Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di valutare gli effetti di varie manipolazioni molecolari e farmacologiche sulla morfologia e sulla motilità della spina dendritica. Ciò si ottiene sezionando neuroni corticali primari in coltura con GFP, con o senza espressione esogena di plasmidi di DNA per delineare la morfologia neuronale e per manipolare l'espressione e la funzione delle proteine endogene. Nella seconda fase, le cellule possono essere trattate farmacologicamente e successivamente fissate in una colorazione immunologica o preparate per l'imaging time-lapse.

E poi il trattamento farmacologico, che permetterà di visualizzare le spine dendritiche e i cambiamenti indotti nella morfologia e nella motilità delle spine dendritiche. Successivamente, le immagini della serie Z di cellule fisse o le immagini di cellule vive scattate in punti temporali specifici vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale. Misurazioni dettagliate della morfologia della spina dendritica possono essere effettuate da proiezioni 2D di immagini della serie Z.

I risultati ottenuti mostrano l'effetto di manipolazioni molecolari o farmacologiche sulla morfologia o motilità della spina dendritica sulla base dell'analisi morfologica quantitativa della forma o della motilità della spina dendritica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze, come ad esempio come viene regolata la plasticità sinaptica? Come si sviluppano le sinapsi eccitatorie?

Come vengono mantenute o eliminate le sinapsi? In che modo le molecole, come i neurotrasmettitori o i geni, regolano la struttura delle sinapsi? Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi di base che sono alla base della regolazione delle sinapsi, può anche essere implicato per studiare il contributo dei geni associati alla malattia nell'alterare la struttura delle sinapsi, che è un segno distintivo di una serie di disturbi psichiatrici e neurologici come l'autismo, la schizofrenia o il morbo di Alzheimer.

Per prima cosa, prepara H-D-M-E-M bilanciando il pH del DMEM con hippie sterili da 10 millimolari. Scaldalo a 37 gradi Celsius. Successivamente trasferire i vetrini coprioggetto da 18 millimetri con le celle a 600 microlitri di terreno di preriscaldamento a 37 gradi Celsius, privo di antibiotici.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e integrarle con il 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Per ogni vetrino coprioggetto, aggiungere una quantità designata di DNA a 50 microlitri di H-D-M-E-M e lasciarlo riposare per cinque minuti. Quindi aggiungere quattro microlitri di lipo 2000 ad altri 50 microlitri di H-D-M-E-M e lasciarlo riposare anche per cinque minuti.

Mescolare accuratamente le due provette e conservarle in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius, integrata con il 5% di anidride carbonica per almeno 20 minuti. Quindi, aggiungi il composto goccia a goccia alle celle. Continuare a incubare le cellule nelle stesse condizioni per altre quattro ore, mescolare 300 microlitri di terreno di alimentazione preparato in precedenza a 400 microlitri di 37 gradi Celsius.

Terreni di alimentazione freschi. Quindi trasferire i vetrini coprioggetto con le celle nel terreno contenente sia il terreno di alimentazione vecchio che quello fresco. Lasciare che l'espressione dei plasmidi continui per altri due o tre giorni.

Preparare un liquido cerebrospinale con 200 micromolari D-L-A-P-V. Scaldalo a 37 gradi Celsius Quindi pre incubare. Il coperchio scivola in 900 microlitri di A CSF caldo per 30-60 minuti.

Preparare l'agente farmacologico dalla soluzione madre a una concentrazione di lavoro di 10 x diluendo la soluzione con A CSF. Aggiungere con cautela l'agente alle cellule fino a un volume finale di 1000 microlitri e una concentrazione finale di un agente X. Fissare i neuroni in 800 microlitri di 4% formaldeide, 4% saccarosio PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.

Lavarli due volte in PBS con cautela nello smaltimento dei rifiuti di formaldeide. Quindi fissare i neuroni con 800 microlitri di metanolo preriempito a quattro gradi Celsius su un blocco di ghiaccio per 10 minuti. Lavare due volte i vetrini coprioggetto in 800 microlitri di PBS ogni volta per 10 minuti.

Successivamente, gli occhi permeabili e bloccare le cellule contemporaneamente in PBS contenente il 2% di siero di capra normale e 800 microlitri di tritton X 100 allo 0,1% per un'ora. A temperatura ambiente, aggiungere gli anticorpi primari contro la GFP e l'epitopo o le proteine endogene al PBS contenente il 2% di siero di capra normale. Prendete poi un piatto da 15 centimetri, dividetelo in quadrati.

Numerali e coprili con paraforma. Aggiungere 80 microlitri di anticorpi e bloccare la miscela alla paraforma a una goccia per quadrato. Posizionare il vetrino coprioggetti sull'anticorpo e bloccare la miscela con le cellule rivolte verso il basso.

Ora sigillare il piatto con il param e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Lavare i vetrini coprioggetto in PB S3 volte ogni volta per 15 minuti. Diluire gli anticorpi secondari coniugati con Alexa in PBS contenente il 2% di siero di capra normale.

Incubare gli anticorpi secondari a temperatura ambiente per un'ora e proteggerli dalla luce. Lavare nuovamente le celle in PB S3 volte ogni volta per 15 minuti. Infine, montare i vetrini coprioggetti su vetrini da microscopio standard utilizzando il reagente Antifa prolungato Viene utilizzato un obiettivo a immersione in olio 63 x con un'apertura numerica di 1,4.

Acquisisci una sequenza di immagini come una serie Z a incrementi predeterminati. Ad esempio, 0,37 micrometri. Acquisire immagini fluorescenti con l'apposita linea laser.

Ad esempio, utilizzando un laser ad argon exci di linea a 488 nanometri e un filtro passa banda da 505 a 530 nanometri. Regolare il guadagno e l'offset del rivelatore in modo da creare un netto contrasto tra il segnale fluorescente nella colonna vertebrale e lo sfondo. Mantieni gli stessi parametri di acquisizione per tutte le scansioni all'interno dello stesso esperimento.

Il software Metamorph di molecular devices viene utilizzato per l'analisi delle immagini per esaminare le morfologie delle spine dendritiche, le immagini della serie Z con le massime ricostruzioni di proiezione e le immagini di sottrazione dello sfondo. Successivamente, seleziona il neurone che ha almeno due dendriti di 100 micrometri in totale e calibra la distanza richiesta. Quindi crea un'immagine binaria del neurone regolando la soglia dell'immagine per includere tutte le spine in modo che la soglia corrisponda esattamente al contorno delle spine.

Misurare le spine solo sui dendriti secondari e terziari per ridurre la variabilità. Effettuare le misurazioni dei segmenti tra i punti di diramazione. Delineare manualmente ogni dorso per formare un parametro chiuso.

Misura i parametri della colonna vertebrale, tra cui la lunghezza della colonna vertebrale, la colonna vertebrale, il respiro, l'area della sezione trasversale e la densità lineare della colonna vertebrale dendritica con metamorfosi. Quindi esporta i parametri morfometrici della spina dendritica in excel per la quantificazione e l'analisi statistica. Pre-incubare i neuroni cresciuti su vetrini coprioggetti di 22 x 22 millimetri in 1,5 millilitri di A CSF per 30-60 minuti.

In un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, integrato con il 5% di anidride carbonica. Quindi trasferire le cellule in una camera di imaging chiusa a 37 gradi Celsius per esaminare la motilità della colonna vertebrale, scegliere neuroni sani con morfologie perali che esprimono la ciliegia GFPM o la proteina nascosta fluorescente per ridurre al minimo il danno fotografico. Riduci la potenza del laser dallo 0,5 all'1%Quindi acquisisci le immagini utilizzando un obiettivo 63x e un'apertura numerica 1,4 con una media di due x ogni 10 minuti.

Immagina i neuroni per un'ora. Quindi perfondere il farmaco o il veicolo nella camera di imaging utilizzando un'immagine della pompa peristaltica. I neuroni per un'altra ora.

Raccogli le immagini della serie Z in ogni punto temporale alla fine di ogni sessione di imaging, ottieni un'immagine 10 x dell'intero neurone per accertare il livello di danno fotografico e ometti i neuroni che mostrano segni di disagio dalla quantificazione Prossimo collasso, immagini della serie Z di ogni punto temporale come ricostruzioni di massima proiezione in metamorfosi, A seconda della qualità dell'immagine e del livello di trasfezione, applicare un filtro di passaggio mediano o una sottrazione di sfondo per produrre immagini chiare per l'analisi per valutare il morphing della colonna vertebrale e il codice colore della motilità e sovrapporre le immagini scattate all'inizio, a metà e alla fine delle sessioni di immagini di 100 minuti in Metamorph, analizzare almeno 100 micrometri di dendrite per cellula. La frazione totale di motilità della colonna vertebrale è definita come il numero totale di eventi di motilità. Ad esempio, la retrazione dell'estensione, il morphing della testa o la motilità protrusiva normalizzati al numero della colonna vertebrale.

Questo metodo misura la frequenza degli eventi senza considerare la loro magnitudo ed è una stima generale della motilità complessiva. Un evento protrusivo è stato definito come la comparsa di una nuova sporgenza transitoria da una testa della colonna vertebrale o da un'asta dendritica. Un evento di retrazione è stato definito come la scomparsa di una sporgenza esistente o transitoria situata su una testa della colonna vertebrale o su un'asta dendritica.

La somma degli eventi di protrusione ed estensione è divisa per il numero totale di spine nella regione del dendrite che viene quantificata per valutare i cambiamenti nella morfologia delle singole spine in risposta al trattamento farmacologico. Misurare l'area della sezione trasversale delle spine dendritiche o la densità lineare della colonna vertebrale dendritica all'inizio della sessione di imaging, quindi in ogni punto temporale immediatamente prima e dopo il trattamento di perfusione, normalizzare ogni punto temporale a un'ora prima del punto temporale del trattamento. Quindi esporta i parametri morfometrici della spina dendritica in excel per la quantificazione e l'analisi statistica.

Ecco un esempio per mostrare che le aree delle microsfere fluorescenti di 0,52 e 1,0 micrometri, rispettivamente di 0,21 micrometri al quadrato e 0,78 micrometri al quadrato, sono misurate con precisione anche per le microsfere da 0,2 micrometri. Le misure sono abbastanza vicine alle dimensioni reali. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di un neurone corticale trasfettato con GFP ripreso utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 63x e un'apertura numerica di 1,4.

Ecco le immagini dettagliate ad alta risoluzione delle spine dendritiche. Un effetto ben caratterizzato degli stimoli dipendenti dall'attività è un aumento delle dimensioni della colonna vertebrale dendritica. Ecco un'immagine time-lapse rappresentativa di una spina dendritica di un neurone corticale DIV 24 che esprime EGFP riprodotta per 30 minuti prima e dopo uno stimolo dipendente dall'attività.

Questo esperimento time-lapse conferma che l'aumento delle dimensioni della colonna vertebrale dendretica è dovuto a stimoli dipendenti dall'attività: per esaminare la colonna vertebrale basale, le immagini della motilità vengono acquisite a tempo 0,0, 50 e 100 minuti. Le estensioni della colonna vertebrale, le retrazioni, la protrusione, la motilità e il morphing della testa sono misurati separatamente e combinati come motilità totale. Queste cifre confermano che, anche in condizioni basali, le spine dendritiche dei neuroni corticali mostrano un certo livello di motilità dopo questa procedura.

Altri metodi come la colocalizzazione dei recettori con altre proteine sinaptiche, la localizzazione delle proteine nelle sinapsi e le indagini elettrofisiologiche possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande riguardanti la regolazione della morfologia delle spine dendritiche e la coordinazione con la funzione delle sinapsi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi dettagliata della morfologia e della motilità della spina dendritica per valutare gli effetti di varie manipolazioni molecolari e farmacologiche sulla struttura delle sinapsi.