Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali
1 aprile 2011
Questo articolo descrive una In vitro Tecnica per le cellule tumorali che invadono monitoraggio mediante un monostrato di cellule endoteliali. I dati vengono acquisiti in tempo reale in funzione delle variazioni dell'impedenza sulla superficie degli elettrodi sul fondo del pozzo.
Questo video dimostra un metodo per monitorare l'invasione di un monocstrato di cellule endoteliali da parte di cellule tumorali, utilizzando una tecnica basata sull'impedenza elettrica in tempo reale. Innanzitutto, cellule endoteliali provenienti dalla vena ombelicale umana, indicate come VE, vengono seminate in piastre EPL a 16 pozzetti rivestiti con elettrodi d'oro sul fondo dei pozzetti. Per formare un monocstrato confluenziale, vengono aggiunte cellule tumorali che si attaccano alle VE e invadono il monocstrato HVAC, alterando le giunzioni tra le cellule endoteliali. Successivamente, vengono registrate le misurazioni di impedenza, che dipendono dalla superficie totale del fondo del pozzetto coperta dalle cellule.
Il grado di invasione può quindi essere determinato in base alle variazioni dell'impedenza elettrica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio con camera vuota e il saggio METROGEL, è che le interazioni tra cellule endoteliali e cellule tumorali riproducono in modo più fedele il processo metastatico in vivo, e i dati vengono ottenuti in tempo reale e sono più facilmente quantificabili rispetto all'analisi finale richiesta da altri metodi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invasione delle cellule tumorali.
È inoltre applicabile ad altri sistemi, come lo studio delle interazioni tra cellule nel sistema immunitario. Inoltre, la fase iniziale dell'esperimento, in cui si osserva la crescita delle cellule UX, può essere utilizzata per valutare la proliferazione cellulare di qualsiasi linea cellulare, senza ulteriori passaggi di invasione, dimostrando che la procedura sarà eseguita da Rahim, studente laureando del mio laboratorio. Tutti i passaggi di questo protocollo devono essere eseguiti in condizioni sterili all'interno di una cappa per colture cellulari.
Il sistema Xcel utilizzato per questo esperimento viene mantenuto permanentemente in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, dedicato esclusivamente a questo strumento fin dal suo primo utilizzo. Lo strumento deve essere lasciato nell'incubatore per almeno 16 ore per permetterne l'equilibrazione con il nuovo ambiente termico e di umidità. Successivamente, preparare Thence EPL 16 rivestendolo con gelatina 0,1% per un'ora a 37 gradi Celsius.
Dopo aver rivestito la piastra, lavarla una volta con PBS. Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo e gm due ricostituito per eseguire una lettura di bianco. Per misurare l'impedenza di fondo in assenza di cellule.
Posizionare l'EPL nel sistema dell'agente Excel sul computer. Aprire il software dell'agente Excel facendo clic sull'icona del software RTCA sul desktop nella finestra del software. Fare clic sulla scheda layout e selezionare le pozzette contenenti i campioni.
Per programmare la frequenza di acquisizione dati in tempo reale, fare clic sulla scheda programma, quindi fare clic sull'icona aggiungi un passaggio. Scansione indica il numero di letture e intervalli indica l'intervallo di tempo tra le letture. Questi valori sono impostati automaticamente rispettivamente su uno e 1,00 minuto.
Questo programma il sistema per eseguire una lettura di fondo. Fare clic su aggiungi un passaggio e inserire 300 nella casella delle scansioni e 10 minuti nella casella degli intervalli. Questo programmerà lo strumento per effettuare misurazioni di impedenza per un massimo di 50 ore.
Per iniziare l'esperimento, fare clic sull'icona avvia un passaggio. L'impedenza di fondo di ogni pozzetto verrà misurata dopo che è stata eseguita la misurazione del fondo. La finestra visualizza il messaggio.
Pronto per il passaggio successivo, fare clic. Passaggio successivo da avviare. A questo punto, è possibile aggiungere le cellule e monitorare la formazione di un monostrato come descritto.
Nella sezione successiva, le cellule endoteliali venose umbelicali umane, o VE utilizzate in questo caso, vengono coltivate in mezzo EGM due recostituito con il kit EGM due bullet contenente integratori di fattori di crescita e 5% di FBS. Le cellule devono essere mantenute in un incubatore a 37 gradi Celsius in presenza di 5% di anidride carbonica. Nel giorno dell'esperimento, verificare la confluenza delle HUB E al microscopio: le cellule devono avere un numero basso di passaggi, preferibilmente non superiore a sei e con confluenza inferiore al 75%, per generare un monocstrato uniforme. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione. Una volta che le cellule si sono staccate dalla fiasca, rimuovere completamente ogni traccia di tripsina mediante centrifugazione a 200 ×g. Dopo la centrifugazione, lavare le cellule una volta con PBS.
Quindi ri-sospendere le cellule e il mezzo e GM due ricostituito a una concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule per millilitro. Una volta ri-sospese le cellule, rimuovere il EPL calibrato di fondo dal sistema EXOGEN e aggiungere 100 microlitri della sospensione HX ai 100 microlitri di mezzo E GM due già presenti nella piastra. Posizionare immediatamente il EPL nell'analizzatore cellulare del sistema Excel.
Iniziare ad acquisire le letture di impedenza cliccando sul pulsante di avvio nella finestra del software. Lasciare crescere le cellule endoteliali. Il sistema continuerà a effettuare letture di impedenza ogni 10 minuti.
Le uve mostrano un caratteristico appiattimento transitorio dell'indice cellulare quattro-sei ore dopo la semina, seguito da un ulteriore stabilizzazione dopo 16-18 ore. Pertanto, è importante lasciare che le cellule formino un monostrato confluenziale per almeno 18 ore. Una volta formato il monostrato, è il momento di aggiungere le cellule invadenti in preparazione al saggio di invasione.
Preparare le cellule tumorali invasive. In questo caso vengono utilizzate cellule di osteosarcoma. Iniziare raccogliendo le cellule mediante tripsina.
Rimuovere completamente ogni traccia di tripsina centrifugando le cellule a 200 G e lavandole una volta con PPS. Dopo il lavaggio, sospendere le cellule a una densità finale di uno per dieci alla quinta cellule per millilitro nel mezzo utilizzato per coltivare le cellule tumorali, come il mezzo RPMI o DMEA contenente il 10% di FBS. Interrompere temporaneamente l'esperimento facendo clic sull'icona del passaggio di pausa nella finestra del software.
Rimuovere l'EPL e aspirare il mezzo EGM-2 dal monostrato cellulare. Aggiungere 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali contenente 1 × 10⁴ cellule. In generale, un rapporto di 1 a 2,5 tra cellule tumorali e cellule endoteliali funziona meglio per il saggio.
Tuttavia, il rapporto può essere ottimizzato per singole linee cellulari. Rimettere l'EPL nel sistema Excel agent nell'incubatrice. Fare clic sul passaggio continua per proseguire con le letture di impedenza a intervalli di 10 minuti.
Monitorare l'invasione in tempo reale nelle successive sei-dodici ore. Una diminuzione dell'indice cellulare risulterà dal restringimento delle giunzioni endoteliali e dalla penetrazione delle cellule tumorali invasive. Al termine dell'esperimento, utilizzare il software Exergen per normalizzare i risultati rispetto al tempo di aggiunta delle cellule tumorali invasive.
Il software exergen permette la normalizzazione a qualsiasi punto temporale in cui le VEX sono state coltivate sul sistema exergen, come mostrato in questo video, e successivamente, dopo la formazione del monostrato, sono state aggiunte cellule K7M2 o cellule K12. Come mostrato qui, si verifica una brusca diminuzione dell'indice cellulare entro poche ore dall'introduzione delle cellule K7M2. K7M2 è una linea cellulare di osteosarcoma altamente metastatica.
Queste cellule esprimono alti livelli della proteina legante il citoscheletro ene, che spiega le proprietà invasive della linea cellulare. Le cellule K 12, d'altro canto, sono meno metastatiche e non riescono a penetrare il monostrato endoteliale in modo altrettanto efficiente rispetto alle cellule K seven M two. Ciò è rappresentato da una diminuzione meno marcata dell'indice cellulare, come mostrato qui.
Il controllo mostrato qui rappresenta l'impedenza del monocstrato uveale. In assenza di cellule tumorali, gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice replicato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'invasione in tempo reale generando un monocstrato di cellule endoteliali e sottoponendo il monocstrato a cellule tumorali.
I passaggi iniziali dell'esperimento che prevedono la formazione di un monocstrato di HU XL possono essere utilizzati per valutare la proliferazione cellulare mediante impedenza.Two.
Panoramica
Questo articolo descrive una tecnica basata sull'impedenza elettrica in tempo reale per monitorare l'invasione delle cellule tumorali attraverso un monocstrato di cellule endoteliali. Il metodo consente la quantificazione delle interazioni cellulari che riproducono i processi metastatici in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare
- Ricerca sul Cancro
- Biologia delle Cellule Endoteliali
Sfondo
- Comprendere l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
- I metodi tradizionali si basano spesso su analisi a punto finale, che possono fornire informazioni meno dettagliate.
- Questa tecnica fornisce dati in tempo reale, migliorando la comprensione delle interazioni cellulari.
- Può inoltre essere adattata per lo studio di altre interazioni cellulari, come quelle del sistema immunitario.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il monitoraggio in tempo reale dell'invasione delle cellule tumorali.
- Fornire informazioni sulle interazioni tra cellule endoteliali e cellule tumorali.
- Migliorare la quantificazione dell'invasione cellulare rispetto ai metodi esistenti.
Metodi Utilizzati
- Le cellule endoteliali venose umbilicali umane (HUVECs) sono coltivate per formare un monocstrato.
- Le cellule tumorali vengono introdotte per monitorare la loro invasione attraverso variazioni di impedenza.
- Le letture di impedenza vengono effettuate a intervalli regolari per valutare le interazioni cellulari.
- L'esperimento viene condotto in condizioni sterili per garantire accuratezza.
Risultati principali
- Il monitoraggio in tempo reale dell'impedenza consente di seguire efficacemente l'invasione delle cellule tumorali.
- Le variazioni dell'impedenza si correlano al grado di alterazione delle giunzioni endoteliali.
- Il metodo permette l'ottimizzazione dei rapporti cellulari per diversi saggi.
- I dati ottenuti forniscono informazioni sulle dinamiche dell'invasione cellulare.
Conclusioni
- Questa tecnica offre una rappresentazione più accurata dell'invasione delle cellule tumorali.
- L'acquisizione di dati in tempo reale migliora la comprensione dei processi metastatici.
- Il metodo può essere applicato a vari studi sulle interazioni cellulari al di là del cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica di impedenza elettrica in tempo reale consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di valutare quantitativamente l'invasione delle cellule tumorali attraverso monociti endoteliali con rilevanza fisiologica. Registrando le variazioni dinamiche e senza etichette dell'impedenza correlate alla rottura delle giunzioni e alla penetrazione delle cellule tumorali, il metodo supporta l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio associato a bersagli anti-metastatici. Fornisce un'elevata affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, distinguendo fenotipi invasivi da quelli non invasivi in un formato scalabile e riproducibile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando in tempo reale le interazioni tra tumore e endotelio che riproducono la disseminazione metastatica in vivo.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli mediante letture basate sull'impedenza, che riflettono l'integrità delle giunzioni endoteliali e l'invasività delle cellule tumorali.
- Valore predittivo: Facilita la selezione di portafogli attraverso la distinzione tra linee di osteosarcoma ad alta metastaticità (ad esempio, K7M2) e a bassa metastaticità (ad esempio, K12) in base all'entità della riduzione dell'impedenza.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output quantitativi standardizzati di indice cellulare adatti per lo screening ad alto contenuto di composti che bersagliano le vie di invasione.
- Riproducibilità: Consente misurazioni di impedenza costanti tra ripetizioni quando i monociti endoteliali vengono equilibrati per almeno 18 ore prima dell'aggiunta delle cellule tumorali.
- Scalabilità: Compatibile con matrici elettrode a 16 pozzetti, che permettono il test parallelo di condizioni e l'ottimizzazione dei reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la Malattia: Modella il passaggio dell'invasione endoteliale nella metastasi, un collo di bottiglia critico per la sopravvivenza delle cellule tumorali circolanti e per l'extravasazione.
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico fornendo un'analisi quantificabile in tempo reale della dinamica dell'invasione, applicabile a studi di correlazione con biomarcatori.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Supporta scelte di proseguimento o interruzione del percorso sperimentale associando i cambiamenti di impedenza all'invasività funzionale, riducendo la dipendenza da saggi endpoint.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto leader, in cui metriche di invasione in tempo reale forniscono informazioni tempestive sulle relazioni struttura-attività e sugli studi sui meccanismi d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni endotelio-tumore fornendo dati di impedenza in tempo reale, privi di marcatori, che riflettono l'adesione cellulare, la diffusione e il rimodellamento delle giunzioni.
- Screening: Fornisce baseline di impedenza pronte per i saggi e curve dinamiche di invasione, consentendo lo screening di librerie di composti contro fenotipi di invasione.
- Analisi: Produce valori dimensionali dell'indice cellulare e cinetiche temporali di invasione che permettono il confronto quantitativo tra condizioni sperimentali e la normalizzazione rispetto ai tempi iniziali di invasione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica modellando un passaggio metastatico chiave suscettibile di intervento terapeutico e di modellizzazione farmacocinetica-farmacodinamica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma basata sull'impedenza riutilizzabile per lo studio di diverse interazioni cellula-cellula, inclusa l'adesione immuno-endoteliale, al di là dell'oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella modellizzazione della metastasi.
- Valore operativo: Offre standardizzazione, monitoraggio in tempo reale e quantificazione senza etichette, migliorando la produttività rispetto a saggi a punto finale come la camera di Boyden.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni tempestive di avvio o interruzione basate sui dati, riducendo il rischio di fallimento biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei candidati anti-invasione in base al rischio attraverso letture fenotipiche quantificabili e collegate al meccanismo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nell'uso di strumentazione basata sull'impedenza (ad esempio xCELLigence) e in tecniche sterili per la formazione riproducibile di un monostrato.
- Dipende da piastre con array di elettrodi in oro (EPL) e sistemi analizzatori di impedenza dotati di controllo ambientale (37°C, 5% CO₂) per garantire la stabilità del segnale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla densità di semina delle cellule endoteliali, al numero di passaggi (<6) e al tempo di equilibrazione pre-invasione (≥18 ore) per assicurare la comparabilità dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a cellule immunitarie o ad altri tipi cellulari, inclusa l'ottimizzazione dei rapporti effettore-target e della compatibilità del mezzo.
- Limitazione pratica: l'interpretazione del segnale presuppone che le variazioni di impedenza riflettano principalmente la copertura cellulare e la morfologia; fattori confondenti come la conducibilità del mezzo o l'accumulo di detriti sugli elettrodi devono essere controllati.
