Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici
29 luglio 2011
Qui, abbiamo stabilito un metodo per verificare l'efficacia della droga con campioni chirurgici di tumori al cervello, chiamata "metodo dell'espianto del tumore". Con questo metodo, siamo in grado di valutare l'efficacia del farmaco senza rompere il microambiente dei tumori solidi. Per convalidare l'affidabilità di questo metodo, si descrivono i dati rappresentativi con i nostri campioni di glioma trattati con l'attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide.
L'obiettivo generale di questo procedimento è quello di stabilire un nuovo metodo per la valutazione dell'efficacia dei farmaci su campioni chirurgici di tumori cerebrali, denominato metodo tumor X explant. Questo viene realizzato innanzitutto ottenendo campioni chirurgici appena rimossi di gliomi maligni durante l'intervento chirurgico, da utilizzare per esperimenti preclinici. Successivamente, i campioni vengono trasportati presso il centro di approvvigionamento tessutale per essere suddivisi a fini diagnostici clinici e di ricerca.
Successivamente, nel laboratorio di ricerca, gli espianti tumorali vengono dissezionati in tessuti più piccoli e trasferiti in un mezzo ottimizzato. Infine, vengono effettuate iniezioni intratumorali con candidati farmaci e gli espianti vengono incubati per 16 ore. In definitiva, si possono ottenere risultati che rivelano l'efficacia del trattamento mediante colorazione con ematina ed eosina, nonché immunohistochimica con marcatori specifici per tipo cellulare.
È inoltre possibile valutare l'efficacia dei farmaci in vitro mediante citometria a flusso e saggi di formazione di neurosfere. La maggior parte degli attuali saggi per l'efficacia farmacologica lascia un divario tra l'efficacia del farmaco nei modelli sperimentali preclinici attuali e l'efficacia nei pazienti ricoverati. In particolare, quando testiamo candidati farmacologici su tumori solidi come i gliomi maligni, non possiamo sottovalutare gli scambi di segnalazione intercellulare e intracellulare.
Per evitare di alterare il microambiente dei tumori solidi, abbiamo sviluppato un metodo di coltura anty utilizzando l'espianto tumorale. Dopo il prelievo dei tumori dai pazienti, i campioni vengono trasferiti al Dipartimento di Anatomia Patologica, dove dividiamo i frammenti tumorali in due parti. Un campione tumorale proveniente da una delle due parti viene utilizzato per la sezione congelata e l'inclusione in paraffina ai fini della diagnosi clinica, mentre il restante tessuto tumorale viene inviato ai laboratori di ricerca per essere utilizzato dai ricercatori.
Utilizzando questo metodo, possiamo preservare il microambiente del tumore con le cellule endoteliali tumorali adiacenti e le cellule immunitarie, nonché le cellule cerebrali normali che circondano il tumore o migrano nelle cavità tumorali. Prima di processare il tessuto di glioblastoma, preparare la soluzione liquida, il mezzo e la soluzione di agar. Mescolarli in rapporto uno a uno.
Quindi aggiungere un millilitro in ciascun pozzetto di piastre a sei pozzetti. Dopo aver ricevuto il tessuto di glioblastoma multiforme fresco, trasferirlo in una piastra di Petri utilizzando pinzette e lavarlo accuratamente tre volte con cinque millilitri di PBS freddo al ghiaccio una volta, usando la lama chirurgica e le pinzette. Tagliare sezioni seriali di circa 10 millimetri di diametro dai campioni dissecati per creare blocchi tumorali, trasferendo ciascun blocco in un pozzetto della piastra a sei pozzetti contenente mezzo agar, permettendo un'esposizione sufficiente all'aria per mantenerlo vitale.
Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro per insulina e un ago da 28 gauge e mezzo pollice, iniettare i blocchi tumorali tre volte con DMSO al 5% o con temozolomide a 2,5 nanomolari o con un nuovo candidato farmaco antitumorale e incubare per 16 ore a 37 gradi Celsius in aria umidificata contenente il 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare i blocchi tre volte con cinque millilitri di PBS una volta. Successivamente, in provette da 50 millilitri, fissare i blocchi con 10 millilitri di formalina al 10% volume per volume per 24 ore.
Includere il tessuto in paraffina e tagliare sezioni da quattro micron per deparaffinizzare e reidratare le sezioni. Posizionare i vetrini su un portavetrini e incubarli nelle seguenti soluzioni. Lavare tre volte per cinque minuti ciascuna.
Eseguire tre risciacqui con etanolo al 100% per cinque minuti ciascuno. Un risciacquo con etanolo al 95% per cinque minuti e un risciacquo con etanolo al 70% per cinque minuti. Infine, risciacquare con acqua corrente per tre minuti.
Per i dettagli sulla recupero dell'antigene e sull'inibizione della perossidasi endogena, consultare il protocollo scritto allegato. Per bloccare le sezioni, coprire i tessuti con siero di capra normale al 10%, trasferire i vetrini in una scatola umida e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per cinque minuti ciascuna.
Successivamente, aggiungere gli anticorpi primari, come la caspasi-3 specifica per l'uomo o il KI-67, diluiti in PBS 1x, quindi incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare i vetrini in PBS 1x per 3 volte, 10 minuti ciascuna. Successivamente, coprire i tessuti con due o tre gocce di anticorpo secondario marcato con HRP.
Posizionare i vetrini in una scatola umida e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS 1x per tre volte, cinque minuti ciascuna. Sviluppare i campioni utilizzando un kit cromogeno DAB seguendo le istruzioni del produttore per la controcolorazione.
Immergere i vetrini nell'ematin per 10-15 secondi. Quindi risciacquare con acqua corrente per tre minuti. Disidratare i campioni immergendo i vetrini nelle seguenti soluzioni in un reagente di montaggio e un coprioggetto.
Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire le immagini dei vetrini. L'immagine ponderata in T1 con mezzo di contrasto al gadolinio mostrata in questa figura dimostra un tumore di glioblastoma multiforme (GBM) evidenziato nel lobo frontale destro di un paziente prima dell'intervento chirurgico. L'immagine postoperatoria ha confermato la rimozione subtotale della lesione dopo l'intervento.
La colorazione con ematossilina ed eosina dimostra la presenza di necrosi, cellule a pseudopalizzata e proliferazione microvascolare. Pertanto, questi tumori sono stati diagnosticati istopatologicamente come GBM al fine di verificare se questi campioni di esplicanti tumorali potessero essere utilizzati in modo affidabile. A scopo di un test di efficacia del farmaco, abbiamo valutato l'effetto del farmaco temozolomide o TMZ; l'immunohistochimica dei tessuti GBM trattati con TMZ mostra una riduzione sostanziale delle cellule tumorali positive per KI 67 rispetto ai campioni di controllo.
A sua volta, l'immunoeistochimica con un marcatore di apoptosi, la caspasi tre, non ha evidenziato alcuna differenza significativa tra i campioni di glioma trattati con TMZ e i campioni di controllo. L'effetto del trattamento con temozolomide può essere ulteriormente caratterizzato combinando questo saggio ex explan con colture in vitro o con citometria a flusso. Possiamo confrontare questo metodo ex explan con il trapianto di xenotrapianto e con il saggio di formazione di sfere in vitro per lo screening di nuovi agenti antitumorali.
Una volta ottenuti i tessuti tumorali in laboratorio, la procedura per questo esperimento può essere completata entro un'ora. Questo nuovo saggio è relativamente semplice da eseguire e riproducibile dopo la dissociazione degli impianti tumorali trattati. Possiamo combinarlo con esperimenti in vitro.
Un vantaggio fondamentale di questo saggio è che preserva il microambiente tumorale. Otteniamo dati positivi con espanti tumorali trattati con Temodar, che sono coerenti con l'esito dei medesimi pazienti sottoposti a trattamento con Temodar dopo gli interventi chirurgici. Infine, questo approccio è applicabile ad altri tumori solidi e potrebbe quindi avere il potenziale di accelerare l'identificazione di nuovi agenti chemioterapici per il trattamento dei tumori solidi.
Panoramica
Questo studio stabilisce un nuovo metodo per il test dell'efficacia dei farmaci mediante campioni chirurgici di tumori cerebrali, denominato metodo dell'espianto tumorale. Questo approccio consente di valutare l'efficacia del farmaco preservando il microambiente tumorale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoologia
- Farmacologia
Sfondo
- Gli attuali saggi di efficacia dei farmaci spesso non riescono a colmare il divario tra modelli preclinici e risultati nei pazienti.
- I tumori solidi, come i gliomi maligni, richiedono un'attenta considerazione del segnale intercellulare.
- Il mantenimento dell'ambiente microtumorale è cruciale per testare accuratamente i farmaci.
- Il metodo di espianto tumorale preserva le cellule tumorali adiacenti e le cellule normali del cervello.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per testare l'efficacia dei farmaci sui tumori cerebrali.
- Convalidare il metodo di espianto tumorale utilizzando campioni di glioma trattati con temozolomide.
- Valutare l'impatto dei trattamenti farmacologici mantenendo intatto il microambiente del tumore.
Metodi Utilizzati
- Specimeni chirurgici freschi di gliomi maligni sono stati prelevati durante l'intervento chirurgico.
- Gli espianti tumorali sono stati dissezionati e incubati con i candidati farmacologici.
- L'efficacia del farmaco è stata valutata mediante immunohistochimica e citometria a flusso.
- È stata eseguita un'analisi istopatologica per valutare gli effetti del trattamento.
Risultati principali
- L'immunohistochimica ha mostrato una riduzione delle cellule tumorali positive per Ki-67 dopo il trattamento con temozolomide.
- Non è stata osservata alcuna differenza significativa nei marcatori dell'apoptosi tra i campioni trattati e quelli di controllo.
- Il metodo di espianto tumorale ha dimostrato un potenziale per test affidabili dell'efficacia dei farmaci.
- I risultati possono essere confrontati con altri modelli preclinici per una ulteriore validazione.
Conclusioni
- Il metodo dell'espianto tumorale è un approccio promettente per la valutazione dell'efficacia dei farmaci nei gliomi.
- Questo metodo preserva il microambiente tumorale, aumentando la rilevanza dei risultati.
- Sono necessari ulteriori studi per ottimizzare e validare questo approccio per applicazioni cliniche.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli preclinici attuali per il glioma maligno spesso non riescono a prevedere l'efficacia clinica dei farmaci a causa della perdita dell'ambiente microtumorale in vitro e delle discrepanze interspecifiche negli xenotrapianti. Il metodo dell'espianto tumorale colma questa lacuna preservando le interazioni native tra tumore e stroma, consentendo valutazioni della risposta ai farmaci più fisiologicamente rilevanti. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica e migliora la fiducia predittiva nella scoperta precoce di farmaci in oncologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mantenendo gli scambi di segnalazione intercellulare e intracellulare all'interno del microambiente tumorale nativo.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli utilizzando campioni chirurgici appena resecati, evitando artefatti da dissociazione.
- Valore predittivo: Fornisce letture precoci dell'efficacia che si correlano con gli esiti nei pazienti, come dimostrato da espianti trattati con TMZ che mostrano una ridotta proliferazione di Ki-67, in linea con le risposte cliniche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi di tipo istopatologico e immunohistochimico (ad esempio, Ki-67, caspasi-3) per lo screening di composti in un sistema rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei tessuti e la somministrazione del farmaco mediante iniezione intratumorale, migliorando la riproducibilità tra diversi lotti di tessuti espiantati.
- Scalabilità: Compatibile con la citometria a flusso e con i saggi di neurosfera, consentendo letture multiparametriche per campagne di identificazione di composti promettenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica utilizzando campioni tumorali derivati da pazienti reali, aumentando la rilevanza per le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo.
- De-risking meccanicistico: Permette la valutazione degli effetti del farmaco sui marcatori di proliferazione e apoptosi all'interno dell'architettura tissutale integra, riducendo i falsi positivi derivanti da modelli semplificati.
- Conferma predittiva: Consente il confronto diretto con modelli di xenotrapianto e modelli in vitro per triangolare l'effettiva attività del farmaco.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo dell'espianto tumorale si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, sostenendo la verifica delle ipotesi e l'identificazione dei composti promettenti prima dei modelli preclinici, che richiedono maggiori risorse.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi e la validazione degli obiettivi preservando le interazioni stromali-epiteliali fondamentali per la biologia del glioma.
- Screening: Fornisce letture quantitative basate sull'istologia che consentono una valutazione affidabile dei composti in un contesto tissutale tridimensionale.
- Analisi: Offre output multiplex (proliferazione, apoptosi, infiltrazione immunitaria) mediante immunohistochimica e citometria a flusso per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Utilizza campioni provenienti da pazienti per mantenere la rilevanza della malattia, supportando l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di farmaci contro i tumori solidi, adattabile a diversi candidati terapeutici e istituzioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica mantenendo il microambiente tumorale, migliorando la fiducia nel bersaglio e la validità predittiva.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di preparazione degli espianti e di incubazione con farmaci.
- Valore strategico: Permette decisioni più informate su prosecuzione o abbandono dello sviluppo riducendo la discordanza tra efficacia preclinica e clinica, abbassando il rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei candidati antitumorali basata sulle risposte dei tessuti umani, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione di campioni neurochirurgici, nella colorazione istopatologica e nell'immunohistochimica.
- È subordinato all'accesso a campioni chirurgici freschi e alla collaborazione coordinata con i reparti di anatomia patologica per il reperimento dei tessuti.
- Necessita di una preparazione standardizzata del mezzo, di tecniche di iniezione intratumorale e di condizioni di incubazione controllate (37°C, 5% CO2).
- Richiede un'ottimizzazione per diversi tipi di tumore; è necessaria una validazione per i tumori solidi non gliali al fine di garantire la conservazione del microambiente.
- È limitato dalla finestra di vitalità del tessuto post-resezione, che richiede una lavorazione rapida per mantenere l'integrità degli espianti.
