Name: Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Scopri l'ablazione laser mirata delle cellule del pronephros in embrioni di zebrafish per studiare la rigenerazione epiteliale renale dopo danno acuto. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale dei processi rigenerativi.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Wingert per utili discussioni di AKI biologia e tecniche di zebrafish, e C. Diep per condividere la sua ricetta metilcellulosa. Gli autori desiderano esprimere la nostra gratitudine ai membri del personale di Notre Dame Centro per la Ricerca Zebrafish per fornire un&#39;eccellente assistenza continua di allevamento per la nostra colonia zebrafish. Finanziamenti del NIH-NIDDK DK083512 di assegnazione del contributo, e di laboratorio generoso finanziamento di start-up presso l&#39;Università di Notre Dame, sostenuto questo lavoro.

1. Procedura di microiniezione per etichettare il pesce zebra pronephros epitelio tubulo prossimale Per questa procedura, si usa un sistema di microiniezione (Appartus Harvard, PLI90), con l'aria compressa fornita da un compressore d'aria (Jun-Air, Modello 6-4), e apparecchi micromanipolatore (Narishege parti MN151, IP3, e GJI) che sono assemblato in una stazione stereomicroscopio (Nikon, SMZ-Zoom 645) le istruzioni per fabbricante. Coniugati destrano sono prontamente endocitato dal nefrone tubulo prossimale, consentendo l'etichettatura preferenziali di questa popolazione di cellule epiteliali 9. <ol><li> L'esposizione al blu di metilene può accentuare l'autofluorescenza del sacco vitellino e rende la visualizzazione del nefrone tubuli più difficile. </li><li> Sollevare il embrioni fecondati a 28,5 ° C ad un timepoint sviluppo tra 48-55 ore dopo la fecondazione (HPF). Questo è il palcoscenico ideale per eseguire microiniezioni larve a causa della facilità con cui microiniezione intramuscolare può essere eseguita, e perché la funzione renale ha inizio in questo momento. </li><li> Rimuovere il corion da qualsiasi zebrafish unhatched usando un paio di pinze fine. Sciacquare i detriti corion dalla capsula di Petri e riempire il piatto con 30 ml di soluzione modificato E3. </li><li> Preparare un vassoio di iniezione per gli embrioni. I nostri stampi ad iniezione preferito è fatta di 1,5% agarose/E3, in cui si formano depressioni triangolare in modo che l'embrione può essere posizionato all'interno per l'iniezione. Per fare lo stampo di iniezione, si galleggiare uno stampo di plastica con protuberanze a forma di cuneo (descritto in dettaglio in precedenza 11) in una piastra di Petri riempita con una base di 1,5% di agarosio. </li><li> Preparare aghi microiniezione vetro tirando tubi capillari con un estrattore ago, come descritto nel libro Zebrafish 10. In breve, tirare i tubi di vetro capillari quindi utilizzare pinze di metallo sottile per tagliare la punta dell'ago microiniezione di fare una punta con una punta mentre si visualizza la punta dell'ago sotto uno stereomicroscopio. Conservare gli aghi taglio coperto da una capsula di Petri e posizionato su plastilina per proteggere il bordo di taglio e di prevenire l'accumulo di polvere. </li><li> Preparare la soluzione di iniezione per etichettare il tubulo prossimale. Sciogliere 40 kD destrano-fluoresceina coniugato (Invitrogen, D1845) ad una concentrazione di 1 mg / ml in acqua distillata. </li><li> Per anestetizzare il pesce, aggiungere 5 ml di 0,2% Tricaine pH 7,0 alla capsula di Petri contenente le larve pesce zebra in 30 ml di E3. I pesci sono anestetizzati, quando non hanno più mostra la risposta al tocco. E 'fondamentale che i pesci siano completamente anestetizzati o saranno contrazione durante il tentativo di iniettare loro. </li><li> Trasferire il pesce anestetizzato per un vassoio di stampo ad iniezione utilizzando una pipetta di plastica di trasferimento. Posizionare l'animale con la testa nella parte più profonda della depressione triangolare bene, e su un fianco in modo che il tronco è a riposo lungo il lato inclinato del pozzo. </li><li> Eseguire microiniezione intramuscolare. Caricare un ago tagliato con 2-3 ml di destrano fluoresceina, e iniettare l'animale in un somite tronco con circa 1 nL di soluzione. Obiettivo per la parte superiore del somite, e di evitare l'estensione del sacco vitellino. Ciò assicura che i tubuli nefrone non sono meccanicamente interrotta dal processo di microiniezione. </li><li> Trasferimento zebrafish iniettato per un piatto pulito Petri e aggiungere modificato soluzione E3. Lavare gli animali 3 volte con E3 dolce per rimuovere ogni traccia di Tricaine. Coprire il coperchio della capsula di Petri con un foglio di alluminio per fornire luce protezione per il destrano, e tornare gli animali per i 28 ° C durante la notte incubatore. </li></ol> 2. Laser ablazione mirata di cellule del tubulo prossimale Per questa procedura, si usa uno stereomicroscopio con epifluorescenza a segno animali con destrano fluoresceina vivaci marcato tubuli prossimali e selezionare questi per ablazione laser. Quindi, usiamo un sistema laser pulsato Micropoint (Strumenti fotonici, Inc) che è stato collegato a un microscopio composto (Nikon Eclipse 80i con attacco epifluorescente), e calibrata per l'uso come istruzioni del produttore, per eseguire l'ablazione delle cellule nefrone. Abbiamo avuto più successo di ablazione delle cellule utilizzando un filtro FITC che consente al ricercatore di visualizzare le regioni tubulo fluorescenti in campo chiaro illuminazione. In anticipo di questa procedura, preparare i media immobilizzazione per l'ablazione, sciogliendo 1,5% di metilcellulosa a 0,02% tricaine/E3. Aliquote negozio di metilcellulosa per l'uso immediato a temperatura ambiente, oppure a 4 ° C per la conservazione a lungo termine. <ol><li> Anestetizzare il pesce zebra 72 HPF aggiungendo 5 ml di 0,2% pH 7,0 Tricaine alla capsula di Petri contenente le larve pesce zebra in 30 ml di E3. I pesci sono anestetizzati, quando non hanno più mostra la risposta al tocco. E 'fondamentale che i pesci siano completamente anestetizzati o saranno contrazione durante il tentativo di eseguire l'ablazione laser. </li> Procede all'esame degli animali iniettato sotto l'impostazione appropriata fluorescenti e selezionare gli animali in cui è possibile visualizzare facilmente i tubuli prossimali. <li> Trasferimento degli embrioni selezionati per un piatto separato contenente tricaine. Gli animali possono essere anestetizzati fino a 30 minuti prima di eseguire l'ablazione delle cellule. Se il vostro punteggio&gt; 15 animali, di ritorno a queste un piatto separato contenente fresca E3 modificati in attesa ablazione in quanto ogni cella di ablazione richiede diversi minuti. </li><li> Per eseguire l'ablazione, il trasferimento di uno zebrafish anestetizzati ad una piccola scatola di Petri contenente 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine per 2 minuti per lavare l'embrione nei media immobilizzazione. </li><li> Poi, il trasferimento dell'embrione a una diapositiva depressione di vetro contenente un calo del 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine. Delicatamente la posizione dell'animale con una sonda sottile in modo che il suo lato ventrale si affaccia sul vetrino e lato dorsale è rivolto verso l'alto. </li><li> Mettere il vetrino sul microscopio compund palco, e concentrarsi sul lato dorsale dell'animale. Eseguire l'ablazione delle cellule nefrone sotto fuoco premendo il pedale. Vedrete la dispersione della fluorescenza come le cellule epiteliali renali sono ablazione (figura 1A). </li><li> Delicatamente trasferire l'animale ablato di un pozzo in un 12 ben piatto per la coltura successiva. Sciacquare la E3 2-3 volte per lavare via la metilcellulosa. </li><li> Dopo l'iniezione, aumentare l'animale al timepoint desiderato ed eseguire l'analisi desiderata come stabilito per le tecniche istologiche e molecolari per gli embrioni di pesce zebra giovani (Figura 2). </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: I dati che sono riportati nella Figura 1 indicano il periodo di tempo ablazione. Dopo l'iniezione intramuscolare con destrano-coniugati, il tubulo prossimale è preferenzialmente etichettati. L'iniezione di destrano-FITC è stato usato per etichettare il rene per l'ablazione laser, e gli animali sono stati ablato reiniettate con destrano-rodamina in una sola ablazione aggiuntivi timepoint seguenti re-imaging della popolazione tubulo prossimale. Tecniche di analisi di espressione come ibridazione in situ può essere usata per analizzare i cambiamenti nei campioni fissati a timepoints singolo dopo ablazione delle cellule, come mostrato nella Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: procedura di ablazione laser è seguita da una rapida rigenerazione dell'epitelio del tubulo (AC) Timecourse di cambiamenti cellulari durante e dopo ablazione laser di tubuli larva zebrafish prossimali al momento della ablazione (giorno 3, pannello A), o uno o tre. giorni dopo l'ablazione (giorno 4, pannello B; giorno 7, pannello C). (Top) schemi mostrano la posizione del nefrone, con destrano-FITC (verde) e destrano-rodamina (rosso), e (in basso) immagini dal vivo di controllo e di laser-ablazione (LA) nefroni. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Analisi di espressione genica dopo ablazione laser Dopo ablazione laser al giorno 3, gli embrioni sono stati fissati e trattati da montare tutto ibridazione in situ per rilevare trascrizioni per slc20a1a, che segnano il segmento contorto tubulo prossimale del nefrone. (A) Un embrione di controllo che non è stato sottoposto ad ablazione laser, (B) un embrione in cui è stato asportato un ampio tratto di epitelio dei tubuli, e (C) un embrione in cui un breve intervallo di epitelio dei tubuli è stato ablato. Linea nera indica l'entità del tubulo prossimale in A per fornire riferimento, le linee blu indicano il grado di ablazione laser in pannelli aC, e * indica il controllo (non ablato) nefrone controlaterale in pannelli aC.

<ol><li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li>
<li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li>
<li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li>
<li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+pronephros%3A+a+model+to+study+nephron+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li>
<li>Cosentino, C. ianciolo, Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li>
<li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li>
<li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li>
<li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Stem+Cell+Res.+Therapy%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li>
<li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li>
<li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity%3A+an+integrative+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Kid.+Int%22%5BJournal%5D)">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il pesce zebra è un organismo modello molto utilizzato in tutto molti aspetti della scienza, le applicazioni di cui sono in crescita 6. L&#39;impiego del sistema modello Danio rerio nello studio delle malattie renali, come AKI ha portato ad importanti osservazioni e continuerà ad essere un buon modello per studiare danno renale 7,8. Con un genoma che è stato sequenziato e molti protocolli molecolari in atto, è diventato sempre più facile da eseguire ricerche sofisticate zebrafish che utilizza modelli transgenici, knockdown genica e studi misexpression. Il pesce zebra ha un ciclo di vita breve con dimensioni di generazione di grandi dimensioni e fasi di sviluppo ben definito. Inoltre, il pesce zebra fasi embrionale e larvale sono in gran parte trasparente, rendendo gli studi di imaging possibile senza dissezione dell&#39;organismo. In tutto le fasi embrionale e larvale, il pesce zebra ha un rene pronephric composto da due nefroni, che rimangono visibili nel corso di questi punti temporali di sviluppo. Zebrafish nefroni pronephric sono analoghe per struttura e funzione ai loro omologhi nei mammiferi, il che rende un buon modello per studi di insufficienza renale acuta 4,5. Il rene è cruciale per la sopravvivenza degli esseri umani e altri vertebrati, che funge da organo che purifica il corpo di scorie metaboliche liquido. Questa funzione di pulizia si basa sulla capacità dei nefroni rene di filtrare il sangue, e quindi modificare il filtrato per raccogliere i rifiuti azotati per la secrezione e contemporaneamente mantenere il bilancio idro-elettrolitico. Nefroni sono costituiti da un filtro del sangue, tubulo epiteliale, e in un condotto di scarico. L&#39;integrità strutturale e funzionale di tutte le tre parti è parte integrante della funzione nefrone. Insulti vari al rene, compresa l&#39;esposizione a nefrotossine, ischemia, o di ostruzione delle vie del flusso urinario può provocare AKI 1. La patologia di AKI è spesso associata a necrosi tubulare acuta 1,2. Gli studi clinici hanno dimostrato che la conseguente insufficienza renale ha un tasso di mortalità che può variare 7-80% a seconda della causa e il contesto del insufficienza renale. Tuttavia, una diagnosi rapida e l&#39;inversione della causa sottostante di AKI è sempre più associato con il recupero attraverso la rigenerazione dei tubuli nefrone necrotico. Recenti studi di mappatura destino hanno dimostrato che la popolazione di cellule principali che ripopola tubuli nefrone danneggiate sono cellule epiteliali che hanno origine da adiacenti, aree illeso 12. Questi risultati non hanno eliminato la possibilità che renale cellule staminali / progenitrici possono partecipare al processo, e le relazioni indipendenti hanno suggerito che le cellule del midollo osseo derivate possono contribuire alla rigenerazione renale 13. E &#39;chiaro che le indagini costante per risolvere meglio le fonti di cellulare renale rigenerazione epiteliale. Sia la rigenerazione e lo sviluppo nefrone condividere il fenomeno degli switch allo stato cellulare tra fenotipi mesenchimali ed epiteliali. Durante lo sviluppo nefrone, le cellule progenitrici mesenchimali si differenziano in un fenotipo stazionaria, allegando una membrana basale a formare l&#39;epitelio tubolare 3. Il fenomeno migratorio ipotizzato di cellule epiteliali seguenti insufficienza renale acuta necessita di una de-differenziazione in un fenotipo mesenchimale. È interessante notare che studi recenti suggeriscono che le cellule mesenchimali nel rene danneggiato esibiscono un profilo di espressione simile a una cellula mesenchimale durante lo sviluppo 14. Diversi rapporti hanno rilevato cambiamenti nelle molecole di adesione cellulare, proteine ​​della matrice, citochine e chemochine. Dopo la mesenchimali proposto di transizione epiteliali, le cellule rimontare su una membrana basale e riavviare tubolare attività epiteliali. Determinare i geni importanti in questo processo continua ad essere un argomento di ricerca del nostro laboratorio e altri. Gran parte del lavoro per chiarire i fattori chiave in questo processo resta ancora da fare, ma i progressi significativi nel campo è stato annunciato dallo studio degli effetti di gentamicina. AKI e insufficienza renale causata da gentamicina è rilevante considerando la prevalenza dei composti nefrotossici utilizzato in medicina 15. Usato come trattamento per le infezioni batteriche gram-negativi, la somministrazione di aminoglicosidi produce la lesione acuta nel 10-25% dei casi. Il farmaco provoca una pletora di effetti negativi cellulare, insieme con conseguente apoptosi o necrosi in molte cellule tubulari. Gli studi hanno trovato il farmaco di legarsi preferenzialmente ad un complesso formato da megalin cubulin e che è coinvolto in endocitosi. Queste molecole si trovano in abbondanza nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale, anche se non si limitano a espressione in queste cellule. Attraverso la segnalazione cellulare con conseguente induzione di stress ossidativo, il rilascio di vasocostrittori, esaurimento di cellulare di ATP, l&#39;ipossia, l&#39;inibizione della fosfolipasi, antibiotici gentamicina e simili causanoapoptosi e necrosi in cellule epiteliali. Inoltre, gli antibiotici innescare contrazione mesangiale nel sangue nefrone filtro (glomerulo), con un conseguente calo della velocità di filtrazione glomerulare e negativamente alterare la capacità del rene di filtrare il sangue. La produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno, molecole immunostimolante, e l&#39;attivazione di fosfolipasi hanno effetti diffusi nel nefrone, creando un catastrofico patologia che porta a insufficienza renale acuta. Mentre gli studi di antibiotici gentamicina e simili sono stati e continueranno ad essere strumenti importanti per la ricerca rigenerazione del rene, non hanno una precisione che può essere utile per affrontare alcune questioni. Il nostro sistema di utilizzare il pesce zebra in combinazione con un metodo di ablazione laser descritto in questo protocollo risponde alla necessità di un tale strumento di ricerca precisa. Ablazione laser permette ai ricercatori di indurre la distruzione delle cellule in zone focali del tubulo renale, che vanno da un piccolo (2-3) di grandi dimensioni (&gt; 50-100) le popolazioni, con una precisione senza eguali. In questo protocollo, utilizziamo un metodo sviluppato in precedenza di esposizione al destrano-coniugati per etichettare preferenzialmente popolazioni epiteliali del tubulo prossimale. In alternativa, le linee transgeniche zebrafish che esprimono la proteina fluorescente verde in una o più regioni del tubulo potrebbero essere utilizzati. Per esempio, cadherin17: eGFP zebrafish transgenico presentano fluorescenza forte nelle regioni tubulo distale (ma debole nelle popolazioni prossimale), e potrebbe essere prezioso per gli studi di rigenerazione in altri segmenti del tubulo 16. La visibilità del nefrone consentirà time-lapse registrazione video di cambiamenti cellulari nel corso del tempo. Quando accoppiato con studi di espressione genica come montare tutto ibridazione in situ o immunoistochimica, i ricercatori in grado di rilevare alterazioni molecolari nel nefrone nel tempo. Nel loro insieme, tali strategie può cominciare a formulare una comprensione più dinamica degli eventi che traspaiono quando cellule epiteliali renali vengono distrutti. L&#39;avvertenza importante del nostro modello di ablazione laser è che si può ricapitolare aspetti parziali delle condizioni fisiologiche che traspaiono nel umana AKI. La morte cellulare indotta attraverso istantanee danno fisico è diversa da quella cascata di eventi che porta alla necrosi delle cellule, e come tale i fattori umorali in questi microambienti diversi non può essere identico. Inoltre, esiste evidenza di apoptosi indotta durante il danno renale, e non è noto se tali conseguenze trasparire insulto seguente con un laser. Tuttavia, proprio come la coltura cellulare è uno strumento che meglio risponde ad alcune domande che necessitano di un ambiente altamente controllato, ablazione laser, servirà come altamente controllato modello in vivo di AKI. Come tale, la intuizioni ottenuto da studi ablazione dell&#39;epitelio renale in zebrafish probabilmente promuovere scoperta di intuizioni fondamentali che possono essere applicati alle indagini delle altre lesioni renali e potenzialmente usato per creare una migliore diagnostica negli esseri umani.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Embrione piatti </td><td> Falco </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Dissezione forcipe </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Aghi per iniezione </td><td> Sutter STRUMENTI </td><td> BF100-50-10 </td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (KD) destrano-fluoresceina </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Trasferimento pipetta di plastica </td><td> Samco scientifico, Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Metilcellulosa </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Depressione scivolo </td><td> Pescatore </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12-ben piatto </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

ablazione laser del pronephros zebrafish allo studio renale rigenerazione epiteliale

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Danno renale acuto (AKI) è caratterizzata da elevati tassi di mortalità dal deterioramento della funzione renale in un periodo di ore o giorni che culmina con insufficienza renale 1. AKI può essere causato da una serie di fattori tra cui l&#39;ischemia, farmaco a base di tossicità, o lesioni ostruttive 1. Ciò si traduce in una incapacità di mantenere l&#39;omeostasi dei fluidi e di elettroliti. Mentre AKI è stata osservata per decenni, efficaci terapie cliniche sono ancora da sviluppare. Curiosamente, alcuni pazienti con danno renale acuto recuperare funzionalità renale nel corso del tempo, un fenomeno misterioso che è stato solo rudimentale caratterizzata 1,2. La ricerca che utilizza modelli di mammiferi di AKI ha dimostrato che i reni nefrotossina ischemica o con lesioni esperienza di morte delle cellule epiteliali nel nefrone tubuli 1,2, le unità funzionali del rene che sono costituiti da una serie di regioni specializzate (segmenti) di tipi di cellule epiteliali 3 . All&#39;interno di nefroni, la morte delle cellule epiteliali è più alta in cellule del tubulo prossimale. Ci sono prove che suggeriscono la distruzione delle cellule è seguito da de-differenziazione, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali circostanti, che può rigenerare il nefrone interamente 1,2. Tuttavia, ci sono molte domande senza risposta circa i meccanismi di rigenerazione dell&#39;epitelio renale, che vanno dai segnali che modulano questi eventi per motivi di variazione gamma di capacità tra gli esseri umani per rigenerare reni feriti. Il pesce zebra larvale fornisce un modello eccellente per studiare la rigenerazione dell&#39;epitelio renale come il suo rene pronephric si compone di nefroni che si conservano con vertebrati superiori tra cui i mammiferi 4,5. Il nefroni delle larve zebrafish possono essere visualizzati con tecniche di fluorescenza a causa della relativa trasparenza del giovane zebrafish 6. Questo fornisce un&#39;opportunità unica di cella di immagine e cambiamenti molecolari in tempo reale, in contrasto con i modelli dei mammiferi in cui nefroni sono inaccessibili perché i reni sono sistemi strutturalmente complessi internalizzati nel animale. Recenti studi hanno impiegato la gentamicina aminoglicoside come agente tossico causale per lo studio di AKI e conseguente insufficienza renale: gentamicina e altri antibiotici hanno dimostrato di provocare AKI negli esseri umani, ei ricercatori hanno formulato metodi da utilizzare per attivare questo agente danni renali in zebrafish 7 , 8. Tuttavia, gli effetti di tossicità degli aminoglicosidi nelle larve di zebrafish sono catastrofiche e letale, che presenta una difficoltà quando si studia la rigenerazione epiteliale e la funzione nel tempo. Il nostro metodo presenta l&#39;utilizzo di ablazione delle cellule bersaglio, come un nuovo strumento per lo studio delle lesioni epiteliali in zebrafish. Ablazione laser offre ai ricercatori la capacità di indurre la morte delle cellule in una popolazione limitata di cellule. Aree diverse di cellule possono essere mirati in base alla posizione morfologica, la funzione, o anche espressione di un particolare fenotipo cellulare. Così, ablazione laser aumenta la specificità di quello che i ricercatori possono studiare, e può essere un approccio nuovo ed efficace per far luce sui meccanismi di rigenerazione dell&#39;epitelio renale. Questo protocollo può essere ampiamente applicata a popolazioni di cellule bersaglio in altri organi nell&#39;embrione zebrafish per studiare lesioni e di rigenerazione in un qualsiasi numero di contesti di interesse.

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle cellule renali nefrone nel rene embrione zebrafish, o pronephros. Il nostro nuovo metodo può essere utilizzato per integrare nefrotossicità indotta modelli di AKI e ottenere un&#39;immagine ad alta risoluzione comprensione delle alterazioni cellulari e molecolari che sono associati con la rigenerazione epiteliale nel nefrone renale.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

L'insufficienza renale acuta (AKI) è caratterizzata da alti tassi di mortalità a causa del deterioramento della funzione renale nell'arco di ore o giorni, che culmina in...

L'obiettivo generale di questa procedura è effettuare una marcatura mirata delle cellule renali nel rene embrionale del pesce zebra, il pronefro, al fine di studiare la rigenerazione dell'epitelio renale in seguito a un danno renale acuto. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante microiniezione di embrioni di pesce zebra con un coniugato fluorescente di destrano. Durante un'incubazione notturna, i coniugati vengono assorbiti selettivamente dalle cellule dei tubuli prossimali del nefrone.Il giorno successivo, le cellule vengono esaminate mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza e alcune cellule selezionate vengono ablato utilizzando un sistema laser a impulsi. Successivamente, i cambiamenti morfologici e molecolari vengono valutati mediante istologia, ibridazione in situ su preparati interi e immunohistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'induzione di danno renale acuto mediante l'antibiotico nefrotossico gentamicina, è che tali trattamenti provocano danni catastrofici e sono letali, impedendo così l'analisi degli eventi di rigenerazione renale nel tempo.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo renale, come l'identificazione degli eventi di segnalazione molecolare che si verificano durante la rigenerazione epiteliale. Abbiamo concepito per la prima volta questa tecnica quando abbiamo voluto sviluppare un'analisi dettagliata della rigenerazione epiteliale renale in piastre di Petri. Raccogliere embrioni di pesce zebra fecondati in soluzione E tre modificata senza blu di metilene.Coltivare gli embrioni fecondati a 28,5 gradi Celsius fino a quando non raggiungono un'età compresa tra 48 e 55 ore dalla fecondazione, momento in cui il sistema renale dell'embrione ha iniziato a funzionare. Prima di iniziare le iniezioni, preparare un albero per iniezioni aros utilizzando uno stampo con depressioni triangolari per trattenere gli embrioni. Successivamente, preparare aghi per microiniezione standard e una soluzione di iniezione per etichettare il tubulo prossimale. Iniziare l'esperimento preparando gli embrioni.Per prima cosa, rimuovere la corion dai tuorli non schiusi utilizzando pinzette fini. Quindi sciacquare i detriti corionici, i detriti dalla capsula di Petri e riempire nuovamente la capsula con 30 millilitri di soluzione E tre modificata. In secondo luogo, anestetizzare le larve con cinque millilitri di trica.Verificare che le larve siano completamente anestetizzate controllando la risposta al tocco. Se non sono completamente anestetizzate, si contrarranno durante l'iniezione. In terzo luogo, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, posizionare le larve nello stampo.Posizionare gli animali con la testa nella parte più profonda della depressione e il tronco lungo il lato del pozzetto. Procedere quindi con microiniezioni intramuscolari caricando un ago preparato con due-tre microlitri di dextrano fluorosceinico, posizionare l'ago e iniettare circa un nanolitro di soluzione in un segmento del tronco di ciascun animale. I coniugati della dextrano vengono facilmente endocitati dal tubulo prossimale del nefrone, consentendo l'etichettatura preferenziale di questa popolazione di cellule epiteliali.Puntare alla porzione superiore del somite ed evitare l'estensione del sacco vitellino, altrimenti i tubuli nefronici risulteranno danneggiati, come nell'esemplare iniettato in modo errato mostrato qui. Dopo l'iniezione, trasferire le larve in una capsula di Petri pulita e lavarle tre volte con mezzo E tre fresco per rimuovere ogni traccia di trica. Coprire quindi il coperchio con della stagnola e incubare gli animali tutta la notte a 28 gradi Celsius.Prima di iniziare questa procedura, preparare il mezzo di immobilizzazione e conservare alcune aliquote per un uso immediato a temperatura ambiente, mantenendo le aliquote rimanenti a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Iniziare anestetizzando le larve di pesce zebra con cinque millilitri di trica in 30 millilitri di E tre. Come in precedenza, accertarsi che i pesci non rispondano alla stimolazione tattile.Ora esaminare gli animali iniettati in fluorescenza per selezionare larve con tubuli prossimali facilmente visibili. Trasferire fino a 12 larve in una nuova piastra contenente la stessa concentrazione di trica su un microscopio fluorescente dotato di filtro fitzy, illuminazione in campo chiaro e un laser perform. L'ablazione inizia trasferendo e anestetizzando le larve in una piastra contenente mezzo di immobilizzazione.Attendere due minuti, quindi trasferire la larva su un vetrino con cavità contenente una goccia di mezzo di immobilizzazione. Posizionare delicatamente l'animale con il lato dorsale verso l'alto utilizzando una sonda fine e mettere a fuoco il lato dorsale. A questo punto, utilizzando un sistema laser micro-puntiforme pulsato calibrato, ablare uno dei nefroni lasciando l'altro intatto come controllo.Si osserverà la dispersione della fluorescenza quando le cellule epiteliali renali vengono ablata. Quindi trasferire delicatamente l'animale in una pozzetta di una piastra a 12 pozzette e risciacquarlo tre volte in mezzo E three per rimuovere la metilcellulosa. Continuare ad ablare i nefroni finché la prima piastra a 12 pozzette non sarà piena.Quindi anestetizzare altri 12 animali e ripetere il processo. &egrave; stato iniettato Dextra Fitzy per etichettare in modo preferenziale il tubulo contorto prossimale. A tre giorni dalla fecondazione, il nefrone di ciascun animale &egrave; stato ablato con il laser.Un giorno dopo l'ablazione. La rigenerazione non è evidente quattro giorni dopo l'ablazione, tuttavia la rigenerazione è avvenuta dopo l'ablazione cellulare *in situ* due. È stata utilizzata l'ibridazione per analizzare i cambiamenti in campioni fissati in singoli punti temporali.Questo embrione non è stato sottoposto ad ablazione. Al contrario, in questo embrione è stata ablata una lunga porzione dell'epitelio tubulare, mentre in quest'altro è stata ablata una breve porzione dell'epitelio tubulare. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'ibridazione in situ su preparati interi, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sull'identità delle variazioni nell'espressione genica durante il processo di rigenerazione del nefrone.Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso. Si raccomandano precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale quali camice da laboratorio e guanti, durante questa procedura.

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Biologia

Descriviamo una tecnica di microinjecting l'aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

Trapianto di cellule è una tecnica fondamentale per lo studio e la rigenerazione dei tessuti per lo sviluppo di terapie basate sulle cellule della malattia. Si dimostra qui una tecnica di microchirurgia che permette il trapianto di cellule geneticamente etichettati direttamente nel rene di pesce zebrafish adulti.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

Qui presentiamo un metodo affidabile per studiare la rigenerazione renale adulta inducendo un danno renale acuto mediante iniezione di gentamicina. Dimostriamo che il danno dipende dal dosaggio di gentamicina e dalla temperatura ambientale utilizzando l'ibridazione in situ per marcare lhx1a+ sviluppando nuovi nefroni.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l'induzione dell'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Il pesce zebra è un modello importante per comprendere lo sviluppo del rene. Qui, un protocollo di ibridazione in situ è ottimizzato per rilevare l'espressione genica nelle larve di zebrafish e nei giovani durante lo sviluppo del mesonephros.

Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Questo protocollo descrive un approccio di ablazione laser a due fotoni effettuato su larve di zebrafish, che funge da modello per studiare la rigenerazione ossea e gli effetti della risposta immunitaria all'ablazione.

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Scopri l'ablazione laser mirata delle cellule del pronephros in embrioni di zebrafish per studiare la rigenerazione epiteliale renale dopo danno acuto. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale dei processi rigenerativi.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

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