Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali

Questo video mostra un metodo per monitorare l'invasione di un monostrato di cellule endoteliali da parte di cellule tumorali utilizzando una tecnica basata sull'impedenza elettrica in tempo reale. In primo luogo, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana denominate VE sono alloggiate in EPL a 16 pozzetti rivestiti con elettrodi d'oro sul fondo del pozzetto. Per generare un monostrato confluente, vengono aggiunte cellule tumorali, che si attaccano al VE e invadono il monostrato HVAC interrompendo le giunzioni delle cellule endoteliali. Vengono quindi acquisite le letture dell'impedenza, che dipendono dall'area totale del fondo del pozzetto coperta dalle cellule.

L'entità dell'invasione può quindi essere determinata in base alle variazioni dell'impedenza elettrica. Il vantaggio principale di questa tecnica o dei metodi esistenti, come la camera a vuoto e i saggi METROGEL, è che le interazioni tra cellule endoteliali e cellule tumorali imitano più da vicino il processo metastatico in vivo e i dati sono ottenuti in tempo reale e sono più facilmente quantificabili rispetto all'analisi degli endpoint per altri metodi. Anche se questo metodo può fornire informazioni sull'invasione delle cellule tumorali.

Può anche essere applicato ad altri sistemi, come lo studio delle interazioni tra cellule cellulari nel sistema immunitario. Inoltre, la fase iniziale dell'esperimento in cui osserviamo la crescita delle cellule UX può essere utilizzata per valutare la proliferazione cellulare di qualsiasi linea cellulare senza ulteriori fasi di invasione che dimostrino che la procedura sarà uno studente laureato del mio laboratorio. Tutte le fasi di questo protocollo devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale.

Il sistema Xcel utilizzato per questo esperimento è conservato in modo permanente in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica, dedicato esclusivamente a questo strumento al suo primo utilizzo. Lo strumento deve essere lasciato nell'incubatrice per almeno 16 ore per equilibrarsi al nuovo ambiente di temperatura e umidità. Quindi, preparare Tthen EPL 16 ricoprendolo con gelatina allo 0,1% per un'ora a 37 gradi Celsius.

Una volta che la piastra è stata rivestita, lavarla una volta con PBS. Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno ricostituito e gm two per eseguire una lettura in bianco. Per misurare l'impedenza di fondo in assenza di celle.

Posizionare l'EPL nel sistema di agenti Excel sul computer. Aprire il software dell'agente Excel facendo clic sull'icona del software RTCA sul desktop nella finestra del software. Fare clic sulla scheda di layout e selezionare i pozzetti contenenti i campioni.

Per programmare la frequenza di acquisizione dei dati in tempo reale. Fare clic sulla scheda Pianificazione, quindi fare clic sull'icona Aggiungi un passaggio che indica il numero di letture e gli intervalli indicano l'intervallo di tempo tra le letture. Questi vengono impostati automaticamente rispettivamente su uno e 1.00 minuti.

Questo programma il sistema per eseguire una lettura in background. Fare clic su aggiungi un passaggio e immettere 300 nella casella delle sweep e 10 minuti nella casella degli intervalli. In questo modo lo strumento sarà programmato per eseguire misure di impedenza per un massimo di 50 ore.

Per iniziare l'esperimento, fai clic sull'icona Inizia un passaggio. L'impedenza di fondo di ciascun pozzetto verrà misurata dopo che la misurazione del fondo è stata eseguita. Nella finestra viene visualizzato il messaggio.

Pronto per il passaggio successivo, fai clic. Passaggio successivo per iniziare. A questo punto, è possibile aggiungere cellule e monitorare la formazione di un monostrato come descritto.

Nella sezione successiva, la vena ombelicale umana, le cellule endoteliali o VE utilizzate qui vengono coltivate in EGM due terreni ricostituiti con il kit EGM due proiettili contenente integratori di fattori di crescita e le cellule FBS al 5% devono essere mantenute in un incubatore a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica. Il giorno dell'esperimento, controllare la cofluenza di HUB E Al microscopio, le cellule dovrebbero essere un numero di passaggio basso, preferibilmente non superiore a sei e inferiore al 75% di contenuto per generare una tonalità, il monostrato raccoglie le cellule mediante tripsina. Una volta che le cellule si sono staccate dal pallone, ogni traccia di tripsina deve essere rimossa mediante centrifugazione a 200 G.Dopo la centrifuga, lavare le cellule una volta con PBS.

Quindi risospendere le cellule e ricostituire due mezzi GM ad una concentrazione di 2,5 volte 10 alla quinta cellula per millilitro. Una volta risospese le cellule, rimuovere l'EPL calibrato di fondo dal sistema EXOGEN e aggiungere 100 microlitri di sospensione HX ai 100 microlitri di E GM due terreni già presenti nella piastra. Posizionare immediatamente l'EPL nell'analizzatore di celle del sistema Excel.

Iniziare ad acquisire le letture dell'impedenza facendo clic sul pulsante di avvio della fase nella finestra del software. Consentire alle cellule endoteliali di crescere. Il sistema continuerà a rilevare le letture dell'impedenza ogni 10 minuti.

Le uve mostrano un caratteristico appiattimento transitorio dell'indice cellulare da quattro a sei ore dopo la semina, seguito da un'altra stabilizzazione dopo 16-18 ore. Pertanto, è importante lasciare che le cellule formino un monostrato confluente per almeno 18 ore. Una volta formato un monostrato, è il momento di aggiungere le cellule invasive in preparazione per il test di invasione.

Preparare le cellule tumorali invasori. Qui vengono utilizzate le cellule dell'osteosarcoma. Inizia raccogliendo le cellule con la tripsina.

Rimuovere ogni traccia di tripsina centrifugando le cellule a 200 g e lavando una volta con PPS. Dopo il wash reus, sospendere le cellule con una densità finale di una volta 10 per le quinte cellule per millilitro nel terreno utilizzato per far crescere le cellule tumorali come il terreno RPMI o DMEA contenente il 10% di FBS. Metti in pausa l'esperimento facendo clic sull'icona del passaggio di pausa nella finestra del software.

Rimuovere l'EPL e aspirare l'EGM two medium dal monostrato dell'aspirapolvere. Aggiungere 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali contenente una volta per 10 alla quarta cellula. In generale, un rapporto da uno a 2,5 cellule tumorali rispetto alle cellule endoteliali funziona meglio per il test.

Tuttavia, il rapporto può essere ottimizzato per le singole linee cellulari. Riposizionare l'EPL nel sistema di agenti Excel nell'incubatrice. Fare clic sul passaggio continua per continuare a rilevare le letture dell'impedenza a intervalli di 10 minuti.

Monitora l'invasione in tempo reale nelle prossime sei-12 ore. Un calo dell'indice cellulare risulterà dalla retrazione delle giunzioni endoteliali e dalla penetrazione da parte delle cellule tumorali invasori. Al termine dell'esperimento, utilizzare il software exergen per normalizzare i risultati al momento dell'aggiunta delle cellule tumorali invasori.

Il software exergen consente la normalizzazione in qualsiasi punto temporale I VEX sono stati coltivati sul sistema exergen come mostrato in questo video, e sono state aggiunte K sette cellule M due o K 12 cellule dopo la formazione del monostrato. Come mostrato qui, una forte diminuzione dell'indice cellulare si verifica entro poche ore dall'introduzione di K sette M due cellule. K seven M two è una linea cellulare di osteosarcoma altamente metastatica.

Queste cellule esprimono alti livelli della proteina linker del citoscheletro ene, che spiega le proprietà invasive della linea cellulare. Le cellule K 12, d'altra parte, sono meno metastatiche e non sono in grado di penetrare il monostrato endoteliale con la stessa efficienza delle cellule K sette M due. Questo è rappresentato da una diminuzione meno profonda dell'indice cellulare, come mostrato qui.

Il controllo qui mostrato rappresenta l'impedenza del monostrato uve. In assenza di cellule tumorali, gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'invasione in tempo reale generando un monostrato di cellule endoteliali e sfidando il monostrato con le cellule tumorali.

Le fasi iniziali dell'esperimento che coinvolgono la formazione di monostrato HU XL possono essere utilizzate per valutare la proliferazione cellulare mediante impedenza. Due.