Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare quantitativamente il contenuto virale di emoagglutinina e neuraminidasi nei vaccini utilizzando anticorpi mirati agli epitopi conservati. Ciò si ottiene identificando prima gli epitopi conservati. La seconda fase della procedura consiste nel diluire i campioni di riferimento e i campioni di vaccino per migliorare la sensibilità di rilevamento.

Il terzo passo consiste nell'assemblare l'apparato di slot blot e caricare i campioni nelle fessure. La quarta fase della procedura consiste nel rilevare l'HA o il NA sulla membrana utilizzando i rispettivi anticorpi universali. La fase finale della procedura consiste nel quantificare le quantità di HA o NA mediante densitometria.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano HA o NA quantificati rispetto ai rispettivi antigeni di riferimento. Ciao, mi chiamo Anwar Hashem. Sono uno studente di dottorato nel laboratorio del Dr.Sean Lee.

Ciao, mi chiamo Caroline Grab e sono un tecnico nel laboratorio del Dr.Sean Lee presso il Center for Vaccine Evaluation di Health Canada. Oggi dimostreremo una procedura di slot bot utilizzata per quantificare gli antigeni HA e NA dei virus influenzali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunodiffusione radiale singola SRID, o i metodi chimico-fisici, è che non richiede anticorpi specifici per ceppo o sottotipo, contrariamente agli SRID o a strumenti sofisticati come i metodi chimico-fisici.

Inoltre, poiché questi anticorpi prendono di mira gli unici epitopi universalmente conservati di un AR, sono utili come strumenti di ricerca di base per i ricercatori interessati. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché potrebbero incontrare problemi tecnici come la difficoltà di bloccare i campioni di vaccino precipitati, la perdita di campioni tra le fessure e la perdita di vuoto durante la fase di blotting, nonché un elevato background nelle bande diffuse osservato dopo il rilevamento immunologico. Tuttavia, l'attenzione ad alcuni passaggi chiave può aiutare a risolvere questi problemi.

Oggi vi mostreremo la procedura. Quindi iniziamo. Per identificare le regioni conservate, abbiamo utilizzato gli allineamenti del cluster W per analizzare un totale di oltre 6.000 sequenze di influenza A HA da NCBI e abbiamo trovato che l'estremità N della subunità HA due è la regione altamente conservata.

Sono stati calcolati l'entropia di Shannon e il tasso di conservazione per ciascuna posizione dell'amminoacido delle sequenze consenso identificate. L'epitopo UNI one mostrato in rosso è stato scelto per sviluppare un anticorpo universale contro l'HA per il saggio di slot blot. Utilizzando un approccio simile, sono state identificate due sequenze universalmente conservate in tutte le influenze, una NA vicino al sito enzimaticamente attivo e l'altra all'estremità terminale i peptidi con queste sequenze di aminoacidi sono stati utilizzati come antigeni per generare anticorpi universali contro NA per il test di slot blot.

Prima di iniziare la procedura di slot blot, preparare 20 millilitri di quattro soluzione di urea MO in TBS per l'emoagglutinina o lo slot blot HA, o 20 millilitri di una soluzione di ergen allo 0,01% in TBS per la neuraminidasi o NA slot blot, quindi preparare due litri di tampone di lavaggio aggiungendo tra 20 e una soluzione TBS a una concentrazione finale dello 0,1%Successivamente, Preparare 80 millilitri di tampone bloccante sciogliendo il latte scremato in polvere fino a una concentrazione finale del 5% in peso in volume nel tampone di lavaggio. Attivare la membrana PDF e il metanolo per 15 secondi, seguiti da un risciacquo di due minuti in acqua distillata doppia. Immergere la membrana in TBS fino all'utilizzo di tre fogli pre-bagnati di carta da filtro T blot SF in TBS fino a quando gli standard di riferimento del vaccino antinfluenzale con contenuto di HA predeterminato non corrispondevano ai ceppi vaccinali da testare.

Sono stati ottenuti dal Center for Biologics Evaluation and Research negli Stati Uniti o dal National Institute for Biological Standard and Control nel Regno Unito e sono stati utilizzati per la quantificazione di HA o NA mediante slot blot per antigeni di riferimento HA e campioni di vaccini di test. Preparare 650 microlitri di antigene di riferimento HA diluito in quattro TBS di urea al molo alle concentrazioni indicate. Quindi preparare 650 microlitri di campioni di vaccino di prova in quattro TBS di urea mo a tre diverse diluizioni come 10 x, 20 x e 40 x per ottenere una differenza doppia e consentire alle concentrazioni del campione di rientrare nella curva standard per gli antigeni di riferimento NA e i campioni di vaccino di prova.

Preparare 650 microlitri ciascuno degli standard dell'antigene NA in TBS sugen allo 0,01% alle concentrazioni elencate e gli standard dell'antigene sono stati realizzati internamente utilizzando la pagina SDS in combinazione con analisi citometriche dense. Quindi preparare 650 microlitri di campioni di vaccino in TBS sugen allo 0,01% a tre diverse diluizioni come 10 x, 20 x e 40 x per ottenere una differenza doppia e consentire alla concentrazione del campione di rientrare nella curva standard. Assemblare un apparecchio di microfiltrazione bio SF precedentemente pulito e asciugato posizionando la piastra di supporto della guarnizione nel collettore del vuoto e la guarnizione del soffitto sulla parte superiore.

Posizionare i tre fogli di carta da filtro BIO SF umidi sulla guarnizione. Quindi la membrana in PVDF pre-imbevuta. Quindi posizionare la dima del campione sopra la membrana e serrare a mano le quattro viti utilizzando uno schema di incrocio diagonale per garantire un'applicazione uniforme della pressione sulla superficie della membrana Prima di collegare l'apparecchiatura, verificare che la valvola a tre vie sia impostata per esporre il collettore del vuoto alla fonte del vuoto.

Accendere la pompa e collegare l'apparecchio bio dot. Assicurarsi che la valvola di flusso sia posizionata a un livello inferiore ai pozzetti del campione per un drenaggio rapido e corretto dei campioni nei passaggi successivi. Ripetere la fase di serraggio delle viti utilizzando lo schema di incrocio diagonale.

Il serraggio delle viti durante l'applicazione del vuoto garantisce una tenuta più ermetica e previene la contaminazione incrociata tra i pozzetti. Quindi sostituire la valvola di flusso per esporre il collettore del vuoto all'aria e spegnere la pompa. Successivamente, applicare 100 microlitri di TBS su tutti i pozzetti utilizzando un pipettatore multicanale per reidratare la membrana.

Applicare la soluzione al centro del pozzetto il più vicino possibile al fondo per coprire uniformemente la fessura. Utilizzare una punta per pipetta pulita per rimuovere eventuali bolle d'aria introdotte. Sostituire la valvola di flusso per esporre il collettore sia all'aria che al vuoto.

Accendere la pompa e svuotare delicatamente il tampone dai pozzetti mettendo un dito sul poro esposto all'aria per regolare la quantità di vuoto. Quindi sostituire la valvola di flusso per esporre il collettore all'aria. Non appena il tampone è completamente drenato da tutti i pozzi.

Spegnere la pompa o scollegare l'aspirapolvere. Applicare 200 microlitri di ogni diluizione standard o campione di vaccino per pozzetto. Pipettare i campioni, uno alla volta, al centro di ciascun pozzetto, il più vicino possibile al fondo.

Fatto attenzione ad evitare e rimuovere l'aria. Mettere 200 microlitri di tampone di diluizione del campione nei pozzetti inutilizzati per garantire un vuoto adeguato ai pozzetti in uso. Regolare la valvola di flusso per esporre il collettore sia all'aria che al vuoto.

Accendere la pompa del vuoto e lasciare che i campioni defluiscano delicatamente dai pozzetti controllando la quantità di vuoto con un dito sopra il poro esposto all'aria. Rimuovere il dito dalla porta per rilasciare l'aspirapolvere. Non appena tutti i campioni sono stati drenati, immediatamente.

Aggiungere 200 microlitri di TBS a ciascun pozzetto. Utilizzando un pipettatore multicanale, applicare un leggero vuoto per drenare e lavare i pozzetti controllando la quantità di vuoto con un dito sopra la porta esposta all'aria. Ripetere la fase di lavaggio una volta non appena i pozzetti sono completamente svuotati, allentare le viti della dima campione e spegnere l'aspirapolvere per evitare un'asciugatura eccessiva.

I pozzetti procedono immediatamente alla rimozione della membrana e alla messa nel tampone di blocco. Utilizzando una quantità di tampone sufficiente a coprire completamente la membrana. Incubare per una notte a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio.

Dopo l'incubazione notturna e il tampone di blocco. Lavare la membrana due volte come elencato, quindi dondolare per tutti i lavaggi e le incubazioni. Assicurarsi che la membrana sia completamente ricoperta di soluzione.

Successivamente, incubare la membrana con l'anticorpo universale di coniglio uni one contro l'HA o gli anticorpi universali HCA dash due o HCA dash tre per NA diluito in BSA al 5% in peso in volume in tampone di lavaggio per un'ora a temperatura ambiente, diluizioni da uno a 4.000 di antisiero di coniglio hanno dato risultati ottimali per questi anticorpi. Successivamente, lavare la membrana tre volte a temperatura ambiente con un leggero dondolio per 15 minuti ogni volta. Quindi incubare la membrana con una diluizione da uno a 50.000 di anticorpi coniugati anti IgG di capra, perossidasi IgG e tampone bloccante e temperatura ambiente incubata per 30 minuti con un leggero dondolio dopo l'incubazione, lavare la membrana e il tampone di lavaggio tre volte a temperatura ambiente oscillando per 15 minuti ciascuno.

Quindi lavare la membrana con TBS per cinque minuti oscillando delicatamente per rimuovere il detersivo residuo tween 20 dalla superficie della membrana. Successivamente, preparare il substrato di sviluppo utilizzando tre millilitri di ciascun reagente del kit di substrati a lunga durata Super Signal West Dura e mescolare. Posizionare bene la membrana su un fazzoletto di carta asciutta per rimuovere delicatamente il tampone TBS in eccesso prima di trasferirla in un contenitore asciutto e applicare il substrato, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente con un leggero dondolio e rimuovere il substrato in eccesso tamponando.

Al termine, esporre la membrana a un film di chemiluminescenza. La durata dell'esposizione dovrà essere ottimizzata per evitare la saturazione del segnale, ma in genere varia da 10 secondi a 10 minuti. L'analisi della citometria densa sul film sviluppato è stata eseguita utilizzando il sistema di documentazione su gel chimico flora seguendo le istruzioni del produttore.

Calcolare la media dei valori di densità per ciascuna serie di repliche dell'antigene di riferimento e testare i campioni di vaccino. I kit tripli sono necessari per i test di significatività e per valutare l'errore sperimentale. Tracciare i valori medi di densità rispetto alla quantità di antigene HA o NA in ogni slot.

Tratto dalla norma di riferimento. Qui viene mostrato un modello logistico a quattro parametri per i saggi immunologici che utilizza una concentrazione e una densità di vaccino di riferimento per estrapolare la concentrazione del campione dalla densità dei vaccini campione di prova utilizzando un approccio di adattamento della curva di regressione non lineare a pendenza variabile. Il grafico PRISM viene utilizzato per tracciare le curve standard e ottenere concentrazioni dai dati di densità ottenuti come mostrato qui.

L'anticorpo universale HA UNI one ha dimostrato una notevole specificità per le sequenze virali ed è in grado di legarsi a 13 diversi sottotipi di influenza. Un HA estratto da fluidi toici otorinolaringoiatrici di uova di gallina embrionate infettate da virus. La proteina NP è il controllo del carico.

Il controllo negativo è il liquido toico otorinolaringoiatrico da uova non infette e il controllo positivo è uno standard di riferimento di H one da N-I-B-S-C. Le differenze osservate nella mobilità delle proteine HA sono probabilmente dovute a variazioni nelle loro dimensioni e/o nello stadio di lavorazione. Come mostrato qui, gli anticorpi HCA dash due e HCA dash tre contro entrambi gli epitopi conservati di NA erano in grado di legarsi a tutti e nove i sottotipi di NA e hanno mostrato pochissima reattività crociata ad Alan Toic o alle proteine cellulari e il controllo della proteina P è mostrato nel pannello C. Il controllo positivo è il fluido Alan Toic addizionato con R NA uno di una fetta nuova caledonia slash 20 slash 99 e sondato con il corrispondente Il controllo della proteina NP degli antisieri è mostrato in basso.

Questa immagine mostra risultati rappresentativi simili a quelli dell'HA della quantificazione, dell'antigene NA nello standard di riferimento per il vaccino antinfluenzale e nei campioni di vaccino. L'analisi della densità ha mostrato che l'intensità del segnale ottenuto rilevando l'antigene NA in varie diluizioni di uno standard di riferimento per vaccini mediante slot blot è proporzionale alla concentrazione di na. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di pretrattare i campioni di vaccino per sciogliere i materiali sedimentati e garantire un corretto drenaggio dalla fessura.

È inoltre necessario prestare molta attenzione per evitare perdite di campioni tra i pozzetti. L'ottimizzazione delle diluizioni degli anticorpi e dei tempi di incubazione può essere necessaria affinché qualsiasi nuovo anticorpo utilizzato per il rilevamento ottenga segnali nitidi di intensità ideali, riducendo al minimo il background dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati nel campo della ricerca sui vaccini antinfluenzali.

Ulteriori analisi quantitative future degli antigeni HA e NA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare le importanti proteine di superficie dei virus influenzali in semplici saggi senza l'uso di anticorpi specifici per ceppo.