Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

L'obiettivo generale di questa procedura è effettuare una marcatura mirata delle cellule renali nel rene embrionale del pesce zebra, il pronefro, al fine di studiare la rigenerazione dell'epitelio renale in seguito a un danno renale acuto. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante microiniezione di embrioni di pesce zebra con un coniugato fluorescente di destrano. Durante un'incubazione notturna, i coniugati vengono assorbiti selettivamente dalle cellule dei tubuli prossimali del nefrone.

Il giorno successivo, le cellule vengono esaminate mediante microscopia a fluorescenza in epifluorescenza e alcune cellule selezionate vengono ablato utilizzando un sistema laser a impulsi. Successivamente, i cambiamenti morfologici e molecolari vengono valutati mediante istologia, ibridazione in situ su preparati interi e immunohistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'induzione di danno renale acuto mediante l'antibiotico nefrotossico gentamicina, è che tali trattamenti provocano danni catastrofici e sono letali, impedendo così l'analisi degli eventi di rigenerazione renale nel tempo.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo renale, come l'identificazione degli eventi di segnalazione molecolare che si verificano durante la rigenerazione epiteliale. Abbiamo concepito per la prima volta questa tecnica quando abbiamo voluto sviluppare un'analisi dettagliata della rigenerazione epiteliale renale in piastre di Petri. Raccogliere embrioni di pesce zebra fecondati in soluzione E tre modificata senza blu di metilene.

Coltivare gli embrioni fecondati a 28,5 gradi Celsius fino a quando non raggiungono un'età compresa tra 48 e 55 ore dalla fecondazione, momento in cui il sistema renale dell'embrione ha iniziato a funzionare. Prima di iniziare le iniezioni, preparare un albero per iniezioni aros utilizzando uno stampo con depressioni triangolari per trattenere gli embrioni. Successivamente, preparare aghi per microiniezione standard e una soluzione di iniezione per etichettare il tubulo prossimale. Iniziare l'esperimento preparando gli embrioni.

Per prima cosa, rimuovere la corion dai tuorli non schiusi utilizzando pinzette fini. Quindi sciacquare i detriti corionici, i detriti dalla capsula di Petri e riempire nuovamente la capsula con 30 millilitri di soluzione E tre modificata. In secondo luogo, anestetizzare le larve con cinque millilitri di trica.

Verificare che le larve siano completamente anestetizzate controllando la risposta al tocco. Se non sono completamente anestetizzate, si contrarranno durante l'iniezione. In terzo luogo, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, posizionare le larve nello stampo.

Posizionare gli animali con la testa nella parte più profonda della depressione e il tronco lungo il lato del pozzetto. Procedere quindi con microiniezioni intramuscolari caricando un ago preparato con due-tre microlitri di dextrano fluorosceinico, posizionare l'ago e iniettare circa un nanolitro di soluzione in un segmento del tronco di ciascun animale. I coniugati della dextrano vengono facilmente endocitati dal tubulo prossimale del nefrone, consentendo l'etichettatura preferenziale di questa popolazione di cellule epiteliali.

Puntare alla porzione superiore del somite ed evitare l'estensione del sacco vitellino, altrimenti i tubuli nefronici risulteranno danneggiati, come nell'esemplare iniettato in modo errato mostrato qui. Dopo l'iniezione, trasferire le larve in una capsula di Petri pulita e lavarle tre volte con mezzo E tre fresco per rimuovere ogni traccia di trica. Coprire quindi il coperchio con della stagnola e incubare gli animali tutta la notte a 28 gradi Celsius.

Prima di iniziare questa procedura, preparare il mezzo di immobilizzazione e conservare alcune aliquote per un uso immediato a temperatura ambiente, mantenendo le aliquote rimanenti a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Iniziare anestetizzando le larve di pesce zebra con cinque millilitri di trica in 30 millilitri di E tre. Come in precedenza, accertarsi che i pesci non rispondano alla stimolazione tattile.

Ora esaminare gli animali iniettati in fluorescenza per selezionare larve con tubuli prossimali facilmente visibili. Trasferire fino a 12 larve in una nuova piastra contenente la stessa concentrazione di trica su un microscopio fluorescente dotato di filtro fitzy, illuminazione in campo chiaro e un laser perform. L'ablazione inizia trasferendo e anestetizzando le larve in una piastra contenente mezzo di immobilizzazione.

Attendere due minuti, quindi trasferire la larva su un vetrino con cavità contenente una goccia di mezzo di immobilizzazione. Posizionare delicatamente l'animale con il lato dorsale verso l'alto utilizzando una sonda fine e mettere a fuoco il lato dorsale. A questo punto, utilizzando un sistema laser micro-puntiforme pulsato calibrato, ablare uno dei nefroni lasciando l'altro intatto come controllo.

Si osserverà la dispersione della fluorescenza quando le cellule epiteliali renali vengono ablata. Quindi trasferire delicatamente l'animale in una pozzetta di una piastra a 12 pozzette e risciacquarlo tre volte in mezzo E three per rimuovere la metilcellulosa. Continuare ad ablare i nefroni finché la prima piastra a 12 pozzette non sarà piena.

Quindi anestetizzare altri 12 animali e ripetere il processo. è stato iniettato Dextra Fitzy per etichettare in modo preferenziale il tubulo contorto prossimale. A tre giorni dalla fecondazione, il nefrone di ciascun animale è stato ablato con il laser.

Un giorno dopo l'ablazione. La rigenerazione non è evidente quattro giorni dopo l'ablazione, tuttavia la rigenerazione è avvenuta dopo l'ablazione cellulare *in situ* due. È stata utilizzata l'ibridazione per analizzare i cambiamenti in campioni fissati in singoli punti temporali.

Questo embrione non è stato sottoposto ad ablazione. Al contrario, in questo embrione è stata ablata una lunga porzione dell'epitelio tubulare, mentre in quest'altro è stata ablata una breve porzione dell'epitelio tubulare. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'ibridazione in situ su preparati interi, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sull'identità delle variazioni nell'espressione genica durante il processo di rigenerazione del nefrone.

Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso. Si raccomandano precauzioni, come indossare dispositivi di protezione individuale quali camice da laboratorio e guanti, durante questa procedura.