Name: Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Scopri una tecnica non invasiva per campionare peli di pica americano, ottenendo DNA di alta qualità per studi di genetica della conservazione. Questo metodo minimizza l'impatto sugli animali elusivi.

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Vorremmo ringraziare L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst e D. Kuch per l&#39;assistenza sul campo. K. Galbreath gentilmente fornito campioni di fegato pika dalla Bella Coola valle. Grazie ad A. Gonçalves da Silva e K. Larsen per interessanti discussioni che hanno contribuito alla progettazione di questo metodo non invasivo di campionamento genetico. Questo lavoro è stato finanziato dalla scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada Discovery, e UBC Okanagan borse di ricerca individuali a marzo Il Fondo nazionale svizzero di Dottorato Fellowship Foundation PBSKP3_128523 supportato PH. Questo studio è stato intrapreso a seguito del protocollo di cura degli animali presso la University of British Columbia (numero del certificato: A07-0126).

1. Capelli rullante Prima della creazione di una trappola, una posizione ideale deve essere determinato entro l'habitat pika o scarpata. Questo include mucchi di fieno, che sono cache vegetazione che gli animali raccolgono a fine estate così come escrementi freschi trovati in siti latrina. Strisce di nastro di imballaggio (10-50cm di lunghezza) sono arrotolate per fornire a 360 ° appiccicoso superficie e sono disposti in una web-come il modo di busta l'ingresso al mucchio di fieno del pika (Fig. 1) o sito latrina. A seconda della configurazione delle rocce, un pezzo di filo da pesca può essere utilizzato per sostenere la struttura dal laccio dei capelli, ma questo spesso non è necessario quando le entrate sono molto piccole (30cm &lt;di diametro), una descrizione completa dell'uso di linea di pesca si trovano in Henry e Russello (2010) 3. Insidie ​​capelli vengono controllati più spesso possibile, e campioni di capelli depositato sul nastro (Fig. 2) vengono poi raccolti ed etichettati. Una volta trasportato al laboratorio, i peli vengono rimossi dal nastro adesivo con pinza sterile e trasferiti in tubi criogenici e conservati a -20 ° C fino a ulteriori manipolazioni. Campioni di capelli raggruppati insieme lungo un laccio dei capelli sono considerate appartenenti ad un singolo individuo, mentre i campioni raggruppati in modo indipendente si presume che appartengono a persone diverse. In quest'ultimo caso, il pelo è poi messo in tubi diversi. Queste ipotesi possono poi essere sperimentato nell'ambito di impronte digitali del DNA e calcoli delle probabilità di identità basata su microsatellite dati genotipici. 2. Estrazione del DNA Poiché i capelli pika è molto sottile e contiene una piccola lampadina di radice, abbiamo precedentemente dimostrato che un minimo di 25 peli sono necessari per ottenere quantità sufficienti di DNA per una buona qualità di amplificazione a valle della PCR 3. Abbiamo usato il DNA del sistema IQ (Promega, Madison, WI, USA) e una versione leggermente modificata di istruzioni del produttore per l'isolamento di DNA da campioni di capelli. In primo luogo, il campione di capelli è filato giù in una micro-centrifuga al fine di evitare la perdita dei capelli durante l'apertura del tubo. Allora la soluzione di incubazione è preparata mescolando 80 ml di soluzione di incubazione con 10μl di DTT (1M) e 10μl di proteinasi K (18ng/ml) per portare a una concentrazione finale di 0,1 M DTT e 1.8ng/ml di incubazione proteinasi K. soluzione (100 l) viene aggiunto al campione e incubare a 56 ° C per 1 ora. Nel frattempo, la soluzione di lisi è preparata con l'aggiunta di 1 ml di DTT (1M) per ogni 100 microlitri di tampone di lisi, con una conseguente concentrazione DTT finale di 0.01M. Soluzione di lisi preparata (200 microlitri) viene poi aggiunto il campione, insieme con 7 ml di resina DNA IQ, in agitazione per 3 secondi ad alta velocità e incubate a temperatura ambiente per 5 minuti. Il campione viene quindi in agitazione per 2 secondi e inserito nel supporto magnetico, in cui la separazione delle sfere magnetiche dalla soluzione si verifica. La soluzione rimanente viene poi aspirato ed eliminato, facendo attenzione a non disturbare il pellet di resina magnetica. Il campione viene quindi trattato con 100 microlitri della soluzione di lisi preparata, agitazione orizzontale e restituito al supporto magnetico in cui la separazione si verifica nuovamente. Il buffer di lisi è aspirato ed eliminato, e questo passo è ripetuto tre volte con un tampone di lavaggio (100 l). Il campione viene poi lasciato ad asciugare nello stand magnetico per 15 minuti. Una volta asciutto, 100 ml di tampone di eluizione è aggiunto al campione e incubare a 65 ° C per 5 minuti. Il campione è in agitazione e inserito nel supporto magnetico. La soluzione che ora contiene il DNA eluito è poi trasferito in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e conservati a -20 ° C fino a ulteriori manipolazioni. DNA da campioni di fegato è stato anche estratto con il sistema IQ DNA e utilizzato come controllo positivo per amplificazioni PCR. 3. Amplificazione PCR Il DNA ottenuto dal nostro rullante capelli non invasivo e campioni di fegato sono stati poi utilizzati per amplificare una suite di uso comune marcatori molecolari (microsatelliti, AFLP, mitocondriale citocromo B e ZFX / ZFY marcatore sexing). PCR sono state eseguite utilizzando un Veriti termociclatore (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in un volume di 25 microlitri contenente: 10 - 20 ng di DNA, 0,5 mM di ciascun primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 mM dNTPs, 10 μ albumina sierica bovina (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e 0,5 U AmpliTaq DNA polimerasi Gold (Applied Biosystems). Parametri di ciclismo per i loci microsatelliti sono stati ottimizzati utilizzando un programma di ciclismo touchdown (10 min a 95 ° C, 35 cicli a 95 ° C per 30 s, 30 s ricottura, e 45 s a 72 ° C, seguita da una fase finale a 72 ° C per 10 min). La temperatura di annealing è diminuita di 1 ° C ogni ciclo di 60-55 ° C fino a raggiungere il sesto ciclo, a questo punto le 29 rimanenti cicli continuato a 55 ° C. Parametri di ciclismo per i frammenti mitocondriale sono state come sopra descritto, ma consisteva di 35 cicli con una ricotturatemperatura di 50 ° C. Amplificato polimorfismo della lunghezza dei frammenti è stata intrapresa a seguito del protocollo di genomi dei vertebrati descritto da Bonin 4. Infine, sessaggio molecolare è stata effettuata utilizzando la PCR-RFLP di ZFX / ZFY loci digestione con enzimi di restrizione HinfI 5. I prodotti PCR dal, AFLPs microsatelliti e sequenze del citocromo B sono stati eseguiti su un analizzatore genetico ABI 3130XL (Applied Biosystems), mentre digerito ZFX / ZFX frammenti sono stati eseguiti lungo una scala 100 bp (New England Biolabs) su un 3% gel contenente 2,5% gel DNA SYBR Safe. macchia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e visualizzati utilizzando un sistema di imaging ROSSO personale gel (Alpha Innotech, San Leandro, California, USA) Microsatelliti e AFLPs sono state visualizzate mediante Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) e il cromatogramma DNA mitocondriale è stata osservata con Sequencher v4.7 (Gene Codice Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Rappresentante risultati Il DNA estratto da campioni di capelli ottenuto con il nostro rullante non invasiva sono stati utilizzati per amplificare PCR vari tipi di marcatori molecolari. Come base per il confronto, usando campioni di DNA estratto di fegato è stato amplificato insieme ai nostri campioni di capelli. Nucleare loci microsatelliti sono stati amplificati con successo sia per i capelli e campioni di fegato (Fig. 3). Anche se l'intensità del segnale era maggiore quando si utilizzano i campioni di fegato, questo non ha avuto un effetto negativo sul punteggio genotipo (Fig. 3). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando AFLPs (Fig. 4), sequenze di DNA mitocondriale (Fig. 5), e il ZFX / ZFY marcatore sessaggio molecolare (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un esempio di trappola capelli non invasivo istituito presso un mucchio di fieno. Strisce di nastro adesivo trasparente arrotolato imballaggio sono disposti in un web-come la moda di allegare l'ingresso del mucchio di fieno. Un pezzo di filo da pesca è qui usato per fornire sostegno supplementare per il rullante capelli. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Una trappola capelli successo contenente un gran numero di capelli attaccati al nastro di imballaggio. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un cromatogramma rappresentativo microsatelliti nucleari (Ocp6) 8 che vedi nell'immagine Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, ed è eterozigote (354/358) a questo locus. Il cromatogramma basso rappresenta un individuo diverso che presentano un genotipo eterozigote (358/362) a base di DNA estratto da peli. Mentre il segnale del cromatogramma dal campione dei capelli ha una minore intensità rispetto al campione di fegato, segnando genotipo non è pregiudicata da questa differenza di segnale. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. AFLP un cromatogramma rappresentativo (E31T32) come mostrato in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, il cromatogramma basso rappresenta il DNA estratto dai capelli. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Un rappresentante cromatogramma sequenza del DNA mitocondriale (citocromo B) come mostrato in Sequencher v4.7 (Gene Codice Corporation). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, il cromatogramma basso rappresenta il DNA estratto dai capelli. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Un indicatore rappresentativo sessaggio molecolare (ZFX / ZFY), amplificata sia per fegato e campioni di capelli. Questo approccio si basa sull'osservazione che il cromosoma Y possiede un sito di restrizione HinfI in questa regione del cromosoma X che manca. Quindi, le femmine producono due co-migrazione dei frammenti di 432 bp, mentre i maschi producono frammenti di 432 bp, 261 bp e 171 bp.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
<li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size%2C+natal+philopatry%2C+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+%28Aquila+heliaca%29+in+central+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li>
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<li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Wildlife+Res%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li>
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<li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+European+rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus%29%2C+European+brown+hares+%28Lepus+europaeus%29+and+mountain+hares+%28Lepus+timidus%29+with+ZFX+and+ZFY+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Wildl.+Res%22%5BJournal%5D)">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li>
<li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demographic+monitoring+of+an+entire+species+%28the+northern+hairy-nosed+wombat%2C+Lasiorhinus+krefftii%29+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il campionamento non invasivo genetica è diventata una valida alternativa ai tradizionali metodi di cattura dal vivo per diversi motivi. In primo luogo, discretamente raccolta di materiale biologico (ad esempio, le feci, peli, piume, saliva e muco) da popolazioni selvatiche, i ricercatori possono studiare senza disturbare queste specie, la gestione, o anche l&#39;osservazione, riducendo così i rischi sia per gli animali e ricercatori. In secondo luogo, il campionamento non invasivo genetica permette ai biologi di studiare le popolazioni di specie elusive e rare, un compito che può rivelarsi difficile con la più tradizionale live-trapping approcci 6. E in terzo luogo, NGS possono potenzialmente aumentare le dimensioni del campione, riducendo disturbo agli animali, gli sforzi di campionamento, e costi, contribuendo così a minimizzare i pregiudizi delle stime dei parametri della popolazione 7. Quest&#39;ultimo punto potrebbe rivelarsi cruciale quando si tratta di specie minacciate, dal momento che stime distorte dei parametri di popolazione può portare a gestione inadeguata. Nel video presente articolo viene descritto un metodo semplice, romanzo, economico e non invasivo per esempio sfuggente piccoli mammiferi, con l&#39;americano Pika come esempio. Abbiamo dimostrato che il DNA estratto dai capelli esegue in modo simile al DNA estratto da campioni di fegato rispetto ai microsatelliti, AFLP, mitocondriali e marcatori determinazione del sesso, rendendo questo metodo di campionamento non invasivo una valida alternativa per vivere campionamento cattura o letali. Nel complesso, possiamo anticipare che questo metodo possa essere utile nella fase di raccolta dati di studi di genetica delle popolazioni e comportamentali delle piccole specie rare o elusivo mammifero, riducendo al minimo l&#39;impatto sugli organismi oggetto di studio.

Capelli trappola: <ul><li> Rotoli di nastro adesivo trasparente (3M, St. Paul, MN, USA) </li><li> Pesca con la lenza (£ 10) </li><li> Criogenico tubo (2 ml) </li><li> Pinza sterile </li><li> Azoto liquido Dewar (opzionale) </li></ul> Estrazione del DNA: <ul><li> DNA IQ System (Cat. # DC6701, Promega) con il tessuto e l&#39;estrazione Kit capelli (Cat. # DC6740, Promega). </li><li> MagneSphere tecnologia magnetica stand di separazione (Cat. # Z5342; Promega) </li><li> Centrifuga Micro </li><li> Ibridazione forno o bagnomaria </li><li> Provette Eppendorf 1,5 ml </li></ul>

una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere dna di alta qualità da elusive piccoli mammiferi

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Metodi di campionamento non invasivo genetici stanno diventando sempre più importanti per studiare le popolazioni di fauna selvatica. Una serie di studi hanno segnalato utilizzando tecniche di campionamento non invasivo per studiare la genetica di popolazione e la demografia delle popolazioni selvatiche 1. Questo approccio ha dimostrato di essere particolarmente utile quando si tratta di specie rare o elusive 2. Mentre un certo numero di questi metodi sono stati sviluppati per i capelli campione, feci e altro materiale biologico da carnivori e medie imprese i mammiferi, sono rimasti in gran parte non testate in elusivo piccoli mammiferi. In questo video, vi presentiamo un romanzo, rullante capelli poco costosi e non invasivi destinati a un mammifero sfuggente piccolo, il pika americano (Ochotona princeps). Noi descriviamo il set-up generale dal laccio dei capelli, che consiste di strisce di nastro adesivo disposti in un web-come la moda e collocati lungo viaggio percorsi in habitat pikas &#39;. Illustriamo l&#39;efficienza della trappola a raccogliere una grande quantità di capelli che possono essere raccolti e portati al laboratorio. Abbiamo quindi dimostrare l&#39;utilizzo del sistema IQ DNA (Promega) per isolare il DNA e mostrare l&#39;utilità di questo metodo comunemente utilizzato per amplificare marcatori molecolari microsatelliti nucleari compresi, amplificato polimorfismi della lunghezza dei frammenti (AFLPs), sequenze mitocondriali (800bp), così come un sexing marcatore molecolare. Nel complesso, abbiamo dimostrato l&#39;utilità di questa trappola romanzo capelli non invasivo come una tecnica di campionamento per i biologi della popolazione della fauna selvatica. Ci aspettiamo che questo approccio sarà applicabile ad una varietà di piccoli mammiferi, aprendo le aree di indagine all&#39;interno delle popolazioni naturali, riducendo al minimo l&#39;impatto per gli organismi di studio.

Vi presentiamo un approccio non invasivo di campionamento per raccogliere campioni di capelli in modo efficiente da sfuggente piccoli mammiferi, come mostrato per il pika americano. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità di questo metodo di estrazione del DNA da capelli campionati e amplificare diversi tipi di marcatori molecolari comunemente utilizzati negli studi di ecologia e conservazione della fauna selvatica.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Gli approcci di campionamento genetico non invasivo stanno diventando sempre più importanti per lo studio delle popolazioni di fauna selvatica. Diversi studi hanno riportato l'uso di...

I genetisti delle popolazioni selvatiche utilizzano sempre più spesso approcci di campionamento non invasivo per ottenere dati dalle specie di loro interesse. Tali approcci si sono rivelati utili per indagare questioni relative al comportamento animale, alla popolazione, alla demografia e alla genetica, specialmente in animali rari ed elusivi; inoltre, raccogliendo a distanza materiali biologici come il pelo, i ricercatori possono studiare gli animali senza disturbarli, nuocere loro o addirittura osservarli direttamente. Sebbene queste tecniche siano state applicate principalmente a carnivori di media e grande taglia, come gli orsi grizzly, minore attenzione è stata dedicata ai mammiferi erbivori di piccole dimensioni, lasciando un vuoto da colmare.Stanno being sviluppati nuovi approcci innovativi per il campionamento di piccoli mammiferi. Questo articolo video descrive un metodo nuovo e innovativo per ottenere in modo non invasivo campioni di peli da piccoli lagomorfi chiamati Pika americani. Questi piccoli mammiferi sono presenti in tutta la catena montuosa del Nord America, dal Nuovo Messico e dalla California fino alla Columbia Britannica centrale.Abitano scivoli rocciosi chiamati pendii Tala, che offrono riparo dalla predazione e protezione dagli estremi ambientali. Sono generalmente presenti a quote superiori a 2.500 metri sul livello del mare nella parte meridionale del loro areale, ma possono essere trovati anche a livello del mare nella parte più settentrionale della loro distribuzione. I piccoli conigli rocciosi non vanno in letargo.Sono attivi per tutta la giornata durante l'estate, ma concentrano la loro attività al mattino e alla sera. Quando le temperature sono più fresche, si avventurano nei prati adiacenti alla pendenza di Tali per foraggiarsi sulla vegetazione circostante. Una particolarità del PIKA è che non si limita a mangiare il cibo all'aperto.La riporta nel suo territorio nella Tallis e la immagazzina in mucchi di fieno. Sebbene la specie sia facilmente rilevabile, è di natura schiva e spesso evita le trappole vive predisposte dai ricercatori. Inoltre, si è scoperto che i pika sono sensibili al manipolamento, il che può portare alla morte dell'animale al fine di studiare una serie di questioni ecologiche, comportamentali ed evolutive.In questo elusivo piccolo mammifero, minimizzando al contempo l'impatto, il dottorando Philippe Henry del campus Okanagan dell'Università della British Columbia ha sviluppato una tecnica di campionamento non invasiva particolarmente adatta alla specie. Prima di posizionare una trappola, cerca prove di territori attivi di PICA sul pendio di Tallis. Queste includono mucchi di fieno, ovvero riserve di vegetazione che l'animale raccoglie a fine estate per la sopravvivenza durante l'inverno, e feci fresche.Questo si trova solitamente in specifici siti di tane. Una volta identificato un possibile picco di habitat all'interno della tlu, una trappola per peli viene posizionata strategicamente sopra l'ingresso. Utilizzando un rotolo di nastro adesivo, Philippe arrotola con abilità delle strisce di nastro e le dispone in modo simile a una ragnatela per avvolgere.L'ingresso delle trappole per nascondigli è realizzato con disegni complessi che prevedono un'apertura non troppo grande né troppo piccola, adatta al passaggio dell'animale. In linea teorica, un pica passerà attraverso il lazo, lasciando dietro di sé un campione del proprio pelo, per poi proseguire indisturbato nelle proprie attività quotidiane. Il pelo stesso è molto sottile e presenta una piccola radice bulbosa.Per ottenere un campione adeguato per l'analisi, si raccomanda un minimo di 25 peli appartenenti allo stesso individuo. Le posizioni di impatto devono inoltre essere distinte lungo il nastro. Eventuali peli raggruppati separatamente sono considerati appartenenti a individui diversi.Mentre si presume che quelli raggruppati siano identici, i peli raccolti possono quindi essere rimossi con cura dal nastro utilizzando pinzette sterili, senza alterare la struttura del campione, in particolare il bulbo radicale che contiene la concentrazione più elevata di DNA nucleare. Successivamente, il pelo viene posizionato con attenzione in un tubo criogenico da due millilitri e conservato in un contenitore di azoto liquido fino a quando il campione non raggiunge un laboratorio per ulteriori analisi. Una volta in laboratorio, il campione di pelo viene centrifugato in un microcentrifugo per evitare la perdita di peli all'apertura del tubo; il DNA viene quindi estratto dai campioni di pelo utilizzando il sistema Promega DNA IQ; il primo passaggio prevede la preparazione di una soluzione contenente 100 microlitri di buffer di incubazione, 1,8 milligrammi per millilitro di proteinasi K e 0,1 molare di DTT.Successivamente, 100 microlitri della soluzione di incubazione vengono aggiunti ai capelli e incubati a 56 gradi Celsius per un'ora. Il campione viene quindi trattato con 200 microlitri di tampone di lisi contenente 0,01 moli di DTT e sette microlitri di resina DNA IQ risospesa. Il campione viene poi vortexato ad alta velocità per tre secondi e incubato a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti.Il campione digerito viene quindi vorticosato per due secondi ad alta velocità e posizionato in un supporto per separazione magnetica. A questo punto, la resina magnetica contenente frammenti di DNA si separa immediatamente dalla soluzione e si raccoglie in un pellet sul fondo del tubo. La soluzione rimanente viene quindi rimossa e scartata.Successivamente, il campione viene trattato nuovamente con 100 microlitri di buffer di lisi sottoposto a vortex e quindi riposizionato sul supporto magnetico, dove avviene la separazione. Questo stesso passaggio viene ripetuto altre tre volte utilizzando un buffer di lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, il campione viene lasciato asciugare sul supporto magnetico per 15 minuti.Quindi, 100 microlitri di tampone di eluizione vengono aggiunti al campione e incubati a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Infine, il campione viene vortexato per due secondi e posizionato sul supporto magnetico. La soluzione di DNA viene quindi trasferita in una provetta da 1,5 millilitri e conservata a meno 20 gradi Celsius.In attesa di ulteriori analisi, mi chiamo Peter Bohi. Sono un dottorando nel laboratorio di Genomica Ecologica e della Conservazione del dottor Michael Rosso presso il campus dell'Università della British Columbia Okanagan. Il DNA estratto dai campioni di pelo raccolti quest'estate è stato successivamente utilizzato per amplificare, mediante PCR, diversi tipi di marcatori molecolari.Abbiamo inoltre utilizzato campioni di fegato come controllo positivo e base di riferimento. A scopo comparativo, abbiamo amplificato loci microsatellitari nucleari che verranno impiegati per lo studio della struttura genetica delle popolazioni del nostro animale, nonché analisi genomiche A FLP che saranno utilizzate per studiare l'adattamento di base genetica lungo un gradiente altitudinale. Abbiamo inoltre amplificato sequenze di DNA mitocondriale fino a 800 paia di basi utilizzabili per lo studio della filogeografia della specie, e applicato uno strumento di determinazione molecolare del sesso basato su sequenze del dito di zinco e su P-C-R-R-F-L-P al fine di identificare il sesso degli individui nelle nostre popolazioni.In tutti i marcatori testati, il DNA estratto da campioni di peli e fegato ha prodotto livelli comparabili di qualità della sequenza del DNA e del genotipo. In questo video, abbiamo dimostrato che questo metodo di campionamento non invasivo, abbinato al protocollo di estrazione DNA IQ, è efficace per ottenere quantità adeguate di peli in grado di fornire DNA di qualità e quantità sufficienti per l'amplificazione mediante PCR. Nel complesso, prevediamo che questo metodo sarà utile per facilitare la raccolta di dati a sostegno di studi sulle popolazioni, di analisi genetiche e comportamentali di piccoli mammiferi rari o elusivi, riducendo al minimo l'impatto sulle specie in esame.

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Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

L'approccio qui presentato PCR diretta facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di piante non purificato e tessuto animale.

Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

Tessuto-specifica analisi di un modello di rigenerazione del follicolo usando lentivirus mediare guadagno o perdita di funzione.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Qui si descrive una strategia di rimozione ottimizzato ed efficiente per la raccolta di bio-particelle presenti nel 'toccare DNA' campioni, con un protocollo di amplificazione potenziata coinvolge un solo passaggio 5 microlitri micro-volume di lisi / STR amplificazione, per consentire il recupero di repeat short tandem (STR) profili del donatore bio-particelle (s).

Maggiore analisi genetica di singole bioparticelle umani recuperati da semplificato Micromanipolazione da Forensic Evidence &#39;tocco DNA&#39;

In questo articolo, dimostriamo come viene eseguita la tecnica assorbente microbiopsy e come l'esempio può essere utilizzato per l'estrazione di RNA per campionamento semplice e simultanea della pelle e sangue in modo minimamente invasivo.

Microbiopsy assorbente campionamento ed estrazione di RNA per sangue mininvasivo, simultaneo e analisi della pelle

Questo è un protocollo per la preparazione ottimale dei tessuti per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche di pipistrelli catturati in natura. Esso comprende protocolli per la cattura pipistrello e la dissezione, la conservazione dei tessuti, e la coltura cellulare del tessuto pipistrello.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

L'attuale protocollo presenta un metodo veloce, efficiente e delicato per isolare singole cellule adatte per l'analisi RNA-seq a singola cellula da un incisivo di topo in continua crescita, molare di topo e denti umani.

Isolamento rapido di singole cellule da denti di topo e umani

Il protocollo presenta una serie di protocolli di best practice per la raccolta di polvere ossea da otto posizioni di campionamento anatomico raccomandate (posizioni specifiche su un dato elemento scheletrico) attraverso cinque diversi elementi scheletrici di individui medievali (datato al radiocarbonio a un periodo di circa 1040-1400 CE, calibrato intervallo 2-sigma).

Protocolli di campionamento osseo ottimizzati per il recupero di DNA antico da resti archeologici

Qui, presentiamo un protocollo semplice per il campionamento genetico non invasivo delle popolazioni di farfalle basato sulla raccolta sul campo dei detriti residui di uova. Può essere utilizzato per confermare l'identità della specie e quantificare la variazione genetica. Questo protocollo può essere facilmente adattato a gruppi più ampi per il coinvolgimento scientifico della comunità.

Impiego di scienziati della comunità per condurre campionamenti genetici non distruttivi di rare popolazioni di farfalle

Scopri una tecnica non invasiva per campionare peli di pica americano, ottenendo DNA di alta qualità per studi di genetica della conservazione. Questo metodo minimizza l'impatto sugli animali elusivi.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

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