Name: Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri l'imaging in vivo del midollo spinale di topo mediante microscopia a due fotoni. Questo metodo riduce gli artefatti da movimento respiratorio, consentendo studi longitudinali ad alta risoluzione sulle dinamiche cellulari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Multiple Sclerosis Society concedere RG4595A1 / T per DD e il NIH / NINDS concede NS051470, NS052189 e NS066361 alle figure KA e film adattato e / o ristampati da Davalos et al., J Metodi Neurosci. Mar 2008 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, con il permesso di Elsevier.

1. Costruire il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale <ol><li> Ordina la STS-A Narishige Morsetti Compact midollo spinale e la MA-6N Narishige adattatore in mano la testa. </li><li> Design personalizzato e fare una piastra di base in acciaio inox per tenere le due parti Narishige in allineamento in modo che la testa dell'animale è supportato mentre la sua spina dorsale e la coda sono bloccato. Tenete presente che l'intero dispositivo dovrebbe andare bene sotto la lente microscopio di solito su un palco microscopio abbassato. </li></ol> 2. Animal chirurgia <ol><li> Pre-riscaldare la camera di microscopio con un dispositivo di riscaldamento ad aria e mantenerla a 37 ° C. </li><li> Pesare l'animale ed effettuare il mix di anestetico con 100 mg di ketamina, 15 mg e 2,5 xylazina acepromazina mg per kg di peso corporeo, diluito in soluzione di NaCl 0,9% in condizioni di sterilità. </li><li> Anestetizzare l'animale, iniettando l'anestetico mix (KXA) per via intraperitoneale. Pizzicare piedi regolari devono essere eseguiti per garantire l'anestesia profonda in tuttol'esperimento. Supplemento con metà della dose iniziale oraria o, se necessario. </li><li> Utilizzare una piccola piastra elettrica animali per fornire supporto termico durante l'esecuzione della procedura chirurgica. </li><li> Applicare artificiale unguento lacrime sugli occhi per prevenire la disidratazione della cornea e danni. </li><li> Radersi la parte posteriore del primo animale con un dispositivo di taglio e poi con una lama affilata per rimuovere completamente i capelli dalla zona intorno l'incisione. </li><li> Rimuovere i capelli rasati e disinfettare la superficie della pelle rasata con un tampone di alcool. </li><li> Eseguire un piccolo (~ 1,5 cm) incisione longitudinale della pelle sopra il livello desiderato spinale (vertebre toraciche mostrato qui). </li><li> Esporre la muscolatura della schiena ritraendo con cura il tessuto connettivo sottocutaneo. </li><li> Separare con attenzione i muscoli paravertebrali dalla colonna vertebrale al livello desiderato. Eseguire il minor numero di incisioni possibile staccare i muscoli da entrambi i lati di ogni processo spinoso e poi raschiare i muscoli staccò unavia dalla superficie laminare. </li><li> Scegli la lamina che verrà rimosso e preparare i siti di ingresso per i morsetti spinale su entrambi i lati della colonna vertebrale, immediatamente rostrale e caudale alla laminectomia. Con attenzione spostare tessuto muscolare per fare quattro tasche dove i morsetti verrà inserito. </li><li> Sollevare la colonna vertebrale con la dentatura diritta punta pinze per consentire l'inserimento sicuro delle curve punta smussata forbici sotto la lamina senza toccare il midollo spinale. Eseguire la laminectomia lentamente tagliando l'osso da un lato e poi dall'altro lato. </li><li> Utilizzare un tampone di cotone o inserire pretagliati piccoli pezzi Gelfoam assorbibile spugna di gelatina accanto al incisioni di limitare sanguinamento minore. Utilizzare un cauterizer piccolo vaso per controllare l'emorragia ulteriormente se necessario. Usa preriscaldato sterile fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per lavare i tessuti. </li></ol> 3. Stabilizzazione della colonna vertebrale e la preparazione per imaging in vivo <ol><li> Plac e l'animale su una base di elevazione sulla piastra di base del dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e fissare la testa l'adattatore capo azienda. </li><li> Posizionare i morsetti spinale della STS-Un dispositivo lungo la asse anteriore-posteriore dell'animale nel pre-preparati tasche che fiancheggiano il laminectomia (Figura 1). I due morsetti deve essere posizionato con un angolo di circa 45 ° rispetto alla dell'animale asse rostro-caudale per consentire spazio sufficiente per abbassare una lente immersione in acqua oltre il midollo spinale esposti (Figura 1). </li><li> Posizionare il morsetto terzo della STS-Un dispositivo alla base della coda così corpo dell'animale possono essere sospesi in aria dopo la rimozione del tampone elevazione per tutta la durata degli esperimenti di imaging (Figura 1). </li><li> Costruire un piccolo pozzo di Gelseal (Amersham Biosciences Corp.) intorno al midollo spinale esposti a facilitare il mantenimento del midollo spinale in ACSF e l'immersione della lente microscopio in questa soluzione per imaging in vivo. </li></ol>jove_title "&gt; 4. Nel imaging in vivo del midollo spinale di topo con la microscopia a due fotoni <ol><li> Trasferire l'animale sul dispositivo di stabilizzazione spinale all'interno della camera preriscaldato che copre il microscopio e fissarlo su un palco microscopio abbassato posizionando il laminectomia direttamente sotto la lente (Figura 1). </li><li> Inferiore ad acqua immersione lente con attenzione nella soluzione ACSF facendo attenzione che non tocchi i morsetti spinale o il Gelseal. </li><li> Usa epifluorescenza per identificare l'area di interesse e concentrarsi su di esso. Passa alla modalità di scansione laser e di eseguire imaging in vivo utilizzando l'apposito a due fotoni laser a lunghezza d'onda di eccitazione, dicroici e filtri passa-banda per la fluorofori presenti nel tessuto fotografato. </li></ol> 5. Immagini ripetitive e assistenza post-operatoria <ol><li> Alla fine degli esperimenti di imaging, togliere il mouse dal dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e asciugare con cura il Gelseal dalla zona intorno alla laminectomia.Pulire bene la zona. </li><li> Ripristinare e suturare i muscoli della schiena sopra la laminectomia. </li><li> Ripristinare e suturare la pelle sopra la laminectomia, è tampone con Betadine. </li><li> Fornire 1 ml di soluzione lattato Ringers (Baxter Healthcare) come supplemento nutritivo e l'idratazione, così come il trattamento analgesico per via sottocutanea (0,1 mg / kg di buprenorfina). </li><li> Somministrare per via intraperitoneale antisettico trattamento (0,03 ml per il mouse, 2,27% soluzione iniettabile enrofloxacina antibatterici). </li><li> Animale posto su una piastra elettrica fino a pieno recupero dall'anestesia e successivamente casa individualmente. </li><li> Ripetere la somministrazione antisettico giorno per i primi 3-5 giorni dopo l'intervento chirurgico e un trattamento analgesico ogni 8-12 ore per 2-3 giorni dopo l'intervento. Monitoraggio animali al giorno per garantire un comportamento normale e pieno recupero. </li><li> Per re-imaging attraverso la laminectomia stesso, riaprire la pelle suturata e muscoli e ripetere i passaggi descritti nelle sezioni 2 - 4. </li><li> Ri-localizzare la preceously ripreso zona utilizzando i vasi sanguigni come una mappa come descritto in precedenza 10. </li></ol> 6. Rappresentante risultati Tutte le procedure di animali sono state effettuate in base agli orientamenti fissati dal Animal Care istituzionali e dei Comitati Usa presso la University of California, San Francisco e sono conformi alle normative federali. Una foto del dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e uno schema che mostra il posizionamento del mouse sul dispositivo sotto una lente microscopio è mostrato in Figura 1. Lasciando spazio sufficiente per i movimenti respiratori sotto il corpo dell'animale assicura stabile imaging in vivo nel midollo spinale. La figura 2 mostra la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione come è stato ripreso in vivo nel midollo spinale di CX3CR1 GFP / + topi transgenici 18, microglia, in cui sono endogenamente etichettati con GFP. Figura 3 mostra alcuni esempi di ripetitivoimaging in vivo come è stato eseguito nelle stesse aree del midollo spinale nei topi che esprimono una proteina fluorescente negli assoni spinali (YFP-H linea 3) e microglia (nel CX3CR1 GFP / + topi). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Stabilizzazione della colonna vertebrale del mouse per imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni. (A) Una misura piastra di base in acciaio viene utilizzata per supportare e allineare la STS-A Narishige morsetti compatti del midollo spinale e la MA-6N Narishige testa in possesso di adattatore come mostrato qui. (B) Il corretto posizionamento di topi transgenici adulti anestetizzati con un anestetico KXA sul dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale. L'inserto viene illustrata la posizione dei morsetti spinale immediatamente rostralmente e caudalmente alla laminectomia e il tessuto esposto midollo spinale. &lt;img alt = "Figura 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Imaging in vivo ad alta densità di cellule microgliali e dei vasi sanguigni nel midollo spinale di topi anestetizzati. Proiezione ma non allineati z-pile di (A) ad alta densità GFP-positive microglia (verde) nel midollo spinale di una GFP CX3CR1 / mouse + in stretta vicinanza con i vasi sanguigni (rosso, marcato con l'iniezione endovenosa di rodamina destrano). (B) ingrandimento dell'immagine ad alta etichettato come in (A) di una singola cellula della microglia attaccato alla parete di un vaso sanguigno con i processi esteso intorno alla nave e verso il parenchima del midollo spinale. Barre di scala, 10μm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ripetuti negli imaging in vivo dei segmenti stessi assonale e microglia come sono stati trasferiti e re-imaging nel midollo spinale di topi anestetizzati in giorni diversi. (A) YFP-lab assoni forme ai giorni 0 e 5. (B). Le stesse strutture vascolari e cellule della microglia che li circonda ripreso in vivo nel midollo spinale di CX3CR1 GFP / mice + ai giorni 0 e 1. Barre di scala, 10μm. Movie 1. Sequenza Timelapse rappresentante acquisito in vivo dal midollo spinale di topo. Questa sequenza mostra in dettaglio la dinamica sottile processo di microglia (verde) e le loro interazioni con il sistema vascolare (rosso, marcato con rodamina iv iniezione di destrano) nel tempo all'interno di un tessuto densamente popolato con strutture fluorescenti. Le immagini RAW sono stati solo corretti per il rumore di fondo, la luminosità e il contrasto e il film timelapse è stato costruito da z-stack proiettando immagini in sequenza acquisita, senza allineamento dell'immagine, con una media o z-selezione di piani individuali. I vasi sanguigni passare attraverso una serie simile di aerei z come le immagini della microglia. Z profondità aereo: 38 micron.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "&gt; Clicca qui per guardare il film. Movie 2. Sequenza Timelapse dimostrare la stabilità prime del metodo di imaging a livello di un singolo piano z. Rapida acquisizione dello stesso singolo piano z nel midollo spinale di topi GFP CX3CR1 / + immessi sul dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale in anestesia KXA, dimostra cilindrata minima immagine tra fotogrammi consecutivi ad una velocità di scansione di 1 frame / s che è più veloce della frequenza respiratoria del mouse. La cilindrata minore residuo è probabilmente dovuto al battito cardiaco. <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Clicca qui per guardare il film.</a>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
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<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il metodo qui descritto consente di stabile e ripetitivo nel imaging in vivo di densamente popolate strutture fluorescenti cellulari nel midollo spinale di topi anestetizzati utilizzando la microscopia a due fotoni. La stabilità raggiunta è il risultato di un dispositivo su misura di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico che riduce respiratoria indotta artefatto movimento. Il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale permette di respiro sotto il corpo del mous...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Rodamina B destrano </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, diluito in ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamina HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Iniettabili, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA No: 139-236 </td><td> Xylazina iniettabili, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazina </td><td> Vedco </td><td> NADA No: 117-531 </td><td> Iniettabili, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Lacrime artificiali unguento </td><td> Fenice farmaceutico </td><td> NDC No: 57319-760 - 25 </td><td> Lubrificante </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Pescatore </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Forbici </td><td> Mondo di precisione Strumenti </td><td> 555500S </td><td> Curvato, smussato-tip forbici </td></tr><tr><td> Pinza dritta </td><td> Mondo di precisione Strumenti </td><td> 555047FT </td><td> Pinza punta dentata </td></tr><tr><td> Cauterizzare piccoli vasi </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc. </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Compatta del midollo spinale morsetti </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Adattatore tenendo testa </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp. </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lattato </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. </td><td> NDC No: 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorfina, iniettabili </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacina, iniettabili antibatterico 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Riscaldamento pad - Grande </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

imaging in vivo del midollo spinale di topo utilizzo di due fotoni microscopia

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni 1 nei topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere proteine ​​fluorescenti in specifici tipi cellulari 03/02 ha notevolmente ampliato la nostra conoscenza dei processi fisiologici e patologici in numerosi tessuti in vivo 4-7. Negli studi del sistema nervoso centrale (SNC), c&#39;è stata una vasta applicazione di imaging in vivo del cervello, che ha prodotto una pletora di nuove e spesso inattese scoperte sul comportamento delle cellule come i neuroni, astrociti, microglia, in condizioni fisiologiche o patologiche 8-17. Tuttavia, le complicanze per lo più tecnici hanno limitato l&#39;attuazione di imaging in vivo negli studi del midollo spinale del mouse vivente. In particolare, la vicinanza anatomica del midollo spinale ai polmoni e al cuore genera artefatti significativo movimento che rende l&#39;imaging del midollo spinale che vivono un compito impegnativo. </p&gt; Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che supera i limiti intrinseci di imaging del midollo spinale mediante la stabilizzazione della colonna vertebrale, la riduzione delle vie respiratorie indotta da movimenti e facilitando così l&#39;utilizzo della microscopia a due fotoni per l&#39;immagine del midollo spinale del mouse in vivo. Questo si ottiene combinando un dispositivo personalizzato di stabilizzazione vertebrale con un metodo di anestesia profonda, con una conseguente significativa riduzione delle vie respiratorie indotta movimenti. Questo protocollo video mostra come esporre una piccola zona del midollo spinale vivente che può essere mantenuto in condizioni fisiologiche stabili per lunghi periodi di tempo, mantenendo danno tissutale e sanguinamento al minimo. Rappresentante immagini RAW acquisite in dettaglio vivo in alta risoluzione la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione. Una sequenza timelapse mostra il comportamento dinamico dei processi microgliali nel midollo spinale del mouse vivente. Inoltre, una scansione continua della stessa z-frame dimostrares la stabilità eccezionale che questo metodo può raggiungere per generare pile di immagini e / o filmati timelapse che non richiedono l&#39;allineamento dell&#39;immagine post-acquisizione. Infine, ci mostrano come questo metodo può essere usato per rivisitare e re-imaging stessa area del midollo spinale in seguito timepoints, consentendo studi longitudinali in corso di processi fisiologici o patologici in vivo.

Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire ripetitivo<em&gt; In vivo</emL&#39;imaging del midollo&gt; spinale utilizzando la microscopia a due fotoni è descritto. Questo metodo combina un dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico per ridurre al minimo i movimenti respiratori indotti e produrre dati di immagini grezzi che non richiedono l&#39;allineamento o altre post-elaborazione.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

L'imaging in vivo tramite microscopia a due fotoni 1 in topi geneticamente modificati per esprimere proteine fluorescenti in tipi cellulari specifici 2-3 ha...

Lo scopo di questa procedura è eseguire un'immagine stabile in vivo del midollo spinale del topo mediante microscopia a due fotoni. Questo risultato si ottiene innanzitutto anestetizzando l'animale con una miscela anestetica che induce un ritmo respiratorio costante ma tranquillo. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'esporre la colonna vertebrale al livello desiderato ed eseguire quindi una laminectomia per esporre il midollo spinale sottostante, in modo che possa essere visualizzato in vivo.Il terzo passaggio consiste nel posizionare l'animale sul dispositivo di stabilizzazione spinale. L'ultimo passaggio è l'isolamento del segmento di midollo spinale esposto. In previsione dell'immagine in vivo, alla fine si possono ottenere risultati che descrivono il comportamento dinamico delle cellule e le loro interazioni con altri tipi cellulari o strutture nel midollo spinale vivente, mediante imaging in vivo a intervalli di tempo utilizzando la microscopia a due fotoni.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai precedenti tentativi di ottenere immagini del midollo spinale in vivo è che genera dati di imaging in vivo che non richiedono post-elaborazione e possono essere immediatamente valutati e utilizzati per ulteriori analisi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento successivo a lesioni o malattie del midollo spinale, poiché, ad esempio, ci permette di studiare in tempo reale il decorso della degenerazione o rigenerazione assonale dopo una lesione, oltre allo studio della lesione del midollo spinale stessa. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare l'evoluzione di processi infiammatori o neurodegenerativi in modelli animali di malattia, come la sclerosi multipla o la sclerosi laterale amiotrofica, in cui la patologia della malattia è particolarmente evidente nel midollo spinale.Iniziare la procedura pesando l'animale. Successivamente, anestetizzare l'animale iniettando la miscela anestetica per via intraperitoneale. Eseguire regolarmente il test del pizzicamento delle dita dei piedi per assicurare un'anestesia profonda dell'animale durante tutto l'esperimento e integrare con metà della dose iniziale di anestetico ogni ora, o secondo necessità.Applicare quindi l'unguento artificiale per gli occhi sulle palpebre per prevenire la disidratazione e i danni alla cornea. Tagliare i peli sulla schiena dell'animale con un dispositivo per la tosatura e rasare i peli residui con una lama affilata. Dopo aver disinfettato l'area rasata, posizionare l'animale sotto un microscopio e iniziare la procedura effettuando una piccola incisione longitudinale di circa 1,5 centimetri sul livello spinale desiderato.Esponi la muscolatura dorsale ritraendo con attenzione il tessuto connettivo sottocutaneo. Successivamente, separa con cura i muscoli paravertebrali dalla colonna vertebrale al livello desiderato. Pratica il minor numero possibile di incisioni per staccare i muscoli da entrambi i lati di ciascun processo spinoso.Successivamente, raschiare i muscoli staccati dalla superficie del laminato. Utilizzare un cauterizzatore per piccoli vasi per controllare eventuali sanguinamenti minori, se necessario. Continuare a raschiare i muscoli finché non si è esposto sufficientemente il laminato sottostante e si riesce a identificare chiaramente quello che si intende rimuovere.Per preparare i siti di inserimento delle pinze spinali su ciascun lato della colonna vertebrale, inserire le punte di un paio di forbici curve tra i muscoli paravertebrali e spostare con attenzione il tessuto muscolare per creare quattro tasche in cui verranno inserite le pinze. Sollevare la colonna vertebrale con la pinza ad ago dritta per consentire l'inserimento sicuro delle forbici curve con punta ottusa sotto la lamina senza toccare il midollo spinale. Procedere quindi alla laminectomia tagliando lentamente l'osso prima da un lato e poi dall'altro; utilizzare un bastoncino di cotone o inserire un piccolo pezzo pretagliato di spugna emostatica in gelatina assorbibile accanto all'incisione per limitare eventuali sanguinamenti minori.In seguito, utilizzare il fluido cerebrospinale artificiale sterile preriscaldato per lavare il tessuto. Un dispositivo di stabilizzazione spinale &egrave; stato progettato su misura con i componenti principali costituiti dalle pinze per midollo spinale del complesso Nagate STSA e dall'adattatore per il fissaggio della testa Nagate MA six N. &Egrave; stata realizzata una piastra di base in acciaio inossidabile per mantenere allineate due parti naga, in modo da sostenere la testa dell'animale mentre la colonna vertebrale e la coda sono bloccate.Tenere presente che l'intero dispositivo deve essere posizionato sotto l'obiettivo del microscopio con lo stadio abbassato, per stabilizzare l'animale. Posizionarlo prima su un supporto rialzato situato sulla piastra di base del dispositivo di stabilizzazione spinale. Dopo aver fissato la testa nell'adattatore di bloccaggio, posizionare la pinza spinale del dispositivo SDSA lungo l'asse anteroposteriore dell'animale nelle tasche precedentemente preparate, ai lati della laminectomia.Posizionare le due pinze a un angolo di circa 45 gradi rispetto all'asse cordale ROS dell'animale per permettere spazio sufficiente per abbassare la lente a immersione in acqua sulla midolla spinale esposta. Successivamente, posizionare la terza pinza alla base della coda in modo che il corpo dell'animale possa essere sospeso dopo la rimozione del cuscinetto di sollevamento durante l'esperimento di imaging. Poi, creare un piccolo pozzetto di sigillante in gel attorno alla midolla spinale esposta per facilitare il mantenimento della midolla spinale in un liquido CSF.Rimuovere quindi il cuscino di sollevamento quando si è pronti per iniziare l'imaging in vivo, portare il dispositivo di stabilizzazione nella camera del microscopio preriscaldata e posizionarlo sul piano del microscopio abbassato. Assicurarsi di allineare la laminectomia con l'obiettivo. Abbassare con cura l'obiettivo a immersione in acqua nella soluzione di LCR, e verificare che non entri in contatto con le pinze spinali o con il sigillo di gel.Utilizzare la fluorescenza episcopica per identificare l'area di interesse e successivamente mettere a fuoco su di essa. Passare alla modalità di scansione laser ed eseguire l'imaging in vivo utilizzando l'eccitazione laser a due fotoni, la lunghezza d'onda, i dicromatici e i filtri passa-banda appropriati per i fluorocromi presenti nel tessuto da immagine. Al termine degli esperimenti di imaging, rimuovere l'animale dal dispositivo di stabilizzazione spinale.Pulire con attenzione il sigillo del gel dalla zona intorno alla laminectomia e disinfettarla. Suturare accuratamente i muscoli dorsali sopra la laminectomia. Quindi suturare l'incisione cutanea e tamponarla con Betadine, mostrato qui come proiezione di immagini di Zack, come erano state acquisite in vivo e successivamente proiettate lungo l'asse Z senza allineamento delle immagini.L'immagine mostra cellule microgliali positivie per GFP altamente dense in verde, in stretta prossimità con vasi sanguigni in rosso nel midollo spinale. Questa è un'immagine ad alto ingrandimento di una singola cellula microgliale attaccata alla parete di un vaso sanguigno, che mostra in dettaglio alcuni dei suoi prolungamenti estesi attorno al vaso e altri diretti verso il parenchima del midollo spinale. Questo è un esempio di imaging ripetitivo in vivo degli stessi segmenti assonali marcati con YFP, come sono stati ritrovati e reimaginggati nel midollo spinale dello stesso topo della linea YFPH in due sessioni diverse a distanza di cinque giorni. Questo è un altro esempio di imaging ripetitivo che mostra le stesse strutture vascolari e cellule microgliali imaginggate in vivo nel midollo spinale in due giorni consecutivi.Di seguito è riportata una sequenza rappresentativa a intervalli di tempo acquisita in vivo dal midollo spinale. Questa sequenza mostra in dettaglio il comportamento dinamico dei fini prolungamenti delle cellule microgliali in verde e le loro interazioni con la vascolarizzazione in rosso. Nel tempo, le immagini grezze sono state corrette soltanto per il rumore di fondo, la luminosità e il contrasto, e il filmato a intervalli di tempo è stato costruito mediante scarto sequenziale di pile di immagini senza allineamento delle immagini.Facenti la media di una selezione australiana di piani individuali, i vasi sanguigni attraversano un intervallo simile di piani Z rispetto alle immagini della microglia. La profondità del volume dell'immagine è di 38 micron. Questa è una sequenza a intervalli di tempo che mostra la stabilità del metodo di imaging a livello di un singolo piano Z.L'acquisizione rapida dello stesso singolo piano Z nel midollo spinale di un topo eterozigote CX tre, CR uno GFP anestetizzato con la miscela KXA e posizionato sul dispositivo di stabilizzazione spinale dimostra uno spostamento minimo dell'immagine tra frame consecutivi. In particolare, la frequenza di questa sequenza era di un frame al secondo, più rapida rispetto alla frequenza respiratoria del topo. Lo spostamento residuo minore è probabilmente dovuto al battito cardiaco dell'animale.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di limitare il numero di incisioni al minimo e cercare di arrestare qualsiasi lieve sanguinamento non appena si verifica. Ora, dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'immagine stabile in vivo nel cordone ombelicale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni.

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