Tecniche asettiche di laboratorio: Trasferimenti Volume con pipette sierologiche e Micropipettatrici

Questa dimostrazione presenta tecniche di laboratorio asettiche per il trasferimento di volumi mediante pipette serologiche e micropipette sul banco di laboratorio. Lavorare all'interno del campo sterile creato dalla fiamma di un becco Bunsen. Selezionare lo strumento di trasferimento del volume appropriato in base all'applicazione.

Successivamente, utilizzarli correttamente senza comprometterne la sterilità, mantenendo sterili i reagenti e i materiali per colture, aspirando i liquidi con precisione considerati nel loro insieme. Queste procedure sono essenziali per ridurre al minimo le fonti di contaminazione e garantire la precisione nelle sperimentazioni di base. Inizialmente, risulta difficile impostare con precisione e leggere accuratamente gli strumenti, nonché coordinare i movimenti con gli strumenti e i materiali di laboratorio senza compromettere la sterilità dei liquidi trasferiti.

Praticare una tecnica asettica in laboratorio è essenziale per il successo sperimentale quando si lavora con campioni vivi; pertanto, è fondamentale dedicare del tempo all'apprendimento di queste procedure, fino a renderle automatiche. Quando si lavora al banco, il dottor Chris Reddy, il mio coordinatore di laboratorio, illustrerà i protocolli. Lavarsi sempre accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida prima di iniziare qualsiasi procedura di laboratorio. Innanzitutto, bagnare le mani con acqua corrente tiepida.

Quindi applicare e distribuire accuratamente il sapone con energici movimenti. Strofinare le mani generando attrito su tutte le superfici, inclusi i pollici, il dorso delle dita, il dorso delle mani e sotto le unghie. Successivamente risciacquare accuratamente per rimuovere il sapone residuo e asciugare utilizzando salviette di carta erogate da un contenitore.

Infine, utilizzando un tovagliolo di carta pulito, chiudere il rubinetto e sgombrare l'area di lavoro del bancone del laboratorio. Quindi prelevare una salvietta disinfettante pre-umidificata dalla confezione e pulire accuratamente l'intera superficie. Lasciare evaporare il disinfettante utilizzando una fiamma di accensione.

Il becco Bunsen. Regolare la fiamma in modo da ottenere un cono blu al centro. Disporre tutte le forniture necessarie per la procedura vicino al campo sterile del banco di laboratorio.

Inoltre, assicurarsi che tutti i materiali siano correttamente etichettati. Esistono numerose tipologie di pipette serologiche, in plastica o vetro, monouso o riutilizzabili, con o senza filtro. Le diverse dimensioni sono calibrate con filtri che fungono da barriera contro il trabocco della pipetta.

Si noti che le pipette sierologiche sono calibrate anche in due modi diversi. Le pipette TD, contrassegnate con anelli doppi in cima, sono calibrate in modo che il volume presente nella punta non venga erogato. Questo non è mostrato qui, ma le pipette TC devono essere svuotate completamente poiché sono calibrate per erogare tutto il volume, utilizzando una tecnica asettica con una pipetta sierologica di plastica sterile confezionata singolarmente; iniziare dall'estremità tappata e cominciare a staccare con cura la carta.

Non rimuovere l'intero manicotto. Proteggere invece la punta dell'impugnatura della pipetta, coprendo soltanto la parte superiore della pipetta al di sopra dei segni di graduazione, e fissare un ausilio per pipetta, come una pompetta a bulbo o una pistola, all'estremità superiore della pipetta serologica. Tenere l'ausilio per pipetta in una mano e rimuovere con l'altra il manicotto di carta dalla pipetta di plastica.

Per pipette sierologiche in vetro conservate in contenitori metallici, allentare il coperchio del contenitore ed estrarlo, quindi passare la fiamma sulle estremità aperte sia del coperchio che del contenitore. Successivamente, appoggiare il coperchio di lato sul banco disinfettato. Tenere il contenitore in posizione orizzontale e agitarlo leggermente in modo da far uscire le punte di una o due pipette.

Sporgere di circa un pollice. Appoggiare il contenitore su un lato e rimuovere una pipetta senza toccare le altre pipette. Mantenere la punta inferiore della pipetta lontana dal contatto con le mani e con superfici non sterili.

Procedere fissando l'ausilio per pipetta. Quindi passare il terzo inferiore di una pipetta di vetro attraverso il cono blu della fiamma del becco Bunsen per uno a tre secondi. A questo punto rimuovere il tappo della bottiglia contenente il terreno sterile.

Tenerlo tra il dito anulare e il palmo di una mano mentre si manovra l'ausilio per pipetta con il pollice, l'indice e il medio della stessa mano; con l'altra mano, tenere la bottiglia ad un angolo di 45 gradi e far passare il bordo della bottiglia attraverso la fiamma del becco di Bunsen. Inserire la punta sterile della pipetta nel mezzo. Quindi aspirare utilizzando l'ausilio per pipetta, regolando il flusso in base ai segni di graduazione.

Monitorare il volume aspirato nella pipetta per leggere con precisione il volume. Tenere la pipetta in posizione verticale e osservare il menisco del liquido frontalmente, all'altezza degli occhi. Passare nuovamente il bordo della bottiglia attraverso la fiamma del becco Bunsen.

Poi chiuderlo con il tappo. Mettere da parte la bottiglia del mezzo. Prendere quindi un tubo sterile in modo asettico.

Rimuovere il tappo come descritto in precedenza. Creare un campo sterile passando la fiamma sul bordo del tubo. Dispensare il mezzo dalla pipetta nel tubo controllando il flusso del campione in modo che non schizzi.

Flambare il bordo. Nuovamente, sostituire il tappo e mettere da parte il tubo. Ora rimuovere l'ausilio per pipetta, smaltire le pipette di plastica in un contenitore designato per materiali taglienti, immergere le pipette di vetro in una soluzione di candeggina al 10%.

Un micropipettatore consente misurazioni precise e l’erogazione di volumi minuti, utilizzando strumenti di diverse dimensioni per specifici intervalli di volume. Tubi e punte di plastica pre-sterilizzati. Utilizzare inoltre una salvietta disinfettante pre-umidificata per pulire i micropipettatori. Nota.

Il Volter mostra tre cifre da interpretare in relazione al tipo di micropipetta, con un'accuratezza corrispondente alla divisione più piccola. Ad esempio, si noti che la P 20 viene utilizzata per volumi compresi tra 2,0 e 20,0 microlitri. La cifra superiore in nero indica le decine di microlitri.

Il secondo numero nero indica il volume in microlitri. Il numero rosso indica i decimi di microlitro, quindi ogni tacca di graduazione corrisponde a un incremento di 0,02 microlitri. Per prima cosa, ruotare la manopola di regolazione per impostare il volume del dispenser come indicato sul voltaggio numerico.

Quando si riduce il volume sul micropipettatore, ruotare lentamente la rotella con il pollice fino al segno di graduazione desiderato. Quando si aumenta il volume, ruotare in senso orario superando il segno di graduazione desiderato di circa un terzo di giro. Successivamente, ruotare lentamente in senso antiorario la rotella con il pollice fino a raggiungere il volume desiderato.

Utilizzare sempre punte di plastica monouso sterili. Applicare una punta saldamente all'estremità del cilindro della pipetta microlitrica. Premere verso il basso e ruotare leggermente per assicurare una chiusura ermetica.

Tenere la micropipetta in posizione verticale. Si noti che la micropipetta ha tre posizioni: posizione di riposo, primo arresto e secondo arresto.

Premere il pulsante sulla siringa dalla posizione di riposo fino al primo arresto per spostare una quantità d'aria pari al volume impostato. Immergere ora la punta nel liquido mantenendo premuto il pulsante fino al primo arresto. Rilasciare lentamente il pulsante per aspirare il liquido nella punta.

Quando il pulsante torna alla posizione di riposo, attendere il tempo necessario affinché il liquido venga aspirato nella punta. Successivamente, rimuovere la punta dal liquido. Verificare visivamente fino a che punto il liquido è stato aspirato nella punta, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.

Posizionare la punta ad un angolo compreso tra 10 e 45 gradi rispetto alla parete del tubo che riceve il liquido. Ora, premere lentamente il pulsante della siringa fino al primo arresto. Espulsione del liquido.

Dopo un momento, premere il pulsante fino al secondo arresto per espellere qualsiasi residuo di liquido. Alla punta, procedere rimuovendo la punta dal liquido e quindi rilasciare lo stantuffo nella posizione di riposo. Infine, smaltire le punte nel contenitore designato per rifiuti taglienti premendo il pulsante di espulsione sulla micropipetta.

Spegnere innanzitutto il becco Bunsen. Dopo aver riposto tutti i materiali e i reagenti, passare una salvietta disinfettante sulle superfici esterne del LabWare prima di spostarlo nel luogo di conservazione. Successivamente, collocare la vetreria contaminata e i materiali di rifiuto pericolosi negli appositi contenitori di smaltimento.

Pulire nuovamente l'intera area di lavoro, lasciando evaporare il disinfettante. Infine, lavare accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. In assenza di una tecnica asettica, le colture possono risultare contaminate e ciò può ritardare gli esperimenti.

Il trasferimento asettico di liquidi mediante pipette sierologiche è essenziale per l'amplificazione di colture batteriche pure, come questa preparazione di 25 millilitri di e coli. Inoltre, le pipette sierologiche permettono il trasferimento asettico di liquidi in provette sterili. Questo esempio illustra una coltura pura rispetto a una contaminata di e coli nel trasferimento punto-punto di terreno alle provette.

A volte sono richiesti volumi precisi. In questo caso, è evidente un trasferimento impreciso del mezzo. Questo esempio mostra il volume errato di tampone trasferito.

Invece di dispensare 12,5 microlitri, lo studente ne ha dispensati 125. Sebbene i numeri siano impostati in modo identico sul regolatore del volume, è stato selezionato il micro-pipettatore sbagliato per l'operazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe acquisire una conoscenza pratica dell'applicazione della tecnica asettica alle procedure di laboratorio di routine, come il trasferimento di soluzioni e colture mediante pipette serologiche e micro-pipettatori, senza compromettere la loro sterilità.

L'obiettivo è che procedure precauzionali come la fiammatura di vetreria, punte di pipetta, provette e fiasche, nonché il lavoro entro i limiti di un campo sterile sul banco del laboratorio, diventino abituali in ogni esperimento. È inoltre essenziale misurare e dispensare volumi precisi ed accurati durante l'esecuzione degli esperimenti. Imparare a utilizzare correttamente questi strumenti di trasferimento del volume migliorerà l'affidabilità dei risultati sperimentali.