Metodo di particelle agglutinazione per l'identificazione Poliovirus

L'obiettivo generale della seguente procedura è identificare rapidamente un virus della poliomielite isolato utilizzando un semplice protocollo. Per questo test, utilizziamo particelle di gelatina sensibilizzate rivestite con molecole chimeriche contenenti il dominio extracellulare del recettore del poliovirus umano collegato a IgG due fc. Poiché queste particelle hanno un'affinità uniforme per tutti i sierotipi di isolati di poliovirus, l'agglutinazione delle particelle avviene dopo l'incubazione con campioni contenenti qualsiasi poliovirus umano.

Tuttavia, se sono presenti anticorpi in grado di riconoscere lo specifico virus che isola il campione, si verifica la neutralizzazione e previene l'agglutinazione utilizzando questo sistema sperimentale, l'identificazione rapida degli isolati di poliovirus può essere eseguita in una singola reazione di fase. Il vantaggio principale di questa tecnica del recipiente esistente, come il test di neutralizzazione convenzionale, è la semplicità SIM della procedura e dell'interpretazione, con l'obiettivo di ridurre il lavoro e accelerare la richiesta e abbreviare i tempi per i risultati. Per ricostituire gli anticorpi anti PV uno, PV due e PV tre, aggiungere 0,5 millilitri di acqua a ciascuna fiala.

Quindi trasferire ciascuna soluzione anticorpale in provette separate contenenti 4,5 millilitri di terreno di manutenzione. Alcuni lotti di anticorpi anti PV sono forniti in forma ricostituita per tali lotti di anticorpi anti PV. Non è necessaria l'aggiunta di acqua per la ricostituzione.

Successivamente, preparare miscele uno a uno di soluzione anticorpale combinata con un volume finale di 3,6 millilitri in provette appena etichettate. Ad esempio, mescola 1,8 millilitri di anti PV uno con 1,8 millilitri di anti PV due. Per preparare una combinazione anti PV uno più PV due, ripetere l'operazione per ogni possibile combinazione a coppie e preparare anche una soluzione contenente tutti e tre i tipi di anticorpi mescolando insieme 1,2 millilitri di ciascun antisiero.

Una volta effettuate le quattro miscele a 720 microlitri di FCS per ogni soluzione anticorpale. Ciò contribuirà a ridurre l'agglutinazione non specifica delle particelle di gelatina da parte degli anticorpi durante il test. I pool di anticorpi possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzati nel test di agglutinazione.

In questo test, utilizziamo particelle di gelatina liofilizzata che sono state rivestite con i domini extracellulari del recettore del poliovirus umano e IgG due domini FC di topo. Assicurarsi di utilizzare un singolo lotto di particelle e non lotti diversi in un esperimento per garantire la coerenza dell'immagine di agglutinazione per ricostituire le particelle a 1,5 millilitri di tampone di ricostituzione per ciascuna fiala. Picchiettare delicatamente per mescolare bene.

Le particelle ricostituite possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Innanzitutto, progetta il tuo esperimento in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Per ogni campione, il pozzetto numero uno conterrà solo il virus.

I pozzetti da due a cinque conterranno il virus più una delle quattro soluzioni anticorpali miste. Assicurati di conservare un pozzetto per un controllo negativo contenente solo terreni senza virus o anticorpi. Una volta che la piastra è stata impostata, aggiungere 12 microlitri della soluzione anticorpale corretta a ciascun pozzetto dalle file due fino a cinque e 12 microlitri di crescita.

Medio al solo virus, pozzetti nella prima fila e al pozzetto di controllo negativo nella sesta fila. Quindi, aggiungere 12 microlitri di campione di virus nelle prime cinque file e 12 microlitri di terreno di coltura al pozzetto di controllo negativo nella sesta fila. Una volta che gli anticorpi e il virus sono stati placcati, sospendi le particelle di gelatina ricostituite picchiettandole delicatamente e aggiungi immediatamente 25 microlitri di particelle per pozzetto a tutti i pozzetti.

È importante non lasciare che le particelle si depositino prima di trasferirle sulla piastra per ottenere quantità uguali di particelle in ciascuna. Posizionare la piastra di analisi su un miscelatore a piastre e mescolare per 30 secondi. Quindi posizionare la piastra su un foglio di carta bianca e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore per consentire l'agglutinazione.

È importante non spostare mai la piastra durante o dopo l'incubazione poiché l'agglutinazione formata è instabile. Una volta avvenuta la reazione, scattare diverse foto della piastra in cui si può apprezzare la qualità dell'agglutinazione in ogni pozzetto. Nei pozzi in cui non si è verificata l'agglutinazione, come mostrato qui a sinistra, le particelle di gelatina colorate precipiteranno sul fondo del pozzo nei pozzi in cui si è verificata l'agglutinazione.

A causa dell'interazione tra il virus e il pvr, IgG due particelle di gelatina rivestite di A, è visibile un modello colorato diffuso come mostrato al centro. In questo esperimento, abbiamo testato la capacità delle soluzioni virali, PV uno, due e tre, di indurre glu in presenza dell'anticorpo. Combinazioni indicate come mostrato qui in assenza di virus o anticorpi, non si verifica alcuna agglutinazione e le particelle di gelatina precipitano al contrario nel virus ben contenente, ma non negli anticorpi.

L'agglutinazione si è verificata a causa dell'interazione del virus. Con le due particelle di gelatina ricoperte di PVR IgG nei pozzetti sperimentali, si impedisce una nazione di eccesso dei virus in qualsiasi pozzetto contenente anticorpi che neutralizzano specificamente quel virus. Ad esempio, un eccesso di poliovirus di tipo 1 viene impedito in pozzetti contenenti anticorpi anti PV uno, ma non in pozzetti contenenti solo anticorpi anti PV due e anti PV tre.

Lo stesso vale per il poliovirus di tipo due e tre. Sebbene sia master, questa tecnica può essere eseguita in appena tre ore se eseguita correttamente.