Name: Sorveglianza dellinfluenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Scopri il metodo per isolare e identificare l'influenza aviaria da campi fecali di uccelli selvatici utilizzando le carte FTA. Questa tecnica consente l'analisi ad alto rendimento senza necessità di catena del freddo.

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Ringraziamo Dibbits Bert per assistenza tecnica. L&#39;allevamento degli animali e il Gruppo Genomica, Università di Wageningen, Paesi Bassi, generosamente ci ha ospitato nel loro laboratorio. Il personale del Uccello Ottenby Observatory, in Svezia, si ringrazia per la cattura e il campionamento dei germani reali, in particolare Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Ringraziamo Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres per riprese a Ottenby, e Mano Camon per le riprese in laboratorio. Daniel Bengtson fornito fotografie anatra bello per la parte video di questa pubblicazione. Ulteriore materiale libero da la Biblioteca immagine CDC pubblica (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) è stato utilizzato: il microscopio elettronico (n. 280; dal Dott. Erskine Palmer) e illustrazione (n. 11823; da Douglas Giordania) del virus dell&#39;influenza. Il sostegno finanziario è stato dato dal KNJV (Royal Paesi Bassi Hunters Association), il Ministero olandese dell&#39;Agricoltura, della Faunafonds e la Stichting de Trusts Eik (sia in Olanda), il Consiglio svedese della ricerca (Grant no. 2007-20774) e la CE -fondato Newflubird progetto. Prodotti chimici isolamento di RNA sono stati un dono generoso di Ambion, Inc, l&#39;azienda RNA. Questo è il contributo n. 245 dal Bird Ottenby Osservatorio.

1. Anatra trapping e tamponamento cloacali <ol><li> Trappola dabbling anatre del genere Anas (o di altri volatili) in una gabbia di attirarli con le anatre esca o cibo, e metterli in scatole di cartone individuale. Tempo di trasporto nella scatola dovrebbe essere ridotto al minimo, per esempio, con l'installazione di una stazione di campo a breve distanza per la trappola. Circostanze logistiche possono variare in ogni studio. La consulenza e l'approvazione del relativo animale comitato etico deve essere ricercata per ogni nuovo set-up. In alternativa, anche cacciatore di uccelli abbattuti si possono degustare. </li><li> Estrarre il anatra della scatola tenendo le ali stretto al suo corpo. Esempio di un dropping fresca, che sarà presente nella maggior parte dei casi, direttamente dalla parte inferiore della scatola. Raccoglierli con un tampone sterile e applicare il liquido ad una carta Whatman FTA. In caso contrario, eseguire tampone cloacale. </li><li> Accendere l'anatra sulla sua schiena. Questo consente l'accesso alla cloaca e facilita campionamento. La cloaca è una struttura sporgente situata sotto l'addome, vicino alla base della coda. Una persona con esperienza poteva contenere l'uccello e il campione, allo stesso tempo, oppure una seconda persona può aiutare. </li><li> Inserire con cautela il tampone sterile in plastica rayon (Copan, Italia) circa 1 cm e fare un dolce vortice della cloaca. Rotolare il tampone con i fluidi dalla cloaca sulla superficie di una carta Whatman FTA. Dopo il campionamento è stato effettuato l'immediato rilascio degli animali è auspicabile. </li><li> Asciugare le carte FTA a temperatura ambiente per almeno 1 ora, quindi archiviare ogni campione singolarmente in sacchetti di carta (es. buste). Lo storage è possibile a temperatura ambiente, possibilmente con perline di silice nei climi umidi. L'invio e la ricezione di biosicurezza istituzioni ufficiali 'può permettere di mandare le carte accordo di libero scambio per posta ordinaria, dal momento che i patogeni diventano inattivi a contatto con la superficie della carta FTA. </li></ol> 2. Isolamento di RNA virale <ol><li> Estrarre il materiale carta FTA tra cui feci / fluido cloaca. Punch tre dischi con un perforatore 2 millimetri Harris e luogo tutti coloro in un pozzo di una piastra di RNasi libero 96well. Tra ogni nuovo campione, pulire accuratamente il nemico con l'alcol e una precisione Kim wipe (Kimtech). Usare sempre controlli positivi e negativi. Un controllo positivo può essere costituito da un ceppo di laboratorio appena applicato a una carta di accordo di libero scambio o di un campione naturale che è conosciuto per produrre un risultato positivo. Come controllo negativo, punch out dischi da una scheda vuota FTA. Inoltre, lasciare libero un altro pozzo per un controllo PCR dopo nel tuo esperimento (con l'acqua come modello). </li><li> Aggiungere 70μl RNA soluzione di estrazione rapida (Ambion) e termosaldato la piastra (AbGene Thermo-Sealer). Incubare 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente con la velocità stabilito che non provoca spill-over (questo dipende dal modello di piastra utilizzata shaker; test in anticipo). </li><li> Carry isolamento virale RNA secondo protocolli del produttore con il MagMAX-96 Kit di isolamento virale RNA (Ambion). In breve: Aggiungere 130μl preparato lisi / soluzione vincolante (dal kit) in ogni pozzetto. Trasferire 50μl estratto materiale carta FTA in ciascun pozzetto. Agitare piastra per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 20μl miscela preparata tallone (dal kit) per ogni campione e mescolare pipettando su e giù. Agitare sulla velocità determinato per 5 minuti. Molecole di RNA si legano al sfere magnetiche. </li><li> Spostare la piastra ad una magnetica a 96 pozzetti stand per catturare le sfere. A seconda del modello di supporto magnetico utilizzato, questo può richiedere più di 5 minuti. Quando la soluzione si è rivelata del tutto chiare, rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la piastra dal supporto magnetico. </li><li> Lavare le perle due volte con la soluzione di lavaggio 1 e due volte con soluzione di lavaggio 2 (dal kit). Per ognuna delle 4 fasi di lavaggio aggiungere 150μl soluzione preparata di lavaggio per ogni campione, agitare per 1 minuto a velocità determinata, spostare il piatto per il supporto magnetico, la cattura perline per circa 5 minuti (o fino a quando la soluzione è del tutto chiaro), rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la placca dalla base magnetica, aggiungere la soluzione successiva lavaggio, ed eseguire le fasi di lavaggio come in precedenza. Dopo la fase di lavaggio scorso, rimuovere soluzione di lavaggio per quanto possibile, e aria secca le perline a temperatura ambiente nello shaker piastra per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 50μl di tampone di eluizione (dal kit) per liberare l'RNA dalle perline e agitare per 4 minuti in agitatore. Cattura perle come descritto in precedenza. Il supernatante ora contiene l'RNA isolato che è pronta per le applicazioni a valle. </li></ol> 3. RT-PCR di Matrix AIV Gene Effettuare PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) con l'accesso di uno stadio di RT-PCR system (Promega) in 25 microlitri reazioni (regolato da Kraus et al 18 e Fouchier et al 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 tampone </td> 5μl </tr><tr><td> dNTP </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Primer M52C 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Primer M253R 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV della trascrittasi inversa (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Polimerasi TfL (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA campione </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Condizioni di PCR in un T1 Biometra termociclatore sono: la trascrizione inversa iniziale di 45 minuti a 45 ° C, seguito da 2 minuti denaturazione iniziale a 94 ° C e 40 cicli di: 94 ° C per 1 minuto, 56 ° C per 1 minuto, e 68 ° C per 2 minuti. Un allungamento altri 7 minuti a 68 ° C si conclude l'amplificazione. 4. Screening per AI-I campioni positivi e Purificazione di frammenti mirate da Gel <ol><li> 2μl carico del prodotto della PCR mescolato con 2μl colorante carico 5x (BioRad) e l'acqua 6μl su un 1% gel (Roche) colorato con bromuro di etidio 1% (2.5μl per 100 ml di gel) per un pre-screening. </li><li> Esegui il gel per 1 ora a 120V, con un formato standard di DNA (BioRad carico EZ 100 bp ladder), visualizzare con un sistema di documentazione del gel. Vedere un esempio in Figura 1. </li><li> Selezionare i campioni con frammenti amplificati nella gamma di dimensioni previste (tra 200 bp e 300 bp (frammento obiettivo è di 244 bp). Carico l'intero volume di reazione di PCR (di cui ~ 23μl sono a sinistra) di questi candidati con 6μl colorante carico 5x su un 2 etidio bromuro% gel colorato e correre per 2 ore. </li><li> Posizionare il gel su un transilluminatore UV (Bioblock scientifico) e ispezionato visivamente. Vedere un esempio in Figura 2. Bande di accisa di dimensioni corrette da gel con un bisturi e posto in provette 1,5 ml individuali di reazione. Purificare frammenti di gel, per esempio con il Zymoclean Recovery Kit DNA Gel (Zymo Ricerca). </li></ol> 5. Sequenziamento ed identificazione dei prodotti PCR <ol><li> Effettuare Sanger sequenziamento dei frammenti di destinazione, ad esempio su un sequenziatore ABI 3730 capillare con ABI Big Dye 3,1 chimica (Applied Biosystems). Preparare reazioni di sequenziamento dei volumi 10μl contenente 10-20 ng gel purificato modello cDNA, buffer 1.75μl diluizione 5x, 0.5μl Big Dye premix V3.1, 1 fondo microlitri avanti (M52C 20, 10 mm) e ddH2O. Condizioni di ciclismo sono: 1 min denaturazione iniziale, seguita da 25 cicli di: 10 s a 96 ° C, 5 s a 45 ° C e 4 minuti a 60 ° C. Purificare e preparare la reazione di sequenziamento secondo i protocolli interni. </li><li> Identificare sequenze di cDNA risultante nei database nucleotidici come GenBank23, ad esempio strumenti web based come BLAST presso il Centro Nazionale for Biotechnology Information (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Germano reale (Anas platyrhynchos) sono state campionate in Ottenby Bird Observatory nel dicembre 2007. Da ogni germano reale su un campione FTA scheda è stato preso come descritto in questo protocollo. Dopo la spedizione, le carte FTA sono stati tenuti in un congelatore a -20 ° C per due anni. Lo stesso campione di carta FTA del laboratorio di isolare testato in Kraus et al. 18 è stato incluso come controllo positivo, così come nove dieci volte diluizioni seriali di esso. Due sono stati i controlli negativi) l'estrazione da una scheda vuota accordo di libero scambio, per verificare se ci fosse riporto dal perforatore, e ii) RT-PCR, reazione in cui è stato utilizzato nucleasi acqua libera, come modello, per verificare se la contaminazione si è verificato durante o in preparazione della reazione PCR. 84 campioni sono stati analizzati. Una foto gel dei prodotti di PCR da questi 84 campioni possono essere trovati nella Figura 1. Da campioni naturali una moltitudine di bande non specifiche può essere osservato a causa della presenza di contaminazioni microbiche diverse nelle feci. Tuttavia, il frammento di destinazione della coppia di primer è di 244 bp lungo. L'intera reazione PCR volume di un sottoinsieme dei campioni che hanno prodotto frammenti in circa la gamma di dimensioni corrette (tra 200 bp e 300 bp) è stato caricato su gel (Figura 1). Un esempio di quale delle bande sono state tagliate dal gel si possono trovare nella figura di complemento 1. In aggiunta al controllo positivo, due di questi campioni (69.899 e 69.912) sono risultati positivi dal nuovo protocollo. Una ricerca BLAST contro il database NCBI nucleotide rivelato la loro identità di AI matrice gene (Figura 3), mentre tutte le altre band assomigliava sequenze batteriche più da vicino, o non producono una sequenza leggibile a tutti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Immagine gel di uno screening preliminare dei prodotti di PCR. Microlitri 2 prodotto PCR di controllo positivo, sdiluizioni erial del controllo positivo, due controlli negativi e 84 campioni cloacali sono stati caricati. 48 campioni sono mostrati nel pannello in alto gel, e 48 campioni nel pannello inferiore. Frecce rosse indicano corsie gel utilizzato per 100 bp DNA di dimensioni standard. Per esempio, cerchi rossi mostrano bande nel range dimensioni previste. Cerchi blu indicano un amplicone aspecifica (in alto a sinistra) o di un manufatto dimero iniettore di sotto di 100 bp nel formato (in basso a destra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Selezione dei campioni con frammenti nell'intervallo di grandezza corretto. Campioni con bande tra 200 bp e 300 bp (target frammento di 244 bp) sono stati scelti. La freccia verde indica il controllo positivo, le due frecce rosse indicano i campioni che sono stati confermati da AIV positiva mettendo a confronto le loro sequenze cDNA al database NCBI nucleotide. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Cattura dello schermo di una ricerca BLAST rappresentante NCBI. Una delle sequenze cDNA ottenuto dai frammenti asportati è stato interrogato sul database nucleotide sul sito NCBI. Il campione viene correttamente identificate come frammento AI gene Matrix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Per visualizzare la versione completa di dimensioni di questa immagine, clicca qui.</a> <img alt="Figura supplementare 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Supplementare Figura 1"> Supplementare Figura S1. Bande di campioni selezionati escisse dal gel. Questa foto è stata scattata dal gel rappresentato in figura 1, dopo le bande candidato tra 200 bp e 300 bp sono stati tagliati fuori.

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</ol>

Cattura, manipolazione e degustazione di uccelli sono stati fatti a seguito della legislazione nazionale e sono stati approvati dal Consiglio svedese per l&#39;Agricoltura e l&#39;animale comitato di ricerca etica.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo supplementare per lo screening dei campioni fecali o simili per la presenza di AIV. E &#39;stato appositamente studiato per rendere la raccolta del campione rapido e facile. Questo rende possibile per le persone meno allenati, come cacciatori o gestori della fauna selvatica, per contribuire alla sorveglianza AI. Nessuna catena fresco devono essere applicate, anche se il congelamento dei campioni è consigliabile, ove possibile. Pochi giorni di temperatura ambiente, per esempio durante il trasporto al laboratorio, non erano un problema per le molecole di RNA su schede FTA, fino a quando le carte sono rimasti a secco. Altri non raffreddato sistemi di storage che sono attualmente valutati dalla comunità di ricerca, come l&#39;alcool 15 o guanidina 16, richiedono particolari modalità di spedizione a causa della loro natura pericolosa. Al contrario, il metodo della carta FTA non richiede spedizione di materiali pericolosi. Tuttavia, un altro supporto di memorizzazione interessante a questo riguardo è RNAlater ™ che non è pericoloso, sia 17. Analisi dei campioni può essere effettuata in qualsiasi standard di laboratorio molecolare. Nessuna attrezzatura speciale diverso dal solito per reazioni di PCR e il sequenziamento capillare era necessario. Tutte le fasi potrebbe essere effettuata senza un livello di biosicurezza perché già al momento della raccolta dei campioni di agenti patogeni potenziali sono stati inattivati ​​dalla attività antibatterica e antivirale della carta FTA. Contaminazione incrociata e successive campioni falsi positivi non sono stati osservati nelle nostre prove con campioni di uccelli selvatici. Tuttavia, quando si lavora con l&#39;RNA e PCR è sempre consigliabile prestare particolare attenzione per la pulizia dei luoghi di lavoro e stanze separate per le fasi pre-e post-PCR. Lavorare in una cappa aspirante diminuisce il rischio di contaminazione da aerosol in laboratorio. Pipettaggio deve essere effettuata con puntali con filtro. Da uno studio precedente su campioni prelevati simultaneamente dal anatre stessa sappiamo che sei dei 84 campioni sono risultati positivi con il tradizionale RealTime RT-PCR 24 e i valori di Ct da RealTime RT-PCR sono noti. I due campioni positivi rilevati dal nostro staminali metodo di anatre che erano i valori Ct &lt;30 (che indica una alta concentrazione di RNA virale). Gli altri quattro campioni sono risultati positivi con il protocollo tradizionale aveva valori Ct&gt; 30 (meno concentrato) e non potrebbe essere rilevato dal nostro protocollo. Campioni solo con titoli di virus relativamente alta sono risultati positivi nel nostro test ed è probabile che la sensibilità del metodo è stata la fonte di mancato riconoscimento di tutti i campioni positivi. Inoltre, la dimensione del campione in questo studio era molto bassa e il metodo può essere completamente sviluppato e valutato se gli esperimenti più controllata e rigorosa vengono effettuate. Tuttavia, se questi campioni sarebbero stati raccolti da una zona remota, l&#39;analisi tradizionali non sarebbe stato possibile a tutti. Inoltre, questi primi risultati derivano da esperimenti pilota che hanno bisogno di un&#39;ulteriore ottimizzazione. Un periodo di due anni in un deposito regolare congelatore -20 ° C dopo la raccolta del campione, probabilmente influenzato anche la qualità del RNA virale. Questa degradazione dell&#39;RNA possibile è una questione importante quando si tratta di stoccaggio a temperatura ambiente di virus inattivati. Campioni conservati nei liquidi alternativa come detto sopra soffrono di un notevole degrado che incide di più si estende l&#39;analisi del genoma virale 16. Anche se non testati nel nostro studio, le carte FTA hanno dimostrato di essere adatto a preservare intatto molecole di RNA in altri sistemi di RNA che sono molto simili ai virus dell&#39;influenza aviaria, 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o strumento </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Plastica rayon tampone a secco </td><td> Copan, Italia </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA card </td><td> Whatman </td><td></td><td> diverse opzioni </td></tr><tr><td> Harris micro perforazione 2mm con tappetino </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi libero 96well piatto </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Kim precisione salviette </td><td> KIMTECH </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA estrazione rapida soluzione </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 kit di isolamento virale </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step accesso RT-PCR sistema </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Agarosio MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> multiuso agarosio </td></tr><tr><td> Di caricamento del buffer 5x </td><td> BioRad </td><td></td><td> consegnato con scaletta del DNA </td></tr><tr><td> EZ carico di 100 bp ladder </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Etidio bromuro 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Provette 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel DNA recupero kit </td><td> Zymo ricerca </td><td> D4001 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> ABI grande colorante 3,1 chimica </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> o assimilabili </td></tr></tbody></table>

sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con fta carte: metodi per i campi, biosicurezza, e problemi di trasporto risolto

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

I virus dell&#39;influenza aviaria (AIVs) infettare molti mammiferi, compresi gli esseri umani 1. Queste AIVs sono diversi nei loro ospiti naturali, l&#39;ospitare quasi tutti i possibili sottotipi virali 2. Pandemie influenzali umani di origine derivano da AIVs 3. Molti casi mortali umani durante la focolai di H5N1 negli ultimi anni sono stati segnalati. Ultimamente, un nuovo ceppo AIV relativi attraversò la popolazione umana, causando 4 il &#39;epidemia di influenza suina&#39;. Anche se di trading e dell&#39;attività umana trasporto sembra essere responsabile della diffusione di ceppi altamente patogeni 5, la dispersione può anche essere in parte attribuito a uccelli selvatici 6, 7. Tuttavia, la riserva reale di tutti i ceppi AIV è uccelli selvatici. In reazione a questo e di fronte alle gravi perdite commerciali nel settore del pollame, i programmi di sorveglianza di grandi dimensioni sono stati implementati a livello globale per raccogliere informazioni sull&#39;ecologia di AIVs, e di installare sistemi di allarme rapido per rilevare alcuni ceppi altamente patogeni 8-12. I metodi tradizionali di virus virologica richiedono di essere integro e coltivato prima dell&#39;analisi. Ciò richiede rigorosa catena del freddo con congelatori e pesanti le procedure di biosicurezza essere a posto durante il trasporto. A lungo termine di sorveglianza è quindi di solito limitata ad una delle stazioni di campo di alcuni stretti ai laboratori ben attrezzati. Aree remote non possono essere oggetto di campionamento a meno che le procedure logisticamente complicato l&#39;attuazione. Questi problemi sono stati riconosciuti 13, 14 e l&#39;utilizzo dello stoccaggio e strategie alternative di trasporto indagato (alcoli o guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 ha introdotto un metodo per raccogliere, immagazzinare e trasportare campioni di AIV, basato su una carta speciale filtro. FTA 19 carte preservare l&#39;RNA su una base di stoccaggio a secco 20 e rendere inattivi gli agenti patogeni a contatto 21. Questo studio ha dimostrato che le carte FTA può essere utilizzato per rilevare AIV RNA in PCR di trascrizione inversa e che il cDNA risultante potrebbe essere sequenziato i geni del virus e determinato. Nello studio di Kraus et al. 18 un laboratorio isolato di AIV è stato utilizzato, ei campioni sono stati trattati singolarmente. Nella estensione qui presentata, campioni di feci di volatili selvatici dalla trappola d&#39;anatra al Uccello Ottenby Observatory (SE Svezia) sono stati testati direttamente per illustrare l&#39;utilità dei metodi in condizioni reali. Cattura di anatre e raccolta dei campioni da tamponi cloacali è dimostrata. Il protocollo attuale prevede up-scaling del flusso di lavoro dalla gestione singolo tubo di un design a 96 pozzetti. Anche se meno sensibili rispetto ai metodi tradizionali, il metodo di FTA carte offre un ottimo complemento ai sistemi di sorveglianza di grandi dimensioni. Esso consente la raccolta e l&#39;analisi di campioni provenienti da ogni parte del mondo, senza la necessità di mantenimento di una catena fredda o norme di sicurezza rispetto alla spedizione di reagenti pericolosi, come l&#39;alcool o guanidina.

Un metodo per preservare, rilevare e sequenza di RNA da virus dell&#39;influenza aviaria è stato convalidato ed esteso usando naturale campioni di feci di uccelli. Questa tecnica elimina la necessità di mantenere una catena del freddo e la manipolazione di virus infettivo e può essere applicato in un 96-e high-throughput di setup.

Sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto

I virus dell'influenza aviaria (AIV) infettano molti mammiferi, inclusi gli esseri umani1. Questi AIV sono diversificati nei loro ospiti naturali e ospitano quasi tutte le possibili combinazioni virali...

Le pandemie umane di influenza, inclusa l'epidemia recente di influenza suina, hanno origine dal virus dell'influenza aviaria, A IV, che è una specie del virus dell'influenza A. Sono stati implementati ampi programmi di sorveglianza per raccogliere informazioni sull'ecologia di A IV e per rilevare ceppi altamente patogeni. In questo video viene presentato un metodo per isolare e identificare campioni di A IV provenienti da uccelli selvatici.Prima di tutto, i germani vengono catturati. Il loro materiale fecale viene raccolto e applicato su una carta FTA, che preserva l'RNA virale per la conservazione a secco. Vengono prelevati campioni dalle carte FTA ed estratto il materiale fecale. L'RNA viene estratto e vengono utilizzate perle magnetiche per purificarlo.Viene eseguita la PCR con trascrittasi inversa per generare il DNAc, che viene quindi sottoposto a sequenziamento. Le sequenze ottenute vengono poi confrontate con sequenze note di a IV per identificare il tipo di a IV presente nei campioni. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la propagazione di virus infettivi, è che non è necessario mantenere colture rigorose e che è possibile campionare facilmente aree remote.Inoltre, le normative di biosicurezza con schede FDA sono più facili da attuare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ecologia delle malattie, ad esempio quali ceppi di influenza siano presenti. Sebbene questo metodo possa fornire spunti utili per lo studio dell'influenza aviaria.Il metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come diverse malattie selvatiche causate da virus e altri microrganismi. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché catturare e campionare anatre vive o altri uccelli richiede pratica, e il lavoro in laboratorio con l'RNA è complesso. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando siamo riusciti a campionare e isolare con successo il DNA comune da feci animali conservate su ciò che Watman FDA guards Trap attira anatre impennate o altri uccelli in una gabbia, utilizzando anatre lu o cibo come esca.Qui vengono cattati anatroccoli del genere onus. Posizionare le trappole per anatre in scatole di cartone individuali. Togliere l'anatroccolo dalla scatola tenendo le ali strette al corpo.Nella maggior parte dei casi, saranno presenti feci fresche sotto forma di gocce sul fondo della scatola. Utilizzando ogni volta un nuovo tampone sterile, raccogliere le feci e applicarle su una carta Watman FTA fino a quando la superficie bersaglio della carta non risulti completamente inzuppata. Se le feci non sono presenti sul fondo della scatola, eseguire un tampone cloacale.Accendendo innanzitutto l'anatra, posizionandola con il dorso rivolto verso l'alto per permettere l'accesso alla cloaca. La cloaca è una struttura sporgente situata al di sotto dell'addome, vicino alla base della coda. Una persona esperta può tenere l'uccello e prelevare il campione contemporaneamente, se necessario.Una seconda persona può assistere nel prelevare il campione mentre la prima persona tiene l'uccello. Inserire con attenzione un tampone sterile in plastica con punta in rayon di circa un centimetro ed eseguire una delicata movimento a S nella cloaca. Rimuovere il tampone, quindi rotolarlo sulla superficie di una scheda FTA Watman.Asciugare le schede FTA a temperatura ambiente per almeno un'ora. Posizionare ogni campione in una busta di carta. Successivamente, conservare le buste a temperatura ambiente per una conservazione a breve termine oppure congelarle per periodi più lunghi.Le schede FTA possono essere inviate per posta ordinaria poiché i patogeni diventano inattivi. A contatto con la superficie della scheda FDA, operare sotto cappa chimica. Iniziare la procedura di isolamento dell'RNA virale estraendo il materiale della scheda FDA, comprese le feci, utilizzando un puncher Harris da due millimetri, prelevare tre dischetti e posizionarli tutti in una pozzetta di una piastra RNAs free da 96 pozzette, inserendo un nuovo campione tra ciascuno.Pulire accuratamente il puncher con alcol e un panno Kim precisione. Per generare un controllo positivo. Applicare un ceppo di laboratorio su una scheda FTA come controllo negativo.Ritagliare dischetti da una scheda FTA vuota. Posizionarli nella piastra come in precedenza, assicurandosi di lasciare un altro pozzetto libero per un controllo della PCR. Successivamente nell'esperimento, aggiungere 70 microlitri di soluzione rapida di estrazione dell'RNA nel pozzetto.Quindi, utilizzare un termosaldatore per sigillare la piastra, posizionare la piastra su un agitatore e impostare la velocità, assicurandosi che non provochi fuoriuscite. Incubare la piastra in agitazione a temperatura ambiente per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare il kit Ambience Mag Max 96 per isolare l'RNA virale aggiungendo 130 microlitri di soluzione di lisi/legame preparata, fornita nel kit, in ciascun pozzetto della piastra vuota inclusa nel kit.Quindi trasferire 50 microlitri di materiale estratto dalla scheda FDA in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra sullo shaker per un minuto. Successivamente, aggiungere 20 microlitri della miscela di perline preparata dal kit a ciascun campione e mescolare aspirando e dispensando su e giù; agitare per cinque minuti.Durante questa incubazione, le molecole di RNA si legano alle perle magnetiche. Successivamente, trasferire la piastra su un supporto magnetico da 96 pozzetti per catturare le perle quando la soluzione sarà diventata completamente limpida.Utilizzare una pipetta per rimuovere e scartare il soprannatante. Successivamente, rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Lavare le perle aggiungendo 150 microlitri di soluzione di lavaggio preparata a ciascun campione, agitare per un minuto, quindi trattenere le perle sul supporto magnetico.Quando la soluzione è completamente limpida, rimuovere e scartare il soprannatante. Ripetere questo lavaggio una volta. Eseguire quindi due lavaggi utilizzando la soluzione due.Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta per rimuovere la maggior quantità possibile di soluzione e posizionare la piastra asciutta sullo shaker per due minuti a temperatura ambiente per far asciugare le perle all'aria. Una volta che le perle sono asciutte, aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione fornito nel kit e agitare per quattro minuti per rilasciare l'RNA dalle perle. Catturare le perle come in precedenza.Il surnatante contiene ora l'RNA isolato, che è pronto per applicazioni successive per la generazione e l'amplificazione del cDNA dei geni virali. Eseguire la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa utilizzando il sistema one step access R-T-P-C-R in reazioni da 25 microlitri come descritto nel protocollo scritto allegato.Una volta completata la PCR, i campioni possono essere analizzati per la positività al virus IV e purificati. Per determinare se i campioni sono positivi al virus IV, caricare due microlitri del prodotto di PCR su un gel all'1% di agarosio colorato con bromuro di etidio all'1% e far migrare per un'ora a 120 volt. Visualizzare mediante un sistema di documentazione elettroforetica, quindi identificare i campioni con frammenti amplificati nell'intervallo di dimensioni previsto.Qui il frammento bersaglio è di 244 paia di basi. Cercare quindi campioni con bande comprese tra 200 e 300 paia di basi, ad esempio quelli cerchiati in rosso. Successivamente, caricare il resto della reazione PCR.Circa 23 microlitri dei campioni su un gel di agarosio al 2% colorato con bromuro di etidio vengono fatti migrare per due ore. Posizionare il gel su un transilluminatore UV. Quindi, utilizzando un bisturi, escindere le bande della dimensione corretta e inserirle in singole provette da reazione da 1,5 millilitro usando un kit di recupero del DNA.Purificare il DNA dai frammenti di gel per il sequenziamento e l'identificazione. Eseguire il sequenziamento Sanger dei frammenti bersaglio qui. Il primer diretto M 52 C viene utilizzato per sequenziare il gene della matrice A IV.Una volta ottenuti i risultati del sequenziamento, confrontare le sequenze di cDNA con database di nucleotidi come GenBank, utilizzando strumenti locali o basati sul web come blast presso il National Center for Biotechnology Information; le sequenze dei frammenti genici possono essere confrontate con voci esistenti. In questo modo, il ceppo specifico di A IV può essere caratterizzato ed è possibile ottenere informazioni preziose sulle caratteristiche della sequenza.84 germani reali sono stati campionati presso l'Autumn B Bird Observatory nel dicembre 2007; da ciascun germano reale è stato prelevato un campione su una carta FTA come descritto in questo protocollo. Dopo la spedizione, le carte FTA sono state conservate in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per due anni. Qui viene mostrata un'immagine su gel dei prodotti della PCR ottenuti da questi 84 campioni provenienti da campioni naturali.Una moltitudine di bande non specifiche può essere osservata a causa della presenza di diverse contaminazioni microbiche nelle feci. Il frammento bersaglio della coppia di primer utilizzata in questo caso è di 244 paia di basi. Le bande lunghe di dimensione prevista sono cerchiate in rosso.I cerchi blu indicano un amplicone aspecifico o un artifatto di primer dimer di dimensioni inferiori a 100 paia di basi. I campioni indicati dalle frecce rosse sono stati isolati e sequenziati. La freccia verde indica il controllo positivo.I campioni selezionati sono stati confermati come positivi per il virus dell'influenza di tipo IV confrontando le loro sequenze di cDNA con il database nucleotidico del NCBI. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in due ore, dalla scheda FDA caricata al modello di RNA purificato, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione all'igiene delle superfici di lavoro, all'uso dei guanti, alla separazione degli ambienti di lavoro pre e post PCR, all'impiego di punte con filtro e al lavorare sotto cappa di sicurezza seguendo questa procedura.Altre applicazioni successive, come il clonaggio di frammenti in vettori, possono essere utilizzate per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se vi siano ceppi multipli di influenza che infettano un singolo ospite dopo il loro sviluppo. Questa procedura potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo dell'ecologia delle malattie per esplorare le infezioni da IA in aree remote dove il campionamento dell'IA non era fattibile in precedenza. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come campionare l'influenza aviaria dalla cloaca, isolare e purificare molecole di RNA da schede FTA e determinare se e da quale ceppo virale gli ospiti siano infettati.Non dimenticare che lavorare con uccelli selvatici comporta il rischio di manipolare individui infetti da influenza aviaria o altre malattie zoonotiche. Per questo motivo, è molto importante indossare sempre indumenti protettivi durante l'esecuzione di questa procedura.

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