Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere e colorare gli emociti dai zanzare. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando un piccolo volume di diluente anticoagulante in zanzare raffreddate. Per staccare gli emociti e portare tutti gli emociti in soluzione.

Il secondo passaggio della procedura consiste nel rimuovere le zampe, le ali e l'apice dell'addome della zanzara. In terzo luogo, un diluente fresco viene iniettato in un sito separato della zanzara per avviare il processo di perfusione. L'ultimo passaggio consiste nell'indirizzare l'emolinfa diluita su un vetrino preparato in modo che gli emociti raccolti possano essere fissati e colorati.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i principali tipi e il numero di emositi presenti nella specie di zanzara di interesse mediante microscopia ottica di base. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la profusione, è che combina la semplicità della profusione con l'accuratezza ottenuta dai metodi ad alta iniezione, ma con meno passaggi per raggiungere l'obiettivo finale. Il nostro obiettivo è identificare i tipi di emociti e la loro abbondanza in risposta a sfide immunitarie.

Dimostra questa tecnica Amina Abdul Kum, una studentessa universitaria del mio laboratorio. Prima di iniziare il protocollo, preparare la soluzione diluente per emolinfa in aliquote da un millilitro. Conservarle a meno 20 gradi Celsius e non ricongelare alcuna porzione non utilizzata di un'aliquota.

Ora su vetrini da microscopio spessi un millimetro tracciare cerchi di un centimetro. È necessario un vetrino per ogni zanzara. Preparare gli aghi tirati.

Rompere la punta di ogni ago tirato per creare un'apertura nell'ago. Assemblare un ago nel suo supporto, che è collegato ai componenti del tubo e della siringa di un microiniettore. Successivamente, rimuovere le bolle d'aria dall'insieme costituito da tubo e supporto dell'ago utilizzando olio minerale.

Si aspira l'olio minerale con questa siringa manuale e si verifica di non introdurre bolle d'aria. Si posiziona un oggetto sotto l'ago per raccogliere l'olio che potrebbe gocciolare. Si apre questa parte del microiniettore e quindi si inserisce l'olio al suo interno per eliminare eventuali bolle d'aria.

E questo si aggancia semplicemente a questa siringa manuale proprio come fa con l'altra punta. Iniettare lentamente l'olio minerale in modo che attraversi il tubo di plastica ed elimini eventuali bolle d'aria presenti. Quindi, riempire nuovamente eccessivamente la parte superiore con olio minerale fino a quando non inizia a gocciolare.

Quindi è necessario ricollegare il tutto alla siringa di vetro in modo da non formare bolle d'aria. Successivamente, riempire nuovamente i componenti assemblati con olio minerale fino a quando tutta la tubatura dell'ago e la siringa non saranno completamente riempite. Il microiniettore è ora pronto per essere utilizzato per la somministrazione del diluente.

Successivamente, preparare gli animali aspirando 15 femmine adulte in un piccolo contenitore solido che verrà completamente immerso nel ghiaccio. I moscerini vengono anestetizzati quando sono immobilizzati dal freddo, il che di solito richiede otto minuti o meno. Posizionare un singolo moscerino anestetizzato su un vetrino con cavità in cui avverrà la microiniezione.

Al microscopio, aspirare 12 microlitri di diluente emolinfa nella micropipetta. Fissare delicatamente la zanzara sotto il microscopio con pinzette ed iniettare da tre a 3,5 microlitri di diluente. Tra il settimo e l'ottavo segmento addominale, l'addome si gonfierà.

Mentre il diluente viene iniettato, è possibile iniettare tre zanzare. Prima di ricaricare la micropipetta, collocare tutte le zanzare iniettate in un bicchiere di plastica pulito posto sul ghiaccio, dove le zanzare si riprenderanno per circa cinque minuti. Durante l'incubazione, il diluente anticoagulante stacca gli emoicti aderenti ai tessuti interni.

Mentre il primo gruppo di animali si riposa durante l'incubazione, di solito è possibile iniettare altri tre-cinque zanzare. Trascorsi cinque minuti, mentre sono ancora nel bicchiere, preparare le zanzare iniettate recidendo arti, ali e le estremità degli addomi al livello dell'ottavo segmento con forbici microchirurgiche. Prestare attenzione a non tagliare arti e ali troppo vicino al torace o all'emolinfa.

Il campione potrebbe fuoriuscire. Ora lavare una lamella incisa con etanolo al 70% e asciugarla con un fazzoletto di carta kim sotto il microscopio. Posizionare una zanzara dissezionata sul bordo esterno del cerchio inciso.

Caricare il microiniettore con 12 microlitri di diluente fresco. Tenere la zanzara con pinzette ed iniettare da otto a dieci microlitri nel lato laterale del mesotorace. Prestare attenzione a non iniettare olio minerale dopo questa iniezione.

Il linfa ematica si raccoglierà dall'addome nel cerchio inciso; massaggiare delicatamente l'addome con una pinzetta per indirizzare e favorire il flusso della linfa ematica. A questo punto, lasciare asciugare il linfa ematica raccolto sul vetrino. Questo processo dovrebbe richiedere circa 10 minuti.

È quindi pronto per essere colorato. Colorare ogni vetrino separatamente con Hema tre. Immergere ogni vetrino nel fissativo cinque volte, per un solo secondo per ogni immersione.

Proseguire con tre immersioni di un secondo nella soluzione uno, quindi nella soluzione due. Risciacquare ora solo il retro del vetrino con acqua deionizzata, non il fronte blo. Asciugare il lato frontale, applicare un'immersione con mezzo di montaggio e premere delicatamente il coprioggetto in modo che il mezzo si distribuisca completamente sulla preparazione colorata.

Ora lasciare asciugare il vetrino per un periodo minimo di tre ore per ottenere risultati ottimali. Le cellule colorate devono essere visualizzate e fotografate entro due settimane da questa preparazione. Queste cellule provenienti da femmine adulte sono state identificate utilizzando questo protocollo.

La prima immagine mostra un emoblasto in base alla sua forma piatta e al rapporto nucleo-citoplasma elevato. Questa immagine rappresenta un citoblasto ENO in base alla sua forma piatta e al rapporto citoplasma-nucleo. Infine, questo è un emoblasto di tipo granulocitario.

Presenta una texture più granulare ed è più a forma di OID rispetto ai precedenti metodi di iniezione ad alto volume. Questo protocollo ha prodotto un numero totale simile di ematociti e ha identificato, analogamente, i siti granulari come il tipo cellulare più comune. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora per circa 15-20 zanzare se effettuata correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare correttamente le zanzare con il dent, come raccogliere il loro hemos e quindi come preparare il hemos per la visualizzazione e l'acquisizione di immagini.