Name: Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Scopri l'analisi della morfologia delle spine dendritiche in colture di neuroni corticali primari utilizzando GFP e microscopia confocale. Questo metodo permette di studiare la plasticità sinaptica e le alterazioni strutturali.

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Ringraziamo Kelly Jones per l&#39;editing accurato. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01MH 071316, l&#39;Alzheimer Association, l&#39;Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Schizofrenia e Depressione (NARSAD), e l&#39;Alleanza Nazionale per la Ricerca Autismo (NAAR) (PP); American Heart Association borsa di studio post-dottorato (DPS); americano Heart Association Fellowship Predoctoral (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

La produzione di questo lavoro è stato sostenuto da MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).

Le tecniche descritte sopra per la dettagliata analisi quantitativa della morfologia spine dendritiche, densità lineare e la motilità sia in neuroni primari fissa o vivere corticali sono focalizzati sulla comprensione degli effetti di post-sinaptico meccanismi che possono contribuire alla neuropatologie. Un approccio simile può essere utilizzato per quantificare la morfologia e la motilità della colonna vertebrale in qualsiasi neuroni spinosi, tra cui piramidali dell&#39;ippocampo, Purkinje, o neuroni spinosi di media. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 18 millimetri di copertura in vetro rotondo No. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 millimetri quadrati di copertura in vetro No. 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Salita scientifico </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25-060-C 1 </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Soluzione di formaldeide </td><td> EMD chimici </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Istologia grado </td></tr><tr><td> Capre normale sierico </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson ImmunoResearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H + L), altamente cross-adsorbito </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio (H + L) * altamente cross-adsorbito * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Imballaggio speciale </td></tr><tr><td> In allegato l&#39;imaging camera di fase </td><td> Ammonitore </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Termoregolatore unità </td><td> Ammonitore </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Universale Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del snc

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Spine dendritiche sono i siti della maggior parte delle connessioni eccitatorie all&#39;interno del cervello, e la forma post-sinaptica vano di sinapsi. Queste strutture sono ricchi di actina e hanno dimostrato di essere altamente dinamica. In risposta alla classica plasticità Hebbian così come i segnali neuromodulatori, spine dendritiche possono cambiare forma e numero, che è pensato per essere critica per la raffinatezza dei circuiti neurali e della trasformazione e conservazione delle informazioni all&#39;interno del cervello. All&#39;interno di spine dendritiche, una complessa rete di proteine ​​collegamento segnali extracellulari con il cyctoskeleton actina permettendo il controllo della morfologia e il numero di spine dendritiche. Gli studi neuropatologici hanno dimostrato che un certo numero di stati patologici, che vanno dalla schizofrenia ai disturbi dello spettro autistico, display anomalie morfologiche dendritiche colonna vertebrale o numeri. Inoltre, recenti studi genetici hanno identificato mutazioni in numerosi geni che codificano proteine ​​sinaptiche, portando a suggestioni che queste proteine ​​possono contribuire alla plasticità della colonna vertebrale aberrante che, in parte, alla base della fisiopatologia di questi disturbi. Per studiare il potenziale ruolo di queste proteine ​​nel controllo delle morfologie spine dendritiche / numero, l&#39;uso di colture di neuroni corticali offre diversi vantaggi. In primo luogo, questo sistema permette di imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche in cellule fisse e time-lapse imaging di cellule vive. In secondo luogo, questo sistema in vitro permette una facile manipolazione della funzione della proteina da parte espressione di proteine ​​mutanti, l&#39;abbattimento da costrutti shRNA, o trattamenti farmacologici. Queste tecniche permettono ai ricercatori di iniziare a sezionare il ruolo di proteine ​​associate alla malattia e per prevedere come le mutazioni di queste proteine ​​possono funzionare in vivo.

Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine ​​sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine ​​associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Le spine dendritiche sono le sedi della maggior parte delle connessioni eccitatorie all'interno del cervello e costituiscono il compartimento post-sinaptico delle sinapsi. Queste...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare gli effetti di diverse manipolazioni molecolari e farmacologiche sulla morfologia e sulla motilità delle spine dendritiche. Questo viene ottenuto sezionando neuronali corticali primari coltivati e trasfettati con GFP, con o senza espressione esogena di plasmidi di DNA, al fine di delineare la morfologia neuronale e manipolare l'espressione e la funzione delle proteine endogene. Nel secondo passaggio, le cellule possono essere trattate farmacologicamente e successivamente fissate per l'immunomarcatura o preparate per l'acquisizione di immagini in time-lapse.E quindi un trattamento farmacologico, che permetterà la visualizzazione delle spine dendritiche e dei cambiamenti indotti nella loro morfologia e motilità. Successivamente, vengono acquisite immagini in serie Z di cellule fissate o immagini di cellule vive prelevate in specifici punti temporali mediante microscopio confocale. Da proiezioni 2D delle immagini in serie Z è possibile effettuare misurazioni dettagliate della morfologia delle spine dendritiche.I risultati ottenuti mostrano l'effetto di manipolazioni molecolari o farmacologiche sulla morfologia o sulla motilità d

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Fonte: Pekarek, B. T., et. al., Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing. (2021)In questo video, dimostriamo la preparazione, l'imaging e l'analisi di un cervello di topo ripulito per esaminare gli arbori dendritici, la morfologia della colonna vertebrale e la distribuzione neuronale utilizzando la microscopia confocale e le tecniche di ricostruzione 3D.

Imaging al microscopio confocale di pergole dendritiche intatte e morfologia della colonna vertebrale in un cervello di topo pulito

Fonte: Gouder, et. al. Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da neuroni piramidali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2015).Questo video mostra l'imaging e l'analisi delle spine dendritiche in neuroni piramidali trasdotti e immunomarcati utilizzando la microscopia confocale. Il rumore di fondo è ridotto e i dendriti vengono tracciati stimandone il diametro e la lunghezza. La segmentazione automatizzata della colonna vertebrale comporta...

Quantificazione delle spine dendritiche mediante imaging al microscopio confocale

Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Descriviamo due metodi per la visualizzazione e la quantificazione dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di modelli murini: imaging in tempo reale e con profondità di campo estesa. Mentre il primo metodo consente un sofisticato tracciamento topografico e la quantificazione dell'estensione della ramificazione, il secondo consente una rapida visualizzazione dell'albero dendritico.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

Le spine dendritiche sono importanti caratteristiche cellulari del sistema nervoso. Qui vengono descritti metodi di imaging dal vivo per valutare la struttura e la funzione delle spine dendritiche in C. elegans. Questi approcci supportano lo sviluppo di schermi mutanti per i geni che definiscono la forma o la funzione della colonna vertebrale dendritica.

Imaging delle spine dendritiche in Caenorhabditis elegans

Il protocollo descrive una modifica del metodo rapido Golgi, che può essere adattato a qualsiasi parte del sistema nervoso, per la colorazione dei neuroni nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale del ratto.

Macchia rapida di Golgi per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale

Le spine dendritiche sono compartimenti post-sinaptici della maggior parte delle sinapsi eccitatorie. Le alterazioni della morfologia della colonna vertebrale dendritica si verificano durante lo sviluppo neurologico, l'invecchiamento, l'apprendimento e molti disturbi neurologici e psichiatrici, sottolineando l'importanza di un'analisi affidabile della colonna vertebrale dendritica. Questo protocollo descrive la quantificazione della morfologia della spina dendritica in modo accurato e...

Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali

Scopri l'analisi della morfologia delle spine dendritiche in colture di neuroni corticali primari utilizzando GFP e microscopia confocale. Questo metodo permette di studiare la plasticità sinaptica e le alterazioni strutturali.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

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