Name: Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Scopri il metodo di esplanto tumorale per testare l'efficacia dei farmaci sui gliomi maligni utilizzando campioni chirurgici freschi. Questa tecnica preserva il microambiente tumorale, migliorando la rilevanza clinica dei risultati per lo sviluppo di nuovi trattamenti antitumorali.

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L&#39;American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / L&#39;American Association tumore al cervello, e la famiglia Khan Foundation per I Nakano.

1. Preparazione dei terreni <ol><li> Il supporto è stato preparato utilizzando il 10% FBS (16140-071 - GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), liquido 1:1 (10565-042 - Invitrogen) con la soluzione Agar 0,6% depurata, granulato (1.01614.1000-EMD ). Condizioni sterili sono stati mantenuti tutto l'esperimento. </li><li> Per la preparazione di 5 ml media di FBS (16140-071 - GIBCO) è stato aggiunto a 45ml di DMEM/F-12 (1X), liquido 1:1 (10565-042 - Invitrogen) rendendo volume finale di 50 mL. I media preparato è stato tenuto a bagnomaria a 37 ° C di temperatura. </li><li> La soluzione di agar è stato redatto utilizzando il metodo di calore a microonde. 0,3 grammi di agar granulato è stato dissolto in 50mL di acqua distillata usando microonde. La soluzione è stata raffreddare agar a 37 ° C di temperatura, mantenendo in bagno d'acqua. </li><li> Abbiamo usato uguale volume di mezzi di comunicazione a partire dal punto 1.2 e 1.3 e la soluzione madre preparata. Il rapporto del 0,6% agar (0,5 ml) e 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 ml) è stato 1:1, rendendo il volume totale di 1 ml in ciascun pozzetto di 6 piastre. </li></ol> 2. Lavorazione dei tessuti <ol><li> Glioblastoma Multiforme (GBM) tessuti sono stati ricevuti immediatamente dopo l'intervento del Dipartimento di Patologia. Il tessuto è stato classificato come GBM dal Dipartimento di Patologia. </li><li> Il tessuto è stato trasferito al patri-plate con pinze con cura e lavati con ghiacciata 1XPBS 5 ml per 3 volte. </li><li> Sezioni seriali dei campioni sono stati tagliati dai campioni sezionato per creare blocchi di tumore (circa 10 mm di diametro) con una lama chirurgica (Feather-2976 # 10) e pinza (Fisher Scientific). </li><li> I blocchi sono stati trasferiti in un piatto ben 6. Ogni pozzo è stato contenente 1 ml di media menzione al punto 1.4. Il tessuto era abbastanza esposizione all'aria per mantenere i tessuti vitali. </li><li> Sezioni tumorali sono state iniettate sia con DMSO (5%) o TMZ (2,5 nM) e incubate per 16 ore a 37 ° C in aria umidificata contenente il 5% di CO2. 0,1 ml di DMSO (5%) o TMZ è stato iniettato 3 volte in blocchi di tumore in diversi luoghi per il trattamento coerente. Il farmaco è stato iniettato con siringa per insulina da 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort punto-26027). </li><li> Dopo 16 ore i blocchi sono stati lavati con 5 1XPBS ml per 3 volte. Dopo aver lavato i blocchi sono stati fissati con 10 ml di 10% v / v formalina per 24 ore (Ricca azienda chimica) in 50 mL (Basix-5539802) e trattati per paraffina 4 _m sezioni. </li><li> La sezione formalina fisso è stato posto in coppa sul piatto mescolate con "NO HEAT" ed elaborate attraverso le seguenti soluzioni per 30 minuti in ogni soluzione. 30% etanolo, 50% etanolo, 75% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo e xilene. </li><li> Il tessuto è stato cancellato su carta assorbente e posto in paraffina fusa (58 a 60 ° C, Fisher paraffina Paraplast) per 30 minuti. </li><li> Il tessuto è stato incorporato in stampi usando Surgipath paraffina Blue Ribbon, il tessuto incapsulato è stato raffreddato a temperatura ambiente. </li><li> Paraffina sezioni di tessuto incluso 4 _m sono stati prelevati e posti su Fisher diapositive Plus. </li></ol> 3. Immunoistochimica L'immunoistochimica è stata effettuata come descritto in precedenza 1. <ol><li> Deparaffinizzazione e Place reidratazione i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi. Xilene per 3x5 minuti (3 volte per 5 minuti), 100% di etanolo per i minuti 3x5, etanolo al 95% per i minuti 1x5, etanolo al 70% per i minuti 1x5, sciacquare in acqua corrente per 3 minuti. </li><li> Recupero dell'antigene con calore indotto epitopo recupero Immergere i vetrini in tampone citrato 1X (Thermo scientifico-AP9003-500) diluita in acqua distillata in un bicchiere di vetro. Fate bollire per 15 minuti su una piastra riscaldante (assicurarsi sezioni don "t cadere la diapositiva). Raffreddare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini con PBS 1X per 3x5 minuti. </li><li> L'inibizione di perossido interno Immergere i vetrini in metanolo (Fisher Scientific-A-452-4) con perossido di idrogeno 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluito in acqua distillata) in un bicchiere di vetro per 15 minuti. Sciacquare in PBS 1X per 3x5 minuti. </li><li> Blocco Coprire i tessuti con il 10% di siero normale di capra. Trasferire i vetrini in una scatola umida per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini con PBS 1X per 3x5 minuti. </li><li> Sezioni anticorpo primario sono state incubate overnight a 4 ° C con l'anticorpo primario a concentrazioni seguenti: umane specifiche caspasi-3 (1:1000, sistemi di R &amp; S, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluito con PBS 1X. Sciacquare i vetrini in PBS 1X minuti 3x10 il giorno successivo. </li><li> Reazione anticorpo secondario Coprire i tessuti con 2-3 gocce di anticorpo secondario marcato con HRP (immaginare sistemi). Mettere le diapositive di una scatola umida per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS 1X per 3x10 minuti. </li><li> Sviluppare il rilevamento per il cromogeno DAB kit (Vector laboratori-SK-4100) per l'individuazione di anticorpi primario in seguito al protocollo del produttore. </li><li> Colorazione contatore Immergere i vetrini con ematossilina (10-15 s econdi, assicurarsi don "t superamento del segnale DAB). Risciacquare con acqua corrente per 3 minuti. </li><li> Immergere disidratazione le diapositive nel seguente ordine, etanolo al 70% per 5 minuti, etanolo al 95% per 5 minuti, 100% di etanolo per i minuti 3x5, xilene per 3x5 minuti. </li><li> Coprire scivolare i vetrini con permount reagente di montaggio (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Le immagini sono state scattate con microscopio a fluorescenza Olympus (DP-72) .3.11). In tutti gli esperimenti, specifiche di etichettatura è stata confermata dal controllo negativo senza anticorpo primario. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Abbiamo raccolto campioni chirurgici di glioblastoma multiforme (GBM). I pazienti sono stati sottoposti il ​​primo intervento senza precedenti chemioterapie compresi temozolomide (TMZ). Il T1 pesate immagine di risonanza magnetica con gadolinio miglioramento nella figura-1a ha dimostrato un tumore rafforzata nel lobo frontale destro prima dell'intervento chirurgico. L'immagine postoperatoria (figura 1b) ha confermato la rimozione subtotale della lesione dopo l'intervento. I tessuti chirurgici sono stati inviati al Dipartimento di Patologia a scopo diagnosi clinica, e gli esemplari rimasti sono stati elaborati per il prelievo del tessuto sotto il Consiglio ha approvato Institutional Review (IRB) protocollo presso la Ohio State University Medical Center. Ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione dimostrato la presenza di necrosi, le cellule pseudopallisading, e la proliferazione microvascolare (Figura 1-c). Così, questi tumori sono stati diagnosticati come istopatologicamente GBM. Di nota, gli espianti tumorali dopo l'incubazione senza TMZ fino a 48 ore mantenuto la citoarchitettura di GBM. Al contrario, con incubazione per 72 ore o più, abbiamo notato l'aumento del numero di nuclei condensato nei campioni, suggerendo alcune delle cellule tumorali iniziano a apoptosi. Come risultato, i tessuti tumorali dopo incubazione più contenute le regioni macchia di leopardo che ha perso le cellule tumorali, che sono stati osservati e preferenzialmente in prossimità delle aree necrotiche (dati non riportati). Al fine di indagare se questi campioni espianto tumore può attendibilmente essere utilizzati a scopo di test di droga efficacia, abbiamo testato l'effetto del trattamento TMZ. Figura-2 rappresenta il flusso degli esperimenti in questo studio. Uno studio recente ha indicato che l'iniezione intratumorale di TMZ ha un effetto più potente sul controllo della crescita del glioma maligno di quella della somministrazione sistemica di questo farmaco 2. Dopo l'incubazione per 16 ore, questi espianti sono stati integrati con paraffina e le sezioni di serie sono state preparate per la colorazione. Immunoistochimica di TMZ trattati con tessuti GBM dimostrato una riduzione sostanziale di Ki-67-positive cellule tumorali rispetto ai campioni di controllo. A sua volta, immunoistochimica con un marker apoptosi, caspasi-3, non ha dato alcuna differenza significativa tra i campioni trattati con TMZ glioma e campioni di controllo (figura-3). Effetti del trattamento con TMZ è stata ulteriormente caratterizzata dalla combinazione di questo saggio espianto insieme sia in coltura in vitro o di citometria a flusso. In particolare, abbiamo cercato di determinare l'effetto sulla cellule staminali come le cellule tumorali (SCLTC). Pertanto, a seguito del trattamento intratumorale con TMZ, abbiamo effettuato test sfera formazione e citometria a flusso di questi espianti tumorali. Il TMZ campioni sono stati trattati con dissociate in singole celle singole e le singole cellule sono state seminate a bassa densità (1 cellule per microlitro o inferiore) in piastre da 96 pozzetti in mezzo privo di siero integrato con bFGF e FEG. Nel gruppo di controllo, la formazione di sfere tumore dal espianti tumore è stata osservata dopo 7 giorni di incubazione. Dato che la formazione sfera è una proprietà di SCLTC 3 4, alterazioni nel numero di sfere del tumore da un trattamento farmacologico indica l'effetto sulla SCLTC. Allo stesso modo, citometria a flusso degli espianti tumore dissociato con un pennarello superficie cellulare, CD133, è stato effettuato per verificare l'effetto sulla SCLTC. Se SCLTC nelle cellule tumorali eterogenei in GBM sono selettivamente sradicato da un trattamento farmacologico, si potrebbe prevedere che la citometria a flusso dovrebbe rilevare diminuzione della CD133-positivi frazione di trattamento (dati non riportati). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figure.1 immagini di risonanza magnetica (MRI) di un paziente GBM. Personaggi rappresentante di pre-operazione Figura-1a e post-operazione Figura-1b. Figura 1c è colorazione H &amp; E di nuovo campione del tessuto GBM. Ingrandimento originale, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura. 2 Il flusso sperimentale dell'esperimento blocco della cultura. Figura-2a. Immagine di fresco GBM chirurgico ricevuto dal dipartimento di patologia. Figura 2b mostra Dissezione del blocco del tumore in 10 millimetri piccoli pezzi con la lama aiuto chirurgico. Figura-2c è la (TMZ) il trattamento farmacologico di sezioni tumorali con siringa da insulina. e 3 "/&gt; Figura. 3 Immunoistochimica. Immunoistochimica di blocchi di tessuto GBM iniettato con DMSO o TMZ con attivato Caspasi-3 e Ki67. Ematossilina è stato utilizzato per la colorazione nucleare. Ingrandimento originale, 40X.

<ol><li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li>
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<li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors%2C+including+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

C&#39;è un divario tra l&#39;efficacia della droga nelle attuali modelli sperimentali pre-clinici e l&#39;efficacia nei pazienti. Più in particolare, nel campo della ricerca tumore cerebrale, nuovi metodi e affidabili, sono necessari aiuterebbe colmare il divario esistente tra la valutazione della droga con i metodi attuali e l&#39;efficacia nei pazienti. Il dosaggio descritti in questo studio è un ulteriore vantaggio, se non una soluzione, per facilitare il riempimento della discrepanza dei dati sperimentali e l&#39;esito dei pazienti affetti. Colture cellulari in vitro preferenzialmente espandere alcuni tipi di cellule tumorali indipendentemente dalle condizioni di coltura, e rappresentano solo una sottopopolazione di l&#39;intero tumore. 5 Inoltre, la trasformazione genetica e fenotipica della cellula artificiale espansione si verifica ed è inevitabile, con il lungo termine colture cellulari . Uno degli ostacoli principali per il trattamento di glioma maligno è l&#39;eterogeneità delle cellule tumorali, sia all&#39;interno di un singolo tumore e tra i campioni tumorali 6, 7. Pertanto, l&#39;arricchimento selettivo di una certa popolazione di cellule tumorali, a prescindere di un tipo o un altro, non può essere un mezzo appropriato per determinare l&#39;efficacia di eventuali agenti chemioterapici sulle cellule tumorali eterogenei. 8 9 Tutti i modelli animali di tumori al cervello derivato da una sottopopolazione di cellule tumorali capannone luci efficacia del farmaco su una sottopopolazione, ma non l&#39;intero tumore. Diverse limitazioni, d&#39;altra parte, restano ancora in questo metodo dell&#39;espianto tumore. Una tale limitazione è il periodo relativamente breve di trattamento. Dal momento che le cellule tumorali maligne sono considerati di acquisire resistenza alla maggior parte, se non tutte, le terapie nel tempo, controllo iniziale di breve termine la crescita delle cellule del tumore non può essere riflessa dalla prognosi a lungo termine dei pazienti, come è stato recentemente segnalato con un anti- antiangiogenico, bevacizumab 10. Così, il miglioramento del protocollo per questo dosaggio espianto di conservare i tessuti per un periodo più lungo è richiesto con ulteriori indagini. Un&#39;altra questione è uno specifico effetto di un farmaco testato su SCLTC nel tumore. Dato che SCLTC sono relativamente resistenti alle terapie correnti per glioma maligno, identificazione di nuovi farmaci anti-cancro che potentemente sradicare SCLTC è garantito. A questo proposito, che attualmente cerca di combinare questo test con la conseguente espianto in esperimenti in vitro, come neurosfere test di formatura (dati non riportati). Ci aspettiamo di saperne di più circa gli effetti, se del caso, di un candidato farmaco su SCLTC attraverso questi test combinato. Infine, con piccoli blocchi di campioni tumorali potrebbero non riflettere l&#39;intera popolazione delle cellule tumorali, come è il caso con le linee cellulari tumorali convenzionali o colture primarie da campioni chirurgici. Questi problemi a parte, conservando stroma del tumore, tra cui la nicchia vascolari, è utile per caratterizzare i fattori ambientali per le cellule tumorali. Pertanto, questo test potrebbe avere un potenziale per valutare eventuali strategie terapeutiche in una condizione più fisiologicamente rilevanti. Qui, abbiamo istituito un test per testare l&#39;efficacia dei farmaci con espianti di campioni chirurgici di GBM. Infatti, con i campioni testati chirurgico, abbiamo trovato che l&#39;iniezione diretta di TMZ riduce la proliferazione nei campioni GBM. Questo metodo espianto tessuto è teoricamente applicabile ad altri tumori solidi e fornisce asset per determinare l&#39;efficacia della droga sul tumore di un paziente, che si spera ci aiutano a evitare un altro fallimento negli studi clinici per i tumori.

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, qualificato, inattivato per calore </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Liquid 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-Agar purificata, granulato </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS per la colorazione </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd allan sci </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% w / v formalina Caspasi-3 </td><td> Ricca azienda chimica </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspasi-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Immaginate di sistema anti-topo </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Immaginate di sistema anti-coniglio </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabella 1. Materiali. <table border="1"><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> Greiner-bio uno </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Scatola di Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Sierologici pipetta </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Puntali con filtro </td><td> USA scientifica </td><td></td></tr><tr><td> 500 micron in poliestere Netwell inserire </td><td> Co-star </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD siringa da 10 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Aghi ipodermici mozzo in alluminio. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Tessuto cultura fiasco </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga tubi </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Tubi a parete sottile </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Chirurgico lama in acciaio inox </td><td> Piuma </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Siringa di insulina </td><td> Comfort punto </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50mL piatto tappo a vite tappo del tubo </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Pinza </td><td> Sci Fisher </td><td></td></tr></table> Tabella 2. Apparecchiature.

metodo per novel anti-cancer drug development utilizzando espianti tumore di campioni chirurgici

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Le terapie attuali per glioma maligno hanno solo effetto palliativo. Per lo sviluppo terapeutico, un ostacolo è la discrepanza di efficacia determinate con prove correnti dell&#39;efficacia dei farmaci e l&#39;efficacia sui pazienti. Così, nuovi metodi e affidabile per valutare l&#39;efficacia dei farmaci sono garantiti in fase pre-clinica. Coltura in vitro di tessuti tumorali, tra cui le linee cellulari, ha notevoli alterazioni fenotipiche, genetiche ed epigenetiche delle cellule di cancro causata da ambiente artificiale delle colture cellulari, che potrebbero non corrispondere la biologia dei tumori in situ originale. Modelli di xenotrapianto con i topi immunodeficienti inoltre hanno dei limiti, cioè, la mancanza del sistema immunitario e interspecie discrepanze genetiche ed epigenetiche nel microambiente. Qui, dimostrare un nuovo metodo utilizzando i campioni chirurgici di glioma maligno come blocchi del tumore non dissociato per valutare gli effetti del trattamento. Per convalidare questo metodo, i dati con l&#39;attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide (TMZ), sono descritti. Abbiamo usato il fresco campione chirurgico di rimozione glioma maligno per i nostri esperimenti. Abbiamo eseguito l&#39;iniezione intratumorale di TMZ o candidati di altre droghe, seguita da incubazione e analisi su campioni chirurgici. Qui, abbiamo cercato di stabilire un tumore metodo espianto di tessuto come una piattaforma per determinare l&#39;efficacia di nuovi agenti anti-cancro della terapia allo scopo che noi possiamo essere in grado di superare, almeno, alcuni dei limiti attuali e colmare il divario esistente tra la sperimentazione current dati e l&#39;efficacia sul tumore di un paziente effettivo. Questo metodo può avere il potenziale per accelerare identificare nuovi agenti chemioterapici per la cura dei tumori solidi.

Qui, abbiamo stabilito un metodo per verificare l&#39;efficacia della droga con campioni chirurgici di tumori al cervello, chiamata &quot;metodo dell&#39;espianto del tumore&quot;. Con questo metodo, siamo in grado di valutare l&#39;efficacia del farmaco senza rompere il microambiente dei tumori solidi. Per convalidare l&#39;affidabilità di questo metodo, si descrivono i dati rappresentativi con i nostri campioni di glioma trattati con l&#39;attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide.

Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici

Le terapie attuali per il glioma maligno hanno solo un effetto palliativo. Per lo sviluppo terapeutico, un ostacolo è la discrepanza di efficacia determinata...

L'obiettivo generale di questo procedimento è quello di stabilire un nuovo metodo per la valutazione dell'efficacia dei farmaci su campioni chirurgici di tumori cerebrali, denominato metodo tumor X explant. Questo viene realizzato innanzitutto ottenendo campioni chirurgici appena rimossi di gliomi maligni durante l'intervento chirurgico, da utilizzare per esperimenti preclinici. Successivamente, i campioni vengono trasportati presso il centro di approvvigionamento tessutale per essere suddivisi a fini diagnostici clinici e di ricerca.Successivamente, nel laboratorio di ricerca, gli espianti tumorali vengono dissezionati in tessuti più piccoli e trasferiti in un mezzo ottimizzato. Infine, vengono effettuate iniezioni intratumorali con candidati farmaci e gli espianti vengono incubati per 16 ore. In definitiva, si possono ottenere risultati che rivelano l'efficacia del trattamento mediante colorazione con ematina ed eosina, nonché immunohistochimica con marcatori specifici per tipo cellulare.È inoltre possibile valutare l'efficacia dei farmaci in vitro mediante citometria a flusso e saggi di formazione di neurosfere. La maggior parte degli attuali saggi per l'efficacia farmacologica lascia un divario tra l'efficacia del farmaco nei modelli sperimentali preclinici attuali e l'efficacia nei pazienti ricoverati. In particolare, quando testiamo candidati farmacologici su tumori solidi come i gliomi maligni, non possiamo sottovalutare gli scambi di segnalazione intercellulare e intracellulare.Per evitare di alterare il microambiente dei tumori solidi, abbiamo sviluppato un metodo di coltura anty utilizzando l'espianto tumorale. Dopo il prelievo dei tumori dai pazienti, i campioni vengono trasferiti al Dipartimento di Anatomia Patologica, dove dividiamo i frammenti tumorali in due parti. Un campione tumorale proveniente da una delle due parti viene utilizzato per la sezione congelata e l'inclusione in paraffina ai fini della diagnosi clinica, mentre il restante tessuto tumorale viene inviato ai laboratori di ricerca per essere utilizzato dai ricercatori.Utilizzando questo metodo, possiamo preservare il microambiente del tumore con le cellule endoteliali tumorali adiacenti e le cellule immunitarie, nonché le cellule cerebrali normali che circondano il tumore o migrano nelle cavità tumorali. Prima di processare il tessuto di glioblastoma, preparare la soluzione liquida, il mezzo e la soluzione di agar. Mescolarli in rapporto uno a uno.Quindi aggiungere un millilitro in ciascun pozzetto di piastre a sei pozzetti. Dopo aver ricevuto il tessuto di glioblastoma multiforme fresco, trasferirlo in una piastra di Petri utilizzando pinzette e lavarlo accuratamente tre volte con cinque millilitri di PBS freddo al ghiaccio una volta, usando la lama chirurgica e le pinzette. Tagliare sezioni seriali di circa 10 millimetri di diametro dai campioni dissecati per creare blocchi tumorali, trasferendo ciascun blocco in un pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente mezzo agar, permettendo un'esposizione sufficiente all'aria per mantenerlo vitale.Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro per insulina e un ago da 28 gauge e mezzo pollice, iniettare i blocchi tumorali tre volte con DMSO al 5% o con temozolomide a 2,5 nanomolari o con un nuovo candidato farmaco antitumorale e incubare per 16 ore a 37 gradi Celsius in aria umidificata contenente il 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare i blocchi tre volte con cinque millilitri di PBS una volta. Successivamente, in provette da 50 millilitri, fissare i blocchi con 10 millilitri di formalina al 10% volume per volume per 24 ore.Includere il tessuto in paraffina e tagliare sezioni da quattro micron per deparaffinizzare e reidratare le sezioni. Posizionare i vetrini su un portavetrini e incubarli nelle seguenti soluzioni. Lavare tre volte per cinque minuti ciascuna.Eseguire tre risciacqui con etanolo al 100% per cinque minuti ciascuno. Un risciacquo con etanolo al 95% per cinque minuti e un risciacquo con etanolo al 70% per cinque minuti. Infine, risciacquare con acqua corrente per tre minuti.Per i dettagli sulla recupero dell'antigene e sull'inibizione della perossidasi endogena, consultare il protocollo scritto allegato. Per bloccare le sezioni, coprire i tessuti con siero di capra normale al 10%, trasferire i vetrini in una scatola umida e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per cinque minuti ciascuna. Successivamente, aggiungere gli anticorpi primari, come la caspasi-3 specifica per l'uomo o il KI-67, diluiti in PBS 1x, quindi incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare i vetrini in PBS 1x per 3 volte, 10 minuti ciascuna. Successivamente, coprire i tessuti con due o tre gocce di anticorpo secondario marcato con HRP.Posizionare i vetrini in una scatola umida e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS 1x per tre volte, cinque minuti ciascuna. Sviluppare i campioni utilizzando un kit cromogeno DAB seguendo le istruzioni del produttore per la controcolorazione.Immergere i vetrini nell'ematin per 10-15 secondi. Quindi risciacquare con acqua corrente per tre minuti. Disidratare i campioni immergendo i vetrini nelle seguenti soluzioni in un reagente di montaggio e un coprioggetto.Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire le immagini dei vetrini. L'immagine ponderata in T1 con mezzo di contrasto al gadolinio mostrata in questa figura dimostra un tumore di glioblastoma multiforme (GBM) evidenziato nel lobo frontale destro di un paziente prima dell'intervento chirurgico. L'immagine postoperatoria ha confermato la rimozione subtotale della lesione dopo l'intervento.La colorazione con ematossilina ed eosina dimostra la presenza di necrosi, cellule a pseudopalizzata e proliferazione microvascolare. Pertanto, questi tumori sono stati diagnosticati istopatologicamente come GBM al fine di verificare se questi campioni di esplicanti tumorali potessero essere utilizzati in modo affidabile. A scopo di un test di efficacia del farmaco, abbiamo valutato l'effetto del farmaco temozolomide o TMZ; l'immunohistochimica dei tessuti GBM trattati con TMZ mostra una riduzione sostanziale delle cellule tumorali positive per KI 67 rispetto ai campioni di controllo.A sua volta, l'immunoeistochimica con un marcatore di apoptosi, la caspasi tre, non ha evidenziato alcuna differenza significativa tra i campioni di glioma trattati con TMZ e i campioni di controllo. L'effetto del trattamento con temozolomide può essere ulteriormente caratterizzato combinando questo saggio ex explan con colture in vitro o con citometria a flusso. Possiamo confrontare questo metodo ex explan con il trapianto di xenotrapianto e con il saggio di formazione di sfere in vitro per lo screening di nuovi agenti antitumorali.Una volta ottenuti i tessuti tumorali in laboratorio, la procedura per questo esperimento può essere completata entro un'ora. Questo nuovo saggio è relativamente semplice da eseguire e riproducibile dopo la dissociazione degli impianti tumorali trattati. Possiamo combinarlo con esperimenti in vitro.Un vantaggio fondamentale di questo saggio è che preserva il microambiente tumorale. Otteniamo dati positivi con espanti tumorali trattati con Temodar, che sono coerenti con l'esito dei medesimi pazienti sottoposti a trattamento con Temodar dopo gli interventi chirurgici. Infine, questo approccio è applicabile ad altri tumori solidi e potrebbe quindi avere il potenziale di accelerare l'identificazione di nuovi agenti chemioterapici per il trattamento dei tumori solidi.

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Questo video dimostra una tecnica di localizzazione in immunofluorescenza (IVIL) in vivo per studiare la biodistribuzione di anticorpi mirati al tumore in un modello murino di cancro al seno. Dopo l'iniezione endovenosa di un anticorpo specifico per il tumore nel topo, il tumore viene isolato chirurgicamente e la localizzazione dell'anticorpo all'interno del tessuto tumorale viene confermata tramite immunocolorazione ex vivo.

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