Name: Tutto il monte In Situ di E8.5 a E11.5 embrioni di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Impara l'ibridazione in situ su monte intero per studiare l'espressione genica in embrioni di topo E8.5-E11.5. Questo protocollo dettagliato consente di visualizzare pattern genici con riproducibilità.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede R21MH082360 (Cgcf) e R01HD056315 (NRM), così come l&#39;Università della Georgia.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi descritti in questo protocollo sono stati adattati da un certo numero di fonti diverse e ottimizzato per montare tutto E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita. Metodi per montare tutto ibridazione in situ degli embrioni dei vertebrati prima apparizione nei primi anni 1990 2,5-12. Questo protocollo è stato adattato principalmente dai metodi sviluppati per gli embrioni di Xenopus 7,8 e 2,11 del mouse. Nel nostro protocollo una grande enfasi è posta sulla valutazione de...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Digossigenina-11-uridina-5&#39;-trifosfato </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleosidi trifosfato Set </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne Spin rapido per radiomarcato purificazione dell&#39;RNA </td><td> Fornitura </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimerasi </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNA polimerasi </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi </td><td> Reagente </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I ricombinante, RNasi-free </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urea, incolore a bianco cristalli o polvere cristallina </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel di caricamento del buffer </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Fornitura </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Attrezzatura </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Eparina sodica </td><td> Reagente </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> 30% di perossido di idrogeno in acqua </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehyde, 8% EM di grado </td><td> Reagente </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> Usare con cautela secondo le istruzioni del produttore </td></tr><tr><td> Blocco reagente </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Fare in 5% fotografici e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Fai come 10 mg / ml di brodo e conservare a -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNasi T1 </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura Formammide </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisolo cloridrato </td><td> Reagente </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ribonucleico dal lievito torula, tipo VI </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> fenolo / cloroformio estratto più volte e precipitato, risospesi in DEPC-dH2O e conservati a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina-AP frammenti Fab </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Viola AP substrato, precipitando. Pronto da usare soluzione. </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ml, trasparente, chiuso Top, Deposito Vial Kit Convenienza </td><td> Fornitura </td><td> Scientifico nazionale </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Agitare N Bake ibridazione forno </td><td> Attrezzatura </td><td> Boekel scientifico </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsia Sure-Tek </td><td> Fornitura </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Inoltre tessuto mezzo di inclusione </td><td> Reagente </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way e getta di plastica tessuto embedding stampi </td><td> Fornitura </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Inoltre Microscopio diapositive </td><td> Fornitura </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reagente </td><td> Richard-Allan scientifico </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

tutto il monte in situ</emibridazione> di e8.5 a e11.5 embrioni di topo

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Montare tutto ibridazione in situ è un approccio molto informativo per la definizione di schemi di espressione genica negli embrioni. Le procedure di ibridazione in situ sono lunghi e tecnicamente impegnativo, con passi più importanti che insieme contribuiscono alla qualità del risultato finale. Questo protocollo descrive in dettaglio alcuni punti chiave del controllo della qualità per l&#39;etichettatura sonda l&#39;ottimizzazione e le prestazioni. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei passi fondamentali necessari per ottenere risultati di alta qualità riproducibile. In primo luogo, si descrive la generazione di digossigenina (DIG) sonde marcate nella trascrizione dell&#39;RNA tramite modelli in vitro di DNA generati mediante PCR. Ci descrivono tre saggi critici di controllo di qualità per determinare la quantità, l&#39;integrità e l&#39;attività specifica del DIG-sonde marcate. Questi passaggi sono importanti per la generazione di una sonda di sensibilità sufficiente per rilevare mRNA endogeni in un embrione di topo intero. Inoltre, si descrivono i metodi per la fissazione e lo stoccaggio di E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita per l&#39;ibridazione in situ. Poi, si descrive metodi dettagliati di limitata digestione proteinasi K degli embrioni reidratati seguita da i dettagli delle condizioni di ibridazione, di post-ibridazione lavaggi e trattamenti per eliminare RNAsi non specifici ibridazione sonda. AP-coniugato anticorpale è utilizzato per visualizzare le sonda marcata e rivelare il pattern di espressione del trascritto endogena. Risultati rappresentativi sono riportati da esperimenti di successo e tipici esperimenti non ottimale.

Questo monte tutto<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; protocollo discute passaggi critici che assicurano riproducibile risultati di alta qualità per gli studi di espressione genica in E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

L'ibridazione in situ su intero campione è un approccio molto informativo per definire i pattern di espressione genica negli embrioni. Le procedure di ibridazione in situ...

L'obiettivo generale di questa procedura è definire i modelli di espressione genica in embrioni interi di topo. Questo viene ottenuto innanzitutto progettando e generando una sonda ribo specifica per il gene di interesse. Successivamente, gli embrioni vengono raccolti e trattati per ibridazione.Successivamente, la sonda marcata viene ibridata con gli embrioni. L'ultimo passaggio consiste nella visualizzazione della sonda ibridata mediante rilevamento immunohistochimico. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano i modelli di espressione genica in embrioni interi o in sezioni embrionali.Dopo l'acquisizione delle immagini con un microscopio stereoscopico, un microscopio da dissezione o un comune microscopio a campo chiaro, in genere i principianti incontrano difficoltà poiché le procedure di ibridazione in situ sono lunghe e tecnicamente impegnative, e comprendono diverse fasi importanti che contribuiscono complessivamente alla qualità del risultato finale. Per prima cosa, generare il DNA stampo amplificando la sequenza di interesse mediante primer specifici per il gene, progettati con sequenze promotrici per la trascrizione in senso inverso agli estremi 5'. Successivamente, purificare il prodotto della PCR ed eseguire un trattamento con proteasi K seguendo il protocollo scritto.Quindi impostare una reazione di trascrizione in vitro e incubare alla temperatura ottimale per due ore. Dopo la digestione del DNA del template, purificare la sonda ribo mediante purificazione su colonna, stimare il rendimento della sonda utilizzando un NanoDrop o un lettore di assorbanza per micropiastre. Successivamente, regolare la concentrazione della sonda a 100 nanogrammi per microlitro in base al rendimento stimato.Quindi verificare la qualità della sonda mediante elettroforesi su gel di acrilamide denaturante come descritto nel protocollo scritto e misurando l'attività specifica della sonda RIBA; una buona sonda dovrebbe produrre una singola banda distinta sul gel con minima diffusione. Per misurare l'attività specifica, eseguire diluizioni seriali della sonda ribo per ottenere un intervallo di diluizioni da 10 alla meno due a 10 alla meno cinque. Quindi pipettare un microlitro di ciascuna diluizione su un pezzo di membrana High Bond N+ di 82 millimetri di diametro, insieme a un microlitro di un campione di DNA non marcato come controllo. Incrociare immediatamente il filtro in un incrociatore UV a 125 millijoule dopo l'incrocio.Aggiungere 10 millilitri di reagente bloccante all'1% in tampone TN 1x e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti dopo il completamento del bloccaggio. Rimuovere la soluzione bloccante e lavare il filtro per 15 minuti a temperatura ambiente con 10 millilitri di tampone TN 1x durante il lavaggio della membrana. Preparare una diluizione da 1 a 5.000 di anti-digossina nel frammento FAB in 10 millilitri di tampone TN 1x dopo il lavaggio.Incubare la membrana in questa soluzione per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare la membrana due volte per 15 minuti ciascuna in 10 millilitri di tampone TN 1×. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare la soluzione di lavaggio dalla piastra di Petri e sostituirla con cinque millilitri di substrato BM purple. Incubare la membrana in questa soluzione per 30 minuti.Trascorsi 30 minuti, verificare la presenza sul filtro di un segnale visibile proveniente dal punto corrispondente alla diluizione 10 alla meno quattro. Se il segnale è visibile, arrestare la reazione cromogenica lavando due volte con TE per cinque minuti ciascuna. Se dopo 30 minuti non è visibile alcun segnale, la sonda deve essere scartata.Raccogliere gli embrioni di topo in PBST freddo su ghiaccio. Quindi ordinare gli embrioni in base al genotipo in provette file da quattro millilitri contenenti PBST. Fissare gli embrioni con PARALDEIDE al 4% in PBST, salvo diversa indicazione.Tutti i passaggi di incubazione e lavaggio vengono eseguiti con soluzioni riempite fino al livello inferiore del collo della provetta, pari a un volume di circa quattro millilitri. Lasciare gli embrioni tutta la notte a quattro gradi Celsius dopo la fissazione. Aspirare il paraformaldeide al 4% in PBST mediante una pipetta di vetro per pasta e sostituire con PBST.Posizionare la provetta sul ghiaccio per cinque minuti per lavare. Ripetere questo processo per lavare il tessuto una seconda volta. Successivamente, aspirare il PBST e disidratare gli embrioni in modo progressivo attraverso una serie di metanolo in PBST fino a raggiungere il metanolo al 100%.Si noti che la punta della pipetta viene mantenuta sul lato opposto del vial per evitare danni agli embrioni; se necessario, gli embrioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius in metanolo al 100% per un periodo fino a otto mesi o forse più lungo, fino all'uso. Trasferire gli embrioni in una piastra, quindi praticare una piccola incisione al cuore e alla testa degli embrioni di E 10,5 e di età superiore con un bisturi da microdissezione, mentre gli embrioni sono ancora in metanolo. Questo permette alle soluzioni di lavaggio di penetrare nei ventricoli cerebrali e nelle camere cardiache e riduce la colorazione di fondo.Quindi reidratare gli embrioni mediante lavaggi successivi in una serie di metanolo in PBST. Concludere con due lavaggi di cinque minuti ciascuno in PBST al 100%, quindi sbiancare gli embrioni preparando una soluzione di quattro parti di PBST e una parte di perossido di idrogeno al 30% e incubando gli embrioni in questa soluzione per un'ora sul ghiaccio. Durante l'incubazione, portare il tampone di ibridazione appena preparato a 65 gradi Celsius per preriscaldarlo.Lavare gli embrioni con PBST due volte per cinque minuti ciascuna. Durante l'ultimo lavaggio, preparare una soluzione stock di proteinasi K a 20 milligrammi per millilitro con acqua DEPC. Successivamente, diluire in serie la soluzione stock per ottenere una concentrazione di 10 microgrammi per millilitro.Proteinasi K in PBST aspirare la soluzione dell'ultimo lavaggio e sostituirla con un millilitro di soluzione di proteinasi K a 10 microgrammi per millilitro. Posizionare il vial verticalmente in un rack per provette all'interno di un bagno termico a 25 gradi Celsius e incubare per 10-30 minuti, a seconda delle dimensioni degli embrioni. Annotare l'orario di inizio come ottimale e riproducibile.Il tempo di incubazione è fondamentale per consentire la penetrazione della sonda ribosomiale senza un'eccessiva digestione dell'embrione. Per arrestare la digestione con la proteasi K, aspirare la soluzione di proteinasi K 30 secondi prima del termine del tempo di incubazione. Al termine del tempo di incubazione, aggiungere glicina appena preparata a due milligrammi per millilitro in PBST.Rimaniamo in incubazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi ripetere il lavaggio con glicina per altri cinque minuti. Successivamente eseguire due lavaggi in PBST di cinque minuti ciascuno.Successivamente, fissare nuovamente gli embrioni trattati con proteinasi K immergendoli in PARALDEIDE 4% in PBST integrato con glutaraldeide 0,2% per 20 minuti. Lavare quindi gli embrioni in PBST tre volte, per cinque minuti ciascuna. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il PBST e sostituirlo con un millilitro di buffer di ibridazione preriscaldato.Una volta che gli embrioni si sono depositati, aspirare il tampone di ibridazione e sostituirlo con un millilitro di tampone di ibridazione fresco preriscaldato. Incubare i vial verticalmente in un forno a 65 gradi Celsius con piattaforma oscillante per un'ora. Preparare il tampone di ibridazione contenente 0,5 microgrammi per millilitro di ribo marcato.Utilizzare la sonda per embrioni fino a E 8,5 oppure da 0,1 a un microgrammo per millilitro di sonda per embrioni successivi a E 8,5. Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di pre-ibridazione con 0,4 millilitri di questa soluzione e procedere con l'ibridazione durante la notte a 65 gradi Celsius. Il giorno successivo, verificare la qualità degli embrioni.Se gli embrioni sono stati trattati eccessivamente con proteinasi K, potrebbero attaccarsi alle pareti del vial, apparire estremamente trasparenti o disintegrarsi. Gli embrioni che presentano queste caratteristiche devono essere scartati, poiché un ulteriore trattamento non produrrà dati interpretabili. Sostituire il buffer di ibridazione con quattro millilitri di soluzione.Uno a 70 gradi Celsius. Mantenere questa temperatura e lavare due volte per 30 minuti ciascuna per embrioni E 8,5 o tre volte per 30 minuti per ogni lavaggio. Per embrioni E 9,5 e più vecchi durante l'ultimo lavaggio, preparare quattro millilitri di soluzione al 50%, una soluzione al 50% due per ogni provetta e preriscaldare a 70 gradi Celsius dopo l'ultimo lavaggio.Incubare gli embrioni in questa soluzione per 10 minuti, quindi lavare tre volte per cinque minuti per ogni lavaggio con quattro millilitri di soluzione. Due a temperatura ambiente con agitazione dopo il lavaggio. Sostituire la soluzione con soluzione fresca.Due contenenti 100 microgrammi per millilitro di RNA A e 100 unità per millilitro di RNA T, incubare a 37 gradi Celsius due volte per 30 minuti per ogni lavaggio. Successivamente, lavare la soluzione tre a 65 gradi Celsius con movimento oscillatorio due volte per 30 minuti per ogni lavaggio per E 8,5 e tre volte per 30 minuti per ogni lavaggio per E 9,5 e superiore. Infine, lavare tre volte per cinque minuti per ogni lavaggio con TBST 1x.Procedere quindi con la rilevazione dell'anticorpo. Aspirare l'ultimo lavaggio con TBST dal vial e sostituirlo con 0,5 millilitri di TBST 1x più siero di pecora trattato termicamente al 10%. Posizionare il vial verticalmente su un agitatore a piattaforma a temperatura ambiente e incubare con movimento oscillante per almeno due ore e mezza per bloccare i siti di legame non specifico degli anticorpi.Trascorso il tempo di incubazione, aspirare la soluzione bloccante e sostituirla con una soluzione fresca di TBST aggiunta di siero al 10%, contenente un'anticorpo di fosfatasi alcalina coniugata con frammenti FAB di pecora, diluito da uno a 2000 a uno a 5.000, e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare tre volte per cinque minuti ciascuno con TBST al 1x. Quindi lavare cinque o sei volte per un'ora ciascuno a temperatura ambiente e infine tutta la notte a quattro gradi Celsius per rimuovere l'eccesso di anticorpo.Il giorno successivo, lavare gli embrioni due volte per 20 minuti per ogni lavaggio con tampone di fosfatasi alcalina appena preparato. Questa è una procedura importante per ridurre il fondo.Sostituire l'ultimo lavaggio con un millilitro di substrato AP viola BM preriscaldato. Incubare a temperatura ambiente, protetto dalla luce, e controllare periodicamente il segnale mediante microscopio stereoscopico. Per messaggeri abbondanti.L'RNA dovrebbe essere visibile entro 15 minuti. Quando il segnale è chiaramente visibile o se la colorazione di fondo inizia a rappresentare un problema, interrompere la reazione lavando due volte per cinque minuti per ogni lavaggio con PBST una volta più EDTA 5 millimolare, quindi acquisire immagini per documentare il modello di colorazione dell'embrione intero. Una volta completata questa fase, riposizionare gli embrioni in un vial contenente substrato BM purple e incubare per 16-24 ore a temperatura ambiente fino a quando la superficie esterna dell'embrione diventa blu scuro, in modo da permettere alla colorazione di penetrare in tutto l'embrione.Quindi trasferire gli embrioni in paraformaldeide al 4% in PBST per una nuova fissazione di alcune ore o durante la notte a quattro gradi Celsius. Questo passaggio finale di fissazione è fondamentale per la conservazione a lungo termine del profilo di colorazione. Infine, procedere all'impregnazione in paraffina, all'inclusione e alla sezionatura seguendo le procedure descritte nel protocollo scritto per rivelare questa colorazione.Questa immagine mostra un montaggio su vetrino riuscito in ibridazione in situ su sezioni di un embrione di E 10,5 utilizzando una sonda riboprobes specifica per gata tre. Qui è mostrato un embrione di E 11,5 che è stato etichettato con successo con una sonda riboprobes specifica per Fox G uno. Questa immagine mostra un fondo elevato e un segnale debole proveniente da un'ibridazione in situ su sezioni fallita, effettuata con una sonda per gata tre parzialmente degradata, illustrando l'importanza di eseguire un rigoroso controllo di qualità delle sonde per garantire risultati di alta qualità.Di seguito è mostrata un'immagine di un'altra procedura non riuscita. In questo caso, la procedura è stata eseguita senza perforare la testa, causando un elevato livello di colorazione di fondo nei ventricoli, come indicato dalle teste delle frecce. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'ibridazione in situ di alta qualità per definire i modelli di espressione genica negli embrioni di topo, con dettagli spaziali e confronti temporali o tra genotipi.

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

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Biologia

Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Presentiamo qui un protocollo ottimizzato per genotipizzare, colorare e preparare topi fetali per l'imaging di proiezioni di assoni nocicettori periferici nell'intero animale, come metodo efficace per valutare i fenotipi di crescita degli assoni sensoriali nello sviluppo di topi geneticamente modificati.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

Dimostriamo un metodo per innestare cellule coltivate in siti definiti di embrioni di topo precoci per determinare il loro potenziale in vivo. Introduciamo anche un metodo di elettroporazione ottimizzato che utilizza capillari di vetro di diametro noto, consentendo la consegna precisa di DNA esogeno in alcune cellule degli embrioni.

Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

Descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando la microscopia episcopica ad alta risoluzione per acquisire immagini tridimensionali (3D) di embrioni di topo. Questo protocollo migliorato utilizza un metodo di preparazione dei tessuti modificato per migliorare la penetrazione del colorante fluorescente, consentendo così l'analisi morfometrica di campioni sia di piccole che di grandi dimensioni.

Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia

Il nodo e la piastra notochordal sono transitori organizzatori nello sviluppo di embrioni del mouse che possono essere visualizzati utilizzando diverse tecniche di segnalazione. Qui, descriviamo in dettaglio come eseguire due delle tecniche per studiare la loro struttura e morfogenesi: 1) microscopia elettronica (SEM); e 2) intero supporto immunofluorescenza (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

Vi presentiamo i protocolli per esaminare lo sviluppo del cuore del mouse usando la microscopia intero Monte epifluorescente su embrioni di topo sezionati da ventricolare specifico MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in. Questo metodo permette di visualizzare direttamente ogni fase della formazione ventricolare durante lo sviluppo del cuore del mouse senza laboriosi metodi istochimici.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

Classicamente, l'endocardio del primordium della valvola embrionale di topo è stato analizzato utilizzando sezioni trasversali, coronali o sagittali. Il nostro nuovo approccio per l'imaging bidimensionale dell'endocardio nelle regioni valvulogeniche consente l'analisi della polarità planare e del riarrangiamento cellulare dell'endocardio durante lo sviluppo della valvola.

En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Impara l'ibridazione in situ su monte intero per studiare l'espressione genica in embrioni di topo E8.5-E11.5. Questo protocollo dettagliato consente di visualizzare pattern genici con riproducibilità.

Tutto il monte In Situ di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

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