Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire la celebrazione mirata delle cellule renali nel rene embrionale di zebrafish, il pro nefro, allo scopo di studiare la rigenerazione epiteliale renale dopo un danno renale acuto. Ciò si ottiene microiniettando prima embrioni di pesce zebra con un coniugato fluorescente destrano. Durante un'incubazione notturna, i coniugati vengono assorbiti selettivamente dalle cellule tubulari prossimali del nefrone.

Il giorno successivo, le cellule vengono esaminate in epifluorescenza e le cellule selezionate vengono ablate utilizzando un sistema laser pulsato. Successivamente, le modificazioni morfologiche e molecolari sono valutate utilizzando l'istologia, l'ibridazione a montaggio intero C 2 e la chimica immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il danno renale acuto che utilizza l'antibiotico nefrotossico gentamicina, è che tali trattamenti innescano danni catastrofici e sono letali, precludendo l'analisi degli eventi di rigenerazione renale nel tempo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo renale, come l'identificazione di eventi di segnalazione molecolare che si verificano durante la rigenerazione epiteliale. Abbiamo avuto l'idea di questa tecnica per la prima volta quando volevamo sviluppare un'analisi dettagliata della rigenerazione epiteliale renale nelle piastre di Petri. Raccogli embrioni fecondati di zebrafish in una soluzione modificata di E tre senza blu di metilene.

Solleva gli embrioni fecondati a 28,5 gradi Celsius fino a quando non sono tra le 48 e le 55 ore Dopo la fecondazione, quando il sistema renale dell'embrione ha iniziato a funzionare prima di iniziare le iniezioni, prepara un albero per iniezione aros utilizzando uno stampo con depressioni triangolari per contenere gli embrioni. Successivamente, preparare aghi per microiniezione standard e una soluzione per iniezione per etichettare il tubulo prossimale. Inizia l'esperimento preparando gli embrioni.

Per prima cosa, rimuovi il Corian da tutte le uova non schiuse usando una pinza fine. Quindi sciacquare i detriti di Corian, i detriti dalla capsula di Petri e riempire nuovamente la capsula con 30 millilitri di soluzione di E three modificata. In secondo luogo, anestetizzare le larve con cinque millilitri di trica.

Assicurati che le larve siano completamente anestetizzate controllando la risposta al tocco. Se non sono completamente anestetizzati, si contrarrebbero durante l'iniezione. In terzo luogo, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, mettere le larve nello stampo.

Posizionare gli animali con la testa nella parte più profonda della depressione e la proboscide lungo il lato del pozzo. Ora procedi con le micro iniezioni intramuscolari caricando un ago preparato con due o tre microlitri di destrano fluorescente in posizione l'ago e inietta circa un nanolitro di soluzione in un tronco in modo da acaro di ogni animale. I coniugati destrani sono prontamente endocitosi dal tubulo prossimale del nefrone, consentendo la marcatura preferenziale di questa popolazione di cellule epiteliali.

Mira alla parte superiore dell'acaro ed evita l'estensione del sacco vitellino, altrimenti i tubuli del nefrone finiranno per essere interrotti, come in questo animale iniettato in modo improprio. Una volta iniettate le larve, trasferirle in una capsula di Petri pulita e sciacquarle tre volte con terreno E tre fresco per rimuovere ogni traccia di trica. Ora, copri il coperchio con un foglio e incuba gli animali per una notte a 28 gradi Celsius.

Prima di iniziare questa procedura, preparare il mezzo di mobilitazione e conservarne alcune aliquote per l'uso immediato a temperatura ambiente e mantenere le aliquote rimanenti a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Inizia anestetizzando le larve di pesce zebra con cinque millilitri di trica in 30 millilitri di E tre. Proprio come prima, assicurati che i pesci non rispondano alla sensazione tattile.

Ora esamina gli animali iniettati sotto fluorescenza per selezionare le larve con tubuli prossimali facilmente visualizzabili. Trasferire fino a 12 larve in un nuovo piatto contenente la stessa concentrazione di trica in un microscopio a fluorescenza composto dotato di un filtro fitzy, illuminazione in campo chiaro e un laser perform. L'ablazione inizia trasferendo e anestetizzando la lava in una capsula contenente mezzi di immobilizzazione.

E attendi due minuti, quindi trasferisci la lava su un vetrino a depressione contenente una goccia di mezzo di immobilizzazione. Posizionare delicatamente l'animale con il lato dorsale rivolto verso l'alto con una sonda fine e concentrarsi sul lato dorsale. Ora, utilizzando un sistema laser a micro punti pulsati calibrati, è possibile ablare uno dei nefroni, lasciando intatto l'altro come controllo.

Vedrai la dispersione della fluorescenza quando le cellule epiteliali renali vengono ablate. Quindi trasferire delicatamente l'animale in un pozzetto di un piatto a 12 mondi e sciacquarlo tre volte in un mezzo E tre per lavare via la metilcellulosa. Continuare ad ablare i nefroni fino a riempire il primo piatto del mondo 12

Quindi anestetizzare altri 12 animali e ripetere il processo. Dextra Fitzy è stato iniettato per marcare preferenzialmente il tubulo prossimale. Tre giorni dopo la fecondazione e il nefrone di ogni animale è stato ablato al laser.

Un giorno dopo l'ablazione. La rigenerazione non è evidente quattro giorni dopo l'ablazione, tuttavia la rigenerazione si è verificata dopo l'ablazione cellulare in situ due. L'ibridazione è stata utilizzata per analizzare i cambiamenti in campioni fissi in singoli punti temporali.

Questo embrione non è stato sottoposto ad ablazione. Al contrario, questo embrione aveva un ampio tratto di epitelio tusale ablato e questo embrione aveva un breve intervallo di epitelio tubulare ablato. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ibridazione in situ hol mount per rispondere a ulteriori domande come l'identità dei cambiamenti di espressione genica durante il corso della rigenerazione del nefrone.

Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso. Durante questa procedura si raccomandano precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale come camice da laboratorio e guanti.