passo-passo. Preparare i substrati per colture di trascinamento tagliando il film LAR in strisce sottili, approssimativamente di 0,5 per 2,5 centimetri.Smerigliare leggermente il terzo inferiore dei substrati di coltura di traino su entrambi i lati, utilizzando carta vetrata fine da 1.200 grana per favorire la crescita degli assoni dai substrati di traino sul substrato stazionario. L'uso di una linguetta divisoria aiuta a smerigliare in modo più uniforme. Ritagliare un pezzo di LAR di cinque per sette centimetri oppure utilizzare un'ampolla di vetro numero uno come substrato stazionario.Pulire i substrati di coltura e la camera del biorreattore con una soluzione diluita di Alcan e risciacquare accuratamente con acqua deionizzata. Sterilizzare i substrati di coltura immergendoli in etanolo al 70% per 30 minuti. Sterilizzare la camera del biorreattore in autoclave all'interno di un contenitore autoclavabile.Dopo la sterilizzazione, trasferire i substrati di coltura e la camera del biorreattore in una cappa a flusso laminare e lasciarli asciugare all'aria. Per l'essiccazione dei substrati di coltura può essere utilizzata una scatola di puntali per pipetta. Inserire i substrati di coltura utilizzando bastoncini di cotone sterili.Incollare i substrati di coltura trainati sulle gambe del blocco di traino. Utilizzando uno strato sottile di silicone RTV, il substrato deve essere incollato sulla porzione non carteggiata, evitando il contatto con la superficie di coltura carteggiata. Successivamente, incollare il substrato di coltura stazionario sul fondo della camera del biorreattore.Rimuovere la colla in eccesso e le bolle d'aria premendo delicatamente un tampone asciutto contro il fondo del substrato stazionario. Lasciare asciugare la camera per due giorni interi all'interno dell'incubatore per colture cellulari. Dopo due giorni, regolare le gambe del blocco di traino in modo da ottenere un sovrapposizione di due-tre millimetri tra le estremità dei substrati di traino standard e il substrato stazionario.È fondamentale prestare particolare attenzione alle dimensioni della sovrapposizione. Se questa è troppo ampia, le punte dei substrati trainati si defletteranno rispetto al substrato stazionario, riducendo il numero di assoni che attraversano la sovrapposizione stessa. Posizionare il blocco di trazione nella posizione iniziale con le aste di trazione completamente rientrate all'interno del bioreattore.Serrare le viti di immobilizzazione per impedire il movimento delle aste di traino. Prima di iniziare la crescita per stiramento, all'interno di una cappa a flusso laminare, prelevare un millilitro di poli-d-lisina ad alto peso molecolare in mezzo privo di siero all'interfaccia substrato di ogni canale. Lasciare riposare la soluzione per un'ora a temperatura ambiente; dopo un'ora, eseguire tre risciacqui con acqua deionizzata, seguiti da un risciacquo finale con mezzo di coltura. Piastrare l'espianato di ganglio della radice dorsale da cuccioli di ratto E16 sui substrati di coltura di traino sabbiati.Utilizzando un microscopio stereoscopico, diluire prima l'esplantato in gocce usando piastre di Petri, quindi raccogliere tre o quattro esplantati con una pipetta da 100 microlitri in una piastra. Posizionare le X piante ai margini del substrato di trapianto in una piccola pozzetta di mezzo fino a un millilitro di coltura. Il mezzo è sufficiente per prevenire l'evaporazione per diverse ore limitando al contempo il movimento degli esplantati.Chiudere il coperchio del biorreattore e trasferirlo in un incubatore per un'ora per consentire alle melanzane di aderire. Dopo un'ora, riempire il biorreattore con il mezzo di coltura nel punto più lontano rispetto alle melanzane, per evitare di staccarle. Incubare il biorreattore per cinque giorni per permettere ai neuroni dei gangli della radice dorsale di estendere i processi assonali sul substrato stazionario.All'interno della cappa a flusso laminare, riempire i serbatoi del biorreattore con soluzione salina tamponata al fosfato per umidificare la camera e ridurre al minimo le aberrazioni del mezzo. Eseguire un ultimo cambio di mezzo riempiendo completamente le canaline del biorreattore. Posizionare il biorreattore sul tavolo motorizzato a movimento lineare all'interno di un incubatore non umidificato.Fissare l'adattatore della barra di traino alle barre di traino. Utilizzando il software Cy programmer, spostare il piatto sul tavolo a movimento lineare per allinearlo con l'adattatore della barra di traino e fissarlo al piatto per comodità.Preparare in anticipo le sequenze del programmatore per manipolare lo stadio in incrementi specifici. Prima di avviare il programma di crescita Axon Stretch, allentare le viti di immobilizzazione sulla camera del bioreattore. Gli stiramenti vengono applicati in modo graduale eseguendo una serie di piccoli passi di spostamento separati da periodi di riposo.Questo paradigma inizia compiendo due passi di un micron ogni 172 secondi, ottenendo una distensione netta di un millimetro nelle prime 24 ore successive alla pre-tensione. Dopo un giorno, la velocità di distensione può essere accelerata aumentando l'ampiezza dello spostamento o riducendo il tempo di riposo. Di seguito sono mostrati risultati rappresentativi del processo di allungamento della crescita dell'assone.I primi cellule all'interno degli impianti piastrati migrano sul substrato trainato. Nel corso dei successivi cinque giorni, i coni di crescita estendono processi assonali sul substrato stazionario. Una volta che i coni di crescita si sono estesi di almeno un millimetro sul substrato stazionario, si inizia la crescita assonale per stiramento.Il substrato di trazione viene manipolato allontanandolo dai coni di crescita del DAE in una serie di passaggi, durante i quali l'elasticità degli assoni attraversanti appare immediatamente evidente mentre vengono stirati. Tipicamente, gli assoni inizialmente si assottigliano, ma entro poche ore entrano in una fase di crescita durante la quale recuperano e mantengono i loro diametri. Entro 24 ore di crescita mediante stiramento continuo, gli assoni mostrano una maggiore tolleranza allo stiramento e sono in grado di sopportare incrementi della velocità di stiramento.Mentre gli assoni crescono ulteriormente e il FAS circola, dimostrano una tolleranza crescente allo stiramento. Qui il galleggiamento degli assoni allungati è evidente quando il biorreattore viene urtato intenzionalmente a mano. Occasionalmente, gli assoni possono staccarsi dal substrato stazionario a causa di un'adesione insufficiente.Questo è l'errore più comune e si verifica più probabilmente se la dimensione iniziale del passo è troppo grande o se il substrato stazionario è stato inadeguatamente rivestito. In questo caso, una parte degli assoni si stacca dal substrato stazionario all'inizio della trazione a causa di una dimensione del passo eccessiva. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale dedicare il giusto tempo alla preparazione dell'interfaccia del substrato.La punta e il substrato dovrebbero sovrapporsi al substrato stazionario di due o tre millimetri, e i gangli della radice dorsale (DRG) dovrebbero essere seminati il più vicino possibile all'interfaccia durante la crescita per trazione. Avrai un'opportunità unica per studiare la crescita degli assoni utilizzando sonde fluorescenti vitali o lisando le cellule mentre si allungano, al fine di analizzare l'espressione genica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la tensione applicata per indurre la crescita dell'assone.Utilizzando questa tecnica, stiamo scoprendo che gli assoni hanno una capacità sorprendente di crescere più rapidamente di quanto ritenuto possibile, e di formare collegamenti che non possono essere ottenuti con nessun altro mezzo.

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Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

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