Name: Trasferimento Genico per insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara il trasferimento genico per l'insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico suino. Questo metodo riproducibile consente di valutare diverse tecniche di terapia genica cardiaca.

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Questo lavoro è supportato dalla Fondazione Leducq attraverso la rete Caerus (RJH), dal NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 e P20HL100396 (RJH). DL è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Vorremmo ringraziare Lauren Leonardson per l&#39;assistenza tecnica in questo progetto.

1. Infarto miocardico creazione <ol><li> Femmina maiali Yorkshire (20kg) da Animal Industries Biotech (Doylestown, PA) sono pre-medicati con Telazol (tiletamina / zolazepam) (8,0 mg / kg) e Buprenorfina (0,6 mg). </li><li> Gli animali sono intubati e ventilati con ossigeno al 100%. L'anestesia generale viene mantenuta con Propofol (5-8mg/kg/hr) durante tutta la procedura. </li><li> Il sito del femore è preparato con il 70% di alcool isopropilico seguita da iodio povidone. Una puntura percutanea fornisce l'accesso a l'arteria e per il posizionamento della guaina. Dopo l'inserimento della guaina, 3000-5000 UI di eparina viene somministrata per via endovenosa per mantenere un tempo di coagulazione attivato di 250-300 secondi. </li><li> Una dose bolo di amiodarone (75 mg) viene somministrato per via intramuscolare. L'iniezione endovenosa di una borsa da 1000 ml soluzione fisiologica con Amiodarone (75 mg), atropina (2 mg), e acetato di potassio (20 mEq) viene avviato e mantenuto utilizzando un tasso di 150 ml / h per tutta la procedura. </li><li> Un Fr. 7 hockey-stick catetere (Cordis, Miami, FL) è avanzata per l'arteria coronaria sinistra e una angiografia coronarica viene eseguita. A 0,014 pollici filo guida (Abbott Park, IL) è avanzato in discendente anteriore dell'arteria coronarica (LAD). Un 8-mm di lunghezza, 4,0 mm VOYAGER over-the-wire pallone (Abbott Park, IL) è avanzata e posizionato al LAD prossimale, e il palloncino coronarico è gonfiato a 3 atm. Occlusione della discendente anteriore è confermata da angiografia. </li><li> Con elettrocardiogramma continuo e monitoraggio emodinamico, l'occlusione viene mantenuta per 90 minuti. Aritmie ventricolari maligne possono occasionalmente verificarsi entro i primi 40 minuti, nel qual caso la consegna immediata di diretta attuali shock da 200 a 300 J J vengono somministrati. Di solito ci sono due intervalli di tempo di picco di aritmia, uno tra i 2 ei 10 minuti e l'altra tra i 25 ei 35 minuti dopo il gonfiaggio del palloncino. Monitoraggio diligente e defibrillazione immediata sono fondamentali per la creazione di successo infarto miocardico, poiché ci sono oltre il 95% l'incidenza di entrare in fibrillazione ventricolare entro il tempo indicato cornici. Se la defibrillazione immediata e sia eseguito correttamente, il tasso di sopravvivenza è molto alto. Se la pressione sanguigna scende al di sotto di 80 mmHg, il volume di carico si ottiene con una rapida infusione endovenosa salina. </li><li> Il palloncino viene sgonfiato e tutti i dispositivi vengono rimossi. </li><li> La guaina viene rimossa dal arteria femorale, l'anestesia è trattenuto, e l'animale viene monitorato durante il recupero. Salina per via endovenosa con Amiodarone, atropina e infusione acetato di potassio è diminuita a 50 ml / h ed è dato durante la notte. Un iniezioni intramuscolari di Nitroglycerline e Furoscemide viene somministrato. Poi l'animale è permesso di recuperare e attento monitoraggio ECG è continuata per almeno 3 ore. </li><li> Aspirina (200 mg) PO sarà dato per cinque giorni. </li></ol> Comuni complicazioni durante e dopo la procedura di creazione infarto miocardico sono dissezione coronarica, ematoma nel sito di puntura, aritmia e insufficienza cardiaca. Un affinare la tecnica e monitoraggio completo è necessario per prevenire e gestire queste complicanze. 2. Virus iniezione <ol><li> Gli animali sono preparati come sopra indicato nella creazione infarto miocardico steps1-3. La stessa dose di eparina deve essere somministrato a prevenire la trombosi durante l'iniezione del virus. </li><li> Un catetere 5Fr bastone da hockey (Cordis, Miami, FL) è avanzata per l'arteria coronaria sinistra. Dopo l'angiogramma, due di 0,014 pollici fili guida sono avanzati, uno in KOP e uno nella sinistra dell'arteria coronaria circonflessa (LCX) per fissare la posizione del catetere. </li><li> Sangue arterioso (-20 ml) viene prelevato dal catetere. Per evitare che l'ischemia durante l'infusione, la metà del sangue diluito viene utilizzato per la soluzione. Il virus è mescolato con 10 ml di sangue e diluito a 20 ml con soluzione fisiologica. Il restante 10 ml è diluito a 20 ml e usate fornire virus residuo all'interno del lume del catetere. </li><li> Nitroglicerina per via endovenosa (20 mg / min) viene avviato attraverso la vena orecchio. </li><li> La punta del catetere è posizionato a sinistra del tratto prossimale principale. La pressione attraverso il catetere è controllato per garantire che il catetere non è incastro. </li><li> Il sangue del virus misti (15 ml) viene iniettato attraverso il catetere più di 15 minuti usando una pompa per infusione nella coronaria sinistra. Dopo 15 minuti, la siringa è scambiato per il colore, e infusione continua per 10 minuti. </li><li> Un filo e un catetere sono fissati a destra dell'arteria coronaria allo stesso modo di sinistra dell'arteria coronaria. </li><li> Il restante 5 ml di sangue misto con il virus viene iniettato nell'arteria coronaria destra per 5 minuti seguita da 10 minuti di filo. </li></ol> 3. Rappresentante Caso La figura 1 mostra la ventricolografia sinistra a 1 mese dopo la creazione infarto del miocardio. Il movimento della parete ventricolare sinistra è significativamente compromessa con una frazione di eiezione (EF)Il 31%. La figura 2 mostra le sezioni del ventricolo sinistro a 1 mese. Una cicatrice di grandi dimensioni dalla base all'apice della parete anteriore è visto. L'obiettivo EF media a 1 mese dopo infarto miocardico in questo modello è il 36% e il volume diastolico finale medio è di 83 ml, mentre la media di quelli nello stesso animale di dimensioni senza un infarto miocardico è del 68% e 42 ml, rispettivamente. La figura 3 mostra l'espressione di beta-gal nella sinistra zona zona di confine ventricolare 1 mese dopo l'iniezione di virus adeno-associato (2 x 10 12 particelle DNAsi resitant di rAAV1 CMV Lac-Z). Una maggiore espressione è stata trovata nella zona di iniezione del virus. <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Espulsione Figura 1. Frazione misurata dalla ventricolografia sinistra 1 mese dopo la creazione di infarto miocardico. Ventricolo sinistro è dilatato a 92,5 ml e movimento della parete anteriore è significativamente compromessa. <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Le sezioni del ventricolo sinistro a 1 mese dopo la creazione di infarto del miocardio, macchiato da cloruro di trifeniltetrazolo a delineare l'area cicatriziale. Una cicatrice di grandi dimensioni dalla base all'apice della parete anteriore è visto. <img src="/files/ftp_upload/2778/2778fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Beta-gal espressione indotta da virus adeno-associato (2 x 10 12 particelle DNAsi resistenti di CMV rAAV1 Lac-Z). Una maggiore espressione si trova in zona di frontiera tra la zona di infarto e il tessuto normale, 1 mese dopo l'iniezione intracoronarica virus. Foto in basso a destra mostra il controllo negativo, in cui è stata iniettata solo soluzione salina normale nelle arterie coronarie utilizzando lo stesso protocollo.

<ol><li>Perez de Prado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-chest+experimental+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).</li>
<li>Angeli, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+remodeling+after+myocardial+infarction%3A+characterization+of+a+swine+model+on+beta-blocker+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy.</a> Comp Med. 59, 272-279 (2009).</li>
<li>Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &amp, Sidi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+myocardial+stunning+randomly%2C+with+either+propofol+or+isoflurane+following+transient+coronary+occlusion+and+reperfusion+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Card+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs.</a> Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).</li>
<li>Jaski, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+upregulation+by+percutaneous+administration+of+gene+therapy+in+cardiac+disease+%28CUPID+Trial%29%2C+a+first-in-human+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial.</a> J Card Fail. 15, 171-181 (2009).</li>
</ol>

Tutti gli autori non hanno associazioni commerciali che potrebbero rappresentare come un conflitto di interessi in relazione con il manoscritto.

Tra le varie cause di insufficienza cardiaca, ischemia è di gran lunga la più frequente in eziologia. Per superare questa grave malattia, diversi approcci terapeutici sono stati sviluppati. Attente valutazioni delle terapie sono necessarie prima di queste terapie promettenti possono essere applicate alle cliniche. Pertanto, la creazione di un modello di insufficienza cardiaca ischemica che rappresenta le condizioni cliniche dei pazienti è fondamentale per lo sviluppo di terapie insufficienza cardiaca. Il nostro modello ...

<table><tbody><tr><td>Telazol</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>0856-9050-49</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-270-20</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>Amiodarone</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323-616-03</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di atropina</td><td>Med-Pharmex</td><td>54925-063-10</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>American Regent Inc.</td><td>2053-25</td><td></td></tr><tr><td>Nitroglicerina</td><td>American Regent Inc.</td><td>4810-25</td><td></td></tr><tr><td>Salix (Furosemide)</td><td>Intervet Inc.</td><td>710461</td><td></td></tr><tr><td>Catetere da 5 Fr a forma di hockey</td><td>Cordis</td><td>556-278-0L</td><td></td></tr><tr><td>Catetere da 7 Fr a forma di hockey</td><td>Cordis</td><td>778-278-00</td><td></td></tr><tr><td>Filo guida coronarico</td><td>Abbott Laboratories</td><td>1044588</td><td></td></tr><tr><td>Palloncino coronarico</td><td>Abbott Laboratories</td><td>1009447-08</td><td></td></tr><tr><td>Sheath da 8 Fr</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>RSS801</td><td></td></tr></tbody></table>

trasferimento genico per insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Diverse tecnologie emergenti si stanno sviluppando per i pazienti con insufficienza cardiaca. Consolidate valutazioni precliniche sono necessari per determinare la loro efficacia e sicurezza. La terapia genica mediante vettori virali è uno degli approcci più promettenti per il trattamento di malattie cardiache. Consegna virale di vari geni diversi modificando il gene trasportatore è incommensurabile potenziale terapeutico. In questo video, l&#39;intero processo di un modello animale di insufficienza cardiaca creazione seguita da trasferimento di geni è presentato con un modello suina. In primo luogo, infarto del miocardio è stato creato da occlusione della discendente anteriore sinistra prossimale delle arterie coronarie. Rimodellamento cardiaco risultati nell&#39;insufficienza cardiaca cronica. Unico per il nostro modello è una cicatrice abbastanza grande, che rispecchia in pieno i pazienti con grave insufficienza cardiaca che richiedono una terapia aggressiva per i risultati positivi. Dopo infarto miocardico creazione e lo sviluppo di tessuto cicatriziale, una iniezione intracoronarica di virus è dimostrato con simultanea infusione di nitroglicerina. Il nostro metodo d&#39;iniezione prevede il trasferimento di geni semplice ed efficiente con l&#39;espressione genica migliorata. Questa combinazione di un modello di infarto del miocardio suina con consegna intracoronarica virus ha dimostrato di essere una metodologia coerente e riproducibile, che aiuta non solo a testare l&#39;effetto di singoli geni, ma anche di confrontare l&#39;efficacia di molti geni candidati terapeutici.

Un metodo di trasferimento genico per il trattamento dell&#39;insufficienza cardiaca ischemica è descritta utilizzando un modello suino di infarto miocardico. Il nostro metodo semplice e riproducibile ci permette di valutare rapidamente l&#39;efficacia dei trasferimenti di geni diversi, con un modo molto semplice e riproducibile.

Trasferimento Genico per insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico

Diverse tecnologie emergenti sono in fase di sviluppo per i pazienti affetti da insufficienza cardiaca. Sono necessarie valutazioni precliniche consolidate per determinare...

Terapia genica. L'uso di vettori virali è uno degli approcci più promettenti per il trattamento delle malattie cardiache. In questo video vengono presentate le procedure per creare un modello di insufficienza cardiaca ischemica, nonché la somministrazione genica mediante vettore virale.Il primo passo consiste nel creare un infarto miocardico in un modello suino. A tale scopo, un filo coronarico viene introdotto nell'arteria coronaria, seguito da un palloncino di occlusione. Mediante accesso endovascolare, il palloncino verrà gonfiato per occludere completamente l'arteria coronaria.Di conseguenza, si forma un ampio infarto nella zona anteriore e i suini svilupperanno insufficienza cardiaca cronica. Il passo successivo è l'iniezione del virus. I vettori virali vengono iniettati lentamente nell'arteria coronaria.Il virus verrà trasportato dal flusso sanguigno e distribuito nel miocardio. Penetrerà nei cardiomiociti, quindi nel nucleo, e invierà segnali per la produzione di proteine. Le proteine espresse rafforzeranno le prestazioni cardiache e miglioreranno la funzionalità complessiva.In questo video, illustriamo le procedure per la terapia genica nell'insufficienza cardiaca ischemica utilizzando un modello suino. Innanzitutto, mostreremo come indurre un danno miocardico in fase acuta, quindi procederemo a dimostrare il rilascio intracoronarico di un vettore virale. Utilizziamo questa procedura per testare l'efficacia e la sicurezza di diversi trasferimenti genici.Iniziamo. Per iniziare la procedura, si induce l'anestesia nel suino utilizzando telazol. Si stabilisce una linea endovenosa nella vena dell'orecchio, quindi si intuba il suino.Posizionare il maiale in decubito dorsale. Utilizzare propofol per l'anestesia generale durante l'esperimento. Per mantenere la pressione sanguigna, pulire l'area inguinale con alcol seguito da iodio.Coprire la zona con un telo sterile e preparare tutto in modo sterile. Pungere l'arteria femorale con un ago da 18 gauge utilizzando il metodo di Seldinger. Quando si osserva un reflusso pulsatile, inserire il filo guida, quindi posizionare la guaina; dopo l'inserimento della guaina, iniettare eparina per prevenire la formazione di trombi durante l'esperimento.Successivamente, preparare un sacca di soluzione salina contenente 75 milligrammi di amiodarone, 20 milliequivalenti di potassio e 20 milligrammi di atropina, utilizzando una velocità di 150 millilitri all'ora. In questo momento viene somministrata una iniezione intramuscolare di 75 milligrammi di amiodarone. Procedere con il catetere guida nell'ostio dell'arteria coronaria sinistra ed eseguire un'angiografia per verificare l'anatomia coronarica.Inserire con attenzione il filo guida nell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra. Successivamente, avanzare il palloncino lungo il filo guida fino all'interno dell'arteria coronaria. Eseguire un'angiografia per verificare la posizione del palloncino.Deve essere eseguito un altro angiogramma da un angolo diverso per verificare la posizione del palloncino. Successivamente, gonfiare gradualmente il palloncino fino a tre ATM. Eseguire un ulteriore angiogramma per confermare l'occlusione dell'arteria.Monitorare il maiale sia mediante pressione arteriosa che mediante elettrocardiografia. A volte il maiale può andare in fibrillazione ventricolare. Defibrillare il maiale con una scarica di corrente continua il più rapidamente possibile.Se il tentativo fallisce, comprimere il torace fino a quando i caricabatterie del cardioversionatore non sono pronti ed erogare un altro shock. Osservare per 90 minuti e sgonfiare il palloncino. Una volta stabilizzata la pressione arteriosa e l'aritmia, rimuovere la guaina e recuperare il maiale.Somministrare un'iniezione intramuscolare di nitroglicerina e furosemide, nonché una somministrazione notturna di liquidi contenenti amiodarone. Prepararsi con mascherina chirurgica, occhiali protettivi, camice e guanti. Il maiale viene preparato nello stesso modo utilizzato per la creazione dell'infarto miocardico.Inserire un filo coronarico ciascuno nell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra e nell'arteria coronaria circonflessa sinistra. Posizionare un catetere all'ostio. Prelevare 20 millilitri di sangue arterioso utilizzando 10 millilitri per l'iniezione del virus e il resto per il lavaggio.Mescolare il virus con 10 millilitri di sangue e diluire fino a 20 millilitri con soluzione fisiologica. Successivamente, diluire il sangue rimanente con soluzione fisiologica fino a 20 millilitri e suddividerlo in due siringhe. Collegare la siringa contenente il sangue, miscelato con il virus, al catetere e prepararsi per l'infusione.Viene iniziata un'iniezione endovenosa di 20 microgrammi al minuto di nitroglicerina attraverso la vena auricolare, effettuando l'angiogramma per verificare la posizione del catetere. Successivamente, si inizia l'iniezione del virus con una velocità di un millilitro al minuto quando 15 millilitri sono stati iniettati nell'arteria coronaria sinistra. Si sostituisce la siringa con quella per il flush, utilizzando la stessa velocità di iniezione. Dopo l'iniezione nell'arteria coronaria sinistra, lo stesso procedimento verrà eseguito sull'arteria coronaria destra utilizzando i rimanenti cinque millilitri di sangue contenente il virus.Un mese dopo la creazione dell'infarto miocardico, il soggetto svilupperà insufficienza cardiaca con alterato movimento parietale e dilatazione cardiaca. La frazione di eiezione media a un mese dall'infarto miocardico in questo modello è del 36% ed è significativamente più bassa rispetto a quella dei suini di pari dimensioni senza infarto miocardico. Il volume telediastolico medio è di 83 millilitri, mentre il valore medio nel gruppo di controllo è di 42 millilitri.DP DT era anche significativamente più basso nei suini con infarto miocardico. Queste sono sezioni trasversali del ventricolo sinistro. A un mese dall'infarto miocardico, si riscontra una vasta cicatrice che si estende dalla base all'apice della parete interna.Questa immagine mostra l'espressione del gene. Un mese dopo il trasferimento genico mediante un virus associato ai denti, è stata riscontrata un'espressione significativa nell'area in cui era stato iniettato il virus. Vi abbiamo appena mostrato come creare un effetto miocardico in un maiale, nonché come effettuare l'iniezione del virus corona.Questa combinazione di modello di insufficienza I e somministrazione genica rappresenta un metodo semplice e riproducibile per testare diversi tipi di terapie geniche in una malattia progressiva. Grazie per averci guardato e per collaborare con noi nei vostri futuri esperimenti P.

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