In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

Un metodo per l'incorporazione di DNA plasmidico in cellule murine della retina allo scopo di effettuare sia guadagno o la perdita di studi di funzione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire un esperimento di elettroporazione in vivo su topi neonati al fine di introdurre stabilmente materiale genetico nelle cellule della retina. Ciò si ottiene con la prima anestesia, un topo neonatale che salta sul ghiaccio per circa 5-10 minuti. Il secondo passo della procedura consiste nell'identificare la giunzione delle palpebre fuse e nell'aprire l'occhio tagliando lungo questa giunzione.

Viene quindi praticata un'incisione nell'occhio per facilitare l'inserimento della siringa per microiniezione. La siringa per microiniezione viene quindi inserita attraverso l'incisione e la soluzione di DNA iniettata nello spazio sottoretinico. Infine, un elettrodo a pinzetta viene posizionato sulla testa del pop e vengono erogati una serie di impulsi elettrici.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasduzione retrovirale, è che l'elettroporazione in vivo non richiede la generazione e la manipolazione di agenti biologici come strumenti per la consegna genica. Di conseguenza, la tecnica richiede meno manodopera, meno reagenti e può essere eseguita in qualsiasi stazione di lavoro approvata per le procedure sugli animali. In generale, gli individui che non conoscono la tecnica avranno difficoltà perché ci vuole tempo e ripetizione per sviluppare una sensazione per il posizionamento della siringa di microiniezione nello spazio sottoretinico.

A dimostrare la procedura sarà Jimmy DeMilo, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Poiché la concentrazione di DNA richiesta per l'elettroporazione è relativamente alta, il DNA plasmidico desiderato viene prima amplificato su cellule incompetenti estratte utilizzando un maxi prep, quindi purificato e concentrato a circa cinque microgrammi per microlitro. Il colorante FCF verde rapido viene aggiunto come tracciante per iniezione.

Una volta preparato il DNA plasmidico, anestetizzare i cuccioli di topo appena nati sul ghiaccio per circa cinque minuti, monitorandoli fino a quando l'incoscienza non viene confermata dalla compressione del piede. Scambiare l'area dell'occhio da iniettare con alcol con profilo isop al 70% e utilizzare un microscopio da dissezione per identificare l'epitelio giunzionale FUS in cui le palpebre si uniscono. Utilizzando un ago affilato calibro 30, aprire con cautela l'occhio tagliando lungo l'epitelio giunzionale fuso senza applicare una pressione eccessiva verso il basso o tagliare oltre la gamma della palpebra.

Una volta aperta la palpebra e esposto l'occhio, utilizzare la punta dell'ago per praticare una piccola incisione nella sclera vicino alla giunzione con la cornea facendo attenzione a non penetrare troppo in profondità e a non perforare la lente. Inserire l'ago per iniezione con estremità smussata nell'incisione. Fino a quando non si avverte la resistenza della parete sclerale opposta, iniettare lentamente 0,3 microlitri della soluzione di DNA viscoso nello spazio sottoretinico.

Facendo attenzione a non premere troppo forte contro la parete sclerale, ruotare l'animale per verificare la diffusione uniforme della soluzione di DNA all'interno della retina. Innanzitutto, immergere l'elettrodo della pinzetta in PBS per massimizzare la conduttività elettrica. Quindi posizionare la testa del cucciolo iniettato tra gli elettrodi con l'occhio iniettato adiacente all'elettrodo del polo positivo e l'occhio non iniettato adiacente all'elettrodo del polo negativo.

Applicare cinque impulsi quadrati utilizzando un generatore di impulsi con ogni impulso di 80 volt e 50 millisecondi di durata con un intervallo di 950 millisecondi tra gli impulsi. Infine, riscalda i cuccioli sotto una lampada riscaldante fino a quando non si riprendono dall'anestesia del ghiaccio. Dopo il recupero, restituisci i cuccioli elettroporati alla madre al terzo giorno postnatale.

La maggior parte delle cellule elettroporate di EGFP si trova nello strato neuroplastico retinico e non dimostra caratteristiche morfologiche distinte di nessuna delle cellule gliali neurali differenziate della retina. Entro il 14° giorno postnatale, le cellule elettroporate possono essere trovate nello strato nucleare esterno e nello strato nucleare interno della retina e nelle varie cellule marcate. Ora mostrano segni morfologici caratteristici dei neuroni differenziati.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante eseguire tutti i passaggi in modo fluido e uniforme. È molto facile danneggiare la retina durante la microiniezione e le pratiche necessarie per sviluppare la destrezza manuale necessaria per evitare danni ai tessuti. Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'immunoistochimica o l'ibridazione in situ, possono essere eseguiti per determinare se l'espressione dei geni di interesse è regolata verso l'alto o verso il basso nelle elettroretine.